11 重组子筛选
14 第十四讲(2) 重组子的筛选和鉴定
2 营养缺陷型检测法
如果目的基因产物能降解某些药物使菌 株呈现抗性标记，或者基因产物与某些药物 作用是显颜色反应，则可根据抗性或颜色直 接筛选含目的基因的克隆子。
亮氨酸(leu)为leu菌所必须 。 在不含leu的基本培养基中，只有重组子 表达的leu才能被leu缺陷菌所利用而能生 长，形成菌落。 因此，能生长的菌落是阳性的重组子克 隆，没有重组子的leu缺陷菌在不含leu的 培养基中不能生长，不能形成菌落。
催化4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸， 产生萦光物质4-甲基伞形花酮，以此筛选 含gus基因的转化子。 尤其是gus基因的3’端与其他结构基因连接 产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融 合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在 转化生物体中的定位分析。
Hale Waihona Puke 萤火虫萦光素酶基因（luc）
luc表达产物萤火虫萦光素酶（LUC）在 Mg2+的作用下，可以与萦光素和ATP底物发 生反应，形成与酶结合的腺苷酸萦光素酰 化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合 物转变成为处于激活状态的氧化萦光素， 可以用萦光测定仪快速灵敏地检测出产生 的萦光，是目前研究动植物转基因很好用 的一种报告基因。
3 依赖于重组子结构特征分析的筛选法
⑴ 快速裂解菌落鉴定分子大小 主要是根据有外源DNA片段插入载体后的 重组DNA与载体DNA之间的大小差异来鉴 定重组子。 分别提取不同转化子的DNA，经琼脂糖凝 胶电泳，在琼脂糖凝胶板上出现的DNA带 中，落后的带是重组DNA的带。 此方法只用于重组子的初步鉴定。
7 插入失活法
基本原理： 是将特定的DNA随机插入到重组DNA分子 中，获得一系列插入重组子，根据其突变 的类型鉴定失活的基因，进一步利用此插 入DNA作为标记物，对失活基因进行定位。
重组子的筛选与鉴定
第三节、转化/重组酵母菌的筛选
营养缺陷互补基因 显性标记基因
一、利用营养缺陷互补基因的筛选方法
原理：受体细胞为某种营养缺陷型突变株，即 不能合成某种营养成分，在缺乏该营养成分的 培养基上不能生长；
携带相应营养成分合成基因的载体转化受体菌 后，使细胞在选择培养基（不含某种相应营养 物质的培养基）中能够生长，而未被转化的细 胞不能生长。
red+gam+噬菌体可在P2噬菌体溶源菌中呈溶原生长， 被定为SPi+ （ sensitive to P2 inhibition，对P2介入敏感） red-gam-噬菌体在P2溶源菌中则呈溶菌生长，定为Spi-。
填充片段内含有red及gam基因的载体如EMBL3和EMBL4
三、杂交筛选
菌落或噬菌斑杂交筛选
二、 重组噬菌体DNA转入大肠杆菌后 重组子的筛选
（一）取代型载体：根据λ基因组的大小筛 选，直接挑取噬菌斑即重组子
机理： 空载体太小而不被包装，不进入细胞； 重组λ-DNA可包装成噬菌体颗粒并感染大 肠杆菌产生噬菌斑； 未感染菌生长成菌落。
（二）插入型载体
空载体及重组载体都可包装，需要插入 失活载体上的标记基因筛选。
1、氨基糖苷类药物磷酸转移酶基因：Neo （neomycin）。
2、博来霉素抗性基因：Zeo（Zeocin）。如 pFLD1载体、
（一）Neo选择系统
Neo基因编码氨基糖苷磷酸转移酶，可 以灭活氨基糖甙类抗生素，是新霉素 （neomycin）、新霉素衍生物G418、 卡那霉素等抗生素的抗药基因。
第一步：正选择。在不进行插入失活抗性基因的相应 抗生素平板上转化子可以生长，非转化子不能生长， 可将转化子直接从平板上挑出来；
重组dna克隆子的筛选及鉴定注意事项
重组dna克隆子的筛选及鉴定注意事项嘿，宝子们！今天咱们来唠唠这个《重组DNA克隆子的筛选及鉴定注意事项》呀。
首先呢，咱得知道啥是重组DNA克隆子哇。
这可是生物技术里超重要的东西呢！在筛选的时候呀，有好多要注意的点呢。
一、筛选方面的注意事项1. 选择合适的筛选标记呀！哎呀呀，这可太关键了呢。
比如说抗生素抗性标记，常见的像氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性等等。
你得确保这个标记是准确有效的哇，不然怎么能筛选出咱们想要的克隆子呢？要是标记弄错了，那可就像大海捞针一样乱套了呀！在选择的时候，一定要根据你的载体和宿主细胞的特性来确定呢，可不能瞎选哦！2. 筛选条件要精确呢。
比如说使用抗生素筛选的时候，抗生素的浓度一定要控制好哇！浓度低了呢，那些没有成功重组的细胞可能也会生长，这就达不到筛选的目的啦；浓度高了呢，可能会把一些好不容易重组成功的细胞也给抑制住了呀，这多可惜呢！所以呀，要通过预实验来确定最佳的抗生素浓度呢，这个步骤可不能偷懒哦！3. 筛选的时间也很重要呢！哇，你可别以为把细胞放在筛选培养基里就不管了。
时间太短，可能那些非重组子还没有完全被抑制住；时间太长呢，可能会导致重组子因为营养缺乏或者其他原因生长受到影响呢。
所以要时刻关注细胞的生长状态，确定合适的筛选时间呀。
二、鉴定方面的注意事项1. 酶切鉴定要小心哦。
在进行酶切鉴定的时候呢，首先要选择合适的限制性内切酶呀。
这就像开锁要用对钥匙一样呢。
要是酶选错了，可能就切不出你想要的条带啦，那怎么能鉴定出正确的克隆子呢？而且呀，酶切反应的体系一定要准确无误呢。
各种成分的量，像酶的量、缓冲液的浓度、DNA的量等等，都要严格按照说明书来操作呢，不然很容易出现酶切不完全或者酶切失败的情况呢！2. PCR鉴定也有不少讲究呢。
引物的设计那可是重中之重呀！哇，引物要是设计得不好，可能就扩增不出咱们想要的片段呢。
要确保引物的特异性，不能跟其他非目标序列结合呢。
还有呀，PCR反应的条件也要不断优化呢。
重组子的筛选与鉴定
产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
2020/7/30
（1）四环素抗性插入失活
当外源DNA限制片段插入pBR322质粒的BamH I和Sal I位点时，抗 四环素基因失活，重组体转化子必定具有Ampr Tets表型。将转化 菌先涂布在含有Ampr的琼脂平板上并将存活的Ampr菌落原位影印 到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Ampr平板上生长，而不在 Tet平板亡生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA限制片段的重 组质粒2020转/7/3化0 子克隆。
2020/7/30
第二节 核酸分子杂交检测法 • 1 原理 • 2 核酸杂交检测方法
2020/7/30
• 利用碱基配对的原理进行分子杂交是核酸分析的重要手 段，也是鉴定基因重组体的常用方法。杂交的双方是待 测的核酸序列和由插入片段基因制备的DNA或RNA探针 。
• 这些方法都是通过一定的物理方法将菌落(噬菌斑)或提 取的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同 液体中的探针进行杂交。菌落(噬菌斑)或DNA从平板或 凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故这些杂交又都称为 印迹(blotting)杂交。
2020/7/30
1、原理： 1.1 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。 1.2 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 1.3 识别标记
-半乳糖苷酶 Xgal
2020/7/30
半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点(MCS)区，本身 虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止 LacZ’的合成。不能互补。
2020/7/30
重组子筛选
37℃培养
外源基因产物检测
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
如果待筛选鉴定的目标蛋白既 不能测定生物活性，又无现成的抗 体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶 电泳进行粗略的筛选
遗传学直接筛选法
抗药性 显色反应 营养缺陷型 噬菌斑形成能力等
此法简便快速，可以在大量群 体中进行筛选。但由于目的基 因插入重组分子的方向，多聚 体假阳性等原因，可靠性较差
酶切载体
蓝色菌落（自连）
白色菌落（重组子）
DNA片段
未转化的受体菌 （AmpS）
连接液 E.coli 感受态细胞
显标记主要区分 重组子 与 非重组子
LB + Amp + X-gal + IPTG 抗药性标记主要区分
转化子 与 非转化子
Amp lzcZ’
自连质粒转化子 （AmpR ， lzcZ’ ）
重组质粒1 重组质粒2 载体对照
克隆DNA序列检测
限制性酶切图谱法
限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图 谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法 不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。
但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验 成本也高。
lacZ△M15
AmpR
lacI lacP ,O lacZ´
NH2–
a-互补
–COOH
lacI lacP ,O lacZ△M15
X-gal → 半乳糖+ 5-溴-4-氯-靛蓝
a-互补（lacZ’ ）筛选原理
带有 lacZ’ 基因的质粒转入宿主菌后，在诱导物 IPTG（异丙基-b-D-
硫代半乳糖苷，isopropylthio-b-D-galactoside）诱导下，lacZ’ 基因合 成半乳糖苷酶 N-端片段，宿主菌染色体上的 lacZ△M15 基因合成半乳 糖苷酶 C-端片段。质粒编码的半乳糖苷酶 N-端片段可与宿主菌编码的 半乳糖苷酶 C-端片段结合，形成有酶学活性的 b-半乳糖苷酶。在呈色 底物 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷，5-bromo-4-chloro-3indolyl-b-D-galactoside）存在时，形成蓝色菌落。
重组子筛选与鉴定
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上 一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时， 其下游的筛选标记基因才能表达。
（4）显色筛选法
常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。
具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过 酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙 基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌 体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段 lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有 x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而 lacZ’得到的转化子是白色菌落。
pBR322 4362bp
ori
克隆位点
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
重组子筛选
三．筛选在转化过程中，并非每个宿主细胞都被转化，即使获得转化的细胞，也并非都含目的基因，可能含有自身形成环状的在体分子，一个载体与两个外源DNA 形成的重组子，或插入的非目的基因与载体形成的重组子等。
因此转化后须在不同层次、不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子，以及鉴定所需的特异性重组子。
（一）根据重组子的遗传学特性筛选（平板筛选）1.抗生素平板筛选克隆载体具有抗生素抗性基因，如：Amp、Ter、Kan等。
外源基因插在抗性基因之外，这个重组子转化入宿主后，宿主就具有了抗生素抗性，因而在含抗生素的培养基中，只有阳性重组子才能生长。
但有些单酶切的情况下，连接时有可能出现反向连接或自身环化，所以还需要进行酶切鉴定。
2．插入失活pBR322含有Tetr及Ampr，插入Tet后变成Tets及Ampr。
3．插入表达如质粒pTR262带有负调控Tetr基因的cI基因，cI基因表达产物可抑制Tetr 表达。
当目的基因插入cI基因后，使后者失活，Tetr表达，因此重组子在含有Tet的平板上可生长，自身环化的载体转化细胞则不能生长。
4．营养素依赖表型把亮氨酸自养型载体转入亮氨酸异养型菌株即可在无亮氨酸的培养基中生长。
5．蓝白筛选蓝白筛选是通过插入失活lacZ基因，破坏重组子与宿主之间的ɑ-互补作用来鉴别重组子与非重组子的筛选方法，是携带lacZ基因的许多载体的筛选优势。
这些载体包括M13噬菌体，pUC质粒系列，pEGM质粒系列等。
它们的共同特点是载体上携带一段细菌lacZ基因的α肽编码序列，其编码产物为β-半乳糖苷酶的α肽。
当无外源DNA插入时，质粒表达α肽。
突变型Lac-E.Coli可表达该酶的ω肽。
单独存在的α及ω肽均无β-半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达这两个肽时，宿主细胞内才有β-半乳糖苷酶活性，在含有底物X-gal(5-溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷)的诱导剂IPTG（异丙基硫代－β－D－半乳糖苷）条件下，菌落呈蓝色，这就是α-互补。
重组子的筛选方法
重组子的筛选方法
重组子的筛选方法包括以下几种：
1. PCR筛选法：利用PCR扩增方法，在重组子序列两端设计引物，扩增出目标重组子序列。
该方法可快速、简便地筛选出重组子，但存在引物设计不当、PCR 扩增条件不适等问题。
2. Southern blotting法：利用重组子DNA序列特异性探针进行筛选，这种方法需要对目标重组子进行限制性酶切，分离重组子DNA片段，然后进行Southern blotting，根据特异的探针与重组子DNA序列的杂交情况，确定有无目标重组子，这种方法相对复杂，但有高准确性。
3. 包装体筛选法：将目标重组子所在的DNA片段插入载体中，建立重组子文库。
然后采用包装体技术将文库中的重组子片段插入病毒包装体中，再通过病毒感染将重组子片段转染到宿主细胞，筛选出含有目标重组子的克隆。
4. 负筛选法：利用重组子DNA序列中含有的特异性标记，通过筛选方法去除不含该标记的过渡物，从而筛选出含有目标重组子的样品。
以上是常见的几种重组子筛选方法，不同方法适用于不同的实验需求和实验条件。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
抗药性筛选
抗药性筛选主要用于重组质粒DNA转化子的筛 选。
正向选择
插入失活则成为负向选择
培养时间不宜过长，12～16h，转化子菌落会降解 药物，导致周围药物浓度降低，长出假转化子菌落。
抗药性筛选
插入失活
外源目的基因插入载体后，抑制筛选标记基因的表达。
插入表达
外源目的基因插入载体后，激活筛选标记基因的表 达。
筛选植物转化细胞
抗除草剂基因 (bar)：bar基因编码的酶能够解 除非选择性除草剂的毒性
除草剂是一种谷氨酸类似物，强烈抑制谷胺酰胺合
成酶，从而导致植物体内氨的积累，并使植物死亡
bar基因可以将除草剂乙酰化，从而使植物具有除草
剂的抗性。
筛选植物转化细胞
葡萄糖酸苷酶（GUS），GUS可以催化人工合 成的底物4－甲基伞形花酮，产生一种荧光物 质，可用荧光光度计定量测定。
在筛选标记基因前连上一段负调控序列。
显色筛选
原理：如果在载体DNA上组入LacZ’，则重组 DNA分子会在含有X-gal和IPTG的培养基中得 到蓝色的转化子菌落。
由于被转化的基因产物作用于X-gal需要较长的时间， 因此观察和确定转化子菌落的培养时间可适当延长。
营养缺陷型筛选
一些参与核苷酸代谢的基因
简便快捷、灵敏度高，已被广泛应用与植物基因转 化实验，尤其是进行外源基因瞬间表达的系统。
移酶（CAT），可以催化氯霉素
失活，因此，与外源DNA共转化的Cat基因能
使转基因植物具有抗氯霉素的活性。
哺乳动物转基因细胞的筛选
胸苷激酶基因(TK)
二氢叶酸还原酶基因（DHFR）
对于λDNA系统而言，转导受体菌后，转化子 被裂解成噬菌斑，而非转化子则能正常生长， 两者很容易区分。
1. 重组λDNA必须在野生型λDNA长度的78~105% 范围内才能成功包装。 2. 空载λDNA也能正确包装，可以通过筛选标记基 因进行筛选。
筛选植物转化细胞
在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基
黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（XGPRT）
这些基因参与核苷酸代谢，缺失后导致营养缺陷。
Thank You
酵母载体选择标记基因 培养基
依据重组子结构特征进行筛选
凝胶电泳分析：在转化子筛选的基础上，依据 有外源DNA片段的重组质粒与载体DNA之间的 大小差别来区分重组子和非重组子。
1. 在平板上挑选菌落 2. 将菌落放入细菌裂解液，悬浮－离心－取上清 3. 电泳 优点：直观、快捷、尤其适用于插入片段较大的重 组子的筛选。 缺点：载体可能会与一个以上的外源DNA片段连接
为转化子。
含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
如果重组子中含有目的基因，称为阳性克隆子，
或期望重组子。
重组子的筛选
重组子的筛选
将转化处理后的受体细胞接种在选择培养基上，
培养一定时间，根据菌落生长情况挑选转化子。
在普通培养基中加入适量的某种选择物，即为
选择培养基。
选择物由载体DNA分子上携带的选择标记基因
重组子的筛选
生物与食品工程学院
重组子的筛选
并非所有的受体细胞都能导入重组子DNA分子,
导入外源DNA分子的受体细胞不一定能良好增
殖。为了从众多的受体细胞中筛选出含有外源
重组DNA的克隆子，必需利用载体、宿主细胞
的特性对受体细胞进行筛选或选择。
重组子的筛选
导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称
因经常称为“报告基因”，在有选择压力的情
况下，可利用报告基因在受体细胞内的表达筛
选转化细胞。
筛选植物转化细胞
荧光素酶基因（LUC）: LUC是一种源于萤火 虫的动物蛋白基因产物，能够催化生物发光反 应。
荧光素酶可以在植物细胞内正常表达 优点：检测迅速、灵敏度高、无污染，是一种理想 的报告基因。
酰基酶，使Cm乙酰化而失效
卡那霉素（Km或Kan），Km抗性基因可以转译一
种能修饰Km的酶，阻断Km对核糖体的干扰。
抗药性筛选
四环素(Tc或Tet)，Tc抗性基因转译一种能改变细 菌膜的蛋白，防止Tc进入细胞后干扰细菌蛋白质的 合成。
链霉素(Sm或Str)，Sm抗性基因转译一种能修饰 Sm的酶，抑制Sm与核糖体结合。
依据重组子结构特征进行筛选
限制性核酸内切酶酶切分析：从转化菌落中挑 选菌落，提取质粒，用限制性核酸内切酶进行 酶切，然后通过凝胶电泳分析。
优点：可以判断DNA分子插入的方向及分子量的大 小。
利用PCR方法筛选重组子
外源DNA两侧序列多数是已知的
通过两侧序列设计引物，扩增
电泳
噬菌斑筛选
所决定，如：抗生素、显色剂。
重组子的筛选
筛选方法主要包括：
1. 抗药性筛选 2. 显色筛选 3. 依据重组子结构特征筛选
抗药性筛选
利用载体上的抗药性选择标记进行筛选。
氨苄青霉素（Ap或Amp），bla基因可以编码β丙酰 胺酶，可降解Ap
氯霉素（Cm或Cmp），cat基因编码氯霉素乙酰转