植物过氧化物酶的提取、
洋葱过氧化物酶实验报告
一、实验目的1. 了解洋葱过氧化物酶的分布情况。
2. 掌握测定洋葱过氧化物酶活性的方法。
3. 分析洋葱过氧化物酶在不同处理条件下的活性变化。
二、实验原理过氧化物酶（POD）是一种广泛存在于植物体内的酶，具有催化过氧化氢（H2O2）分解为水（H2O）和氧气（O2）的功能。
在实验中，通过测定过氧化氢分解速率来间接反映过氧化物酶的活性。
本实验采用TMB法测定洋葱过氧化物酶活性，TMB在过氧化物酶的作用下，会生成蓝色的化合物，通过测定蓝色化合物的吸光度，可以计算出过氧化物酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：洋葱、蒸馏水、TMB溶液、过氧化氢溶液、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、冰浴等。
2. 实验仪器：分光光度计、电子天平、研钵、移液器、试管等。
四、实验方法1. 洋葱过氧化物酶提取液的制备：取洋葱鳞片叶，用蒸馏水冲洗干净，剪碎后加入磷酸盐缓冲液（pH 6.0），在冰浴中研磨，制成洋葱过氧化物酶提取液。
2. TMB反应体系的制备：取一定量的TMB溶液和过氧化氢溶液，混合均匀，加入磷酸盐缓冲液（pH 6.0），配制成TMB反应体系。
3. 过氧化物酶活性测定：取一定量的洋葱过氧化物酶提取液，加入TMB反应体系，在特定波长下测定吸光度，根据吸光度变化计算过氧化物酶活性。
五、实验结果与分析1. 洋葱过氧化物酶的分布情况：通过对洋葱不同部位（叶片、鳞片叶、茎）的过氧化物酶活性测定，发现洋葱叶片中过氧化物酶活性最高，其次是鳞片叶和茎。
这表明过氧化物酶在洋葱叶片中分布较为集中，可能与叶片的光合作用、氧化还原反应有关。
2. 不同处理条件下过氧化物酶活性的变化：将洋葱过氧化物酶提取液分别置于不同温度（0℃、25℃、50℃）、不同pH值（pH 4.0、pH 6.0、pH 8.0）条件下处理，测定过氧化物酶活性。
结果显示，在适宜的温度（25℃）和pH值（pH 6.0）条件下，过氧化物酶活性最高。
这表明洋葱过氧化物酶活性受温度和pH值的影响较大。
植物过氧化物酶(POD)提取液
植物过氧化物酶(POD)提取液
简介：
过氧化物酶(peroxisome，POD)是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，主要存 在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢，氧化酚类和胺类化合物， 具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。该酶属于细胞木质素合成途径中间的关 键酶，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石 细胞含量提高其品质提供依据。
操作步骤(仅供参考)：
1、取植物组织清洗干净，切碎。 2、加入植物过氧化物酶(POD)提取液，冰浴情况下充分捣碎或研磨。 3、离心，留取上清液。 4、冻存，用于物过氧化物酶(POD)的检测或其他用途。
计算：
组织或植物粗酶液获得率(ml)=上清液体积(ml)/组织或植物质量×100%
注意事项：
1、 待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。 2、 所测样本的值高于标准曲线的上限，应用植物过氧化物酶(POD)提取液稀释样品后重
北京雷根生物技术有限公司
新测定。 3、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12 个月有效。
相关：
编号 CC0007 CS0001 DC0032 DF0135 NR0001 PS0013 TC1167
名称 磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁) ACK 红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer) Masson 三色染色液 多聚甲醛溶液(4% PFA) DEPC 处理水(0.1%) RIPA 裂解液(强) 尿素(Urea)检测试剂盒(脲酶波氏比色法)
Leagene 植物过氧化物酶(POD)提取液主要用于裂解植物组织，提取植物样品中的过 氧化物酶。该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
过氧化物酶活性的测定实验报告
一、实验目的了解过氧化物酶（POD）在植物生理学中的重要作用，掌握测定POD活性的方法，并分析不同因素对POD活性的影响。
二、实验原理过氧化物酶是一种广泛存在于植物组织中的酶，能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水（H2O）和氧气（O2）。
在实验中，通过测定在一定时间内POD分解H2O2产生氧气的量，来评价POD的活性。
反应方程式如下：2H2O2 → 2H2O + O2本实验采用愈创木酚法测定POD活性。
愈创木酚在POD催化下被氧化，生成对苯醌，进而与氯化铁形成紫色络合物，通过测定紫色络合物的吸光度变化来反映POD的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 植物叶片（如马铃薯、菠菜等）- 过氧化氢（H2O2）- 愈创木酚- 氯化铁- 磷酸氢二钠（Na2HPO4）- 磷酸氢钠（NaH2PO4）- pH计- 离心机- 分光光度计- 研钵- 试管- 移液器- 电子天平2. 实验试剂：- 0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 M H2O2溶液- 0.5 M愈创木酚溶液- 0.1 M氯化铁溶液四、实验步骤1. 酶液提取：将植物叶片洗净、剪碎，加入预冷的磷酸盐缓冲液，在研钵中研磨成匀浆。
将匀浆液转移至离心管中，4℃、12,000 rpm离心10分钟，取上清液即为酶液。
2. 测定酶活性：取5支试管，编号为1-5，分别加入以下试剂：- 空白组：0.1 M磷酸盐缓冲液1.0 mL、0.1 M H2O2溶液1.0 mL、0.5 M愈创木酚溶液1.0 mL- 实验组：0.1 M磷酸盐缓冲液1.0 mL、0.1 M H2O2溶液1.0 mL、0.5 M愈创木酚溶液1.0 mL、酶液0.1 mL将各试管混匀，置于37℃恒温水浴中保温5分钟。
取出试管，立即放入冰浴中终止反应。
使用分光光度计在波长560 nm处测定各试管吸光度。
3. 计算酶活性：以空白组吸光度为基准，计算各实验组吸光度变化值（ΔA）。
根据下列公式计算酶活性：酶活性（U/g·min）= ΔA × 0.05 × 10^3 / 酶液浓度五、结果与分析1. 不同植物叶片POD活性比较：实验结果显示，不同植物叶片的POD活性存在差异。
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制
过氧化物酶（POD ）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H 202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。
【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL ，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL ，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g ，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL ，于研钵中研成匀浆，以4000r/min 离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。
（2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL ，KH2PO41mL ，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL ，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm 波长下测量OD 值，每隔1min 读数一次（4min ）。
以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD 值增加0.01定义为一个活力单位。
表1 紫外吸收法测定POD 酶活性配置表4.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。
也可以用每 min内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。
POD 总活性[u/g(FW)]=式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。
其中 △470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
ACK ——照光对照管的吸光度。
AE ——样品管的吸光度。
Vt ——样品液总体积，mL 。
[指南]过氧化物酶pod的测定
![[指南]过氧化物酶pod的测定](https://img.taocdn.com/s3/m/f489af6e178884868762caaedd3383c4bb4cb4f9.png)
过氧化物酶活性的测定愈创木酚法目的意义过氧化物酶是植物体内重要的呼吸酶类，其活性高低与酚类物质代谢、物抗性密切相关。
通过实验掌握提取POD和测定其活性的方法及其原理。
过氧化物酶催化H202氧化酚类，生成醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的产物。
本实验以愈创木酚为底物，过氧化物酶催化H202将愈创木酚氧化生成茶褐色产物，此产物在470nm波长处有最大吸收峰，故可通过测定470nm波长下的吸光度变化得知过氧化物酶的活性。
三、材料、设备和试剂1．材料马铃薯或小麦芽、未成熟的苹果、新鲜茶叶等。
2．设备 721型分光光度计、离心机、秒表(或手表)、天平、研钵、磁力搅拌器。
3．试剂愈创木酚、30％过氧化氢、20mmol/L KH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液(pH6．0)。
反应混合液配制取100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50ml于烧杯中，加入愈创木酚28µl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚完全溶解，待溶液冷却后，加入30％过氧化氢19µl 以，混合均匀，保存于冰箱中。
三、操作方法1．酶液制备称取植物材料1g，加入20mmol/L KH2PO4溶液5m1，于研钵中研磨成匀浆，在33000r/min 下离心10min，上清液转入25m1容量瓶中，残渣再用5ml KH2PO4溶液提取一次，合并两次上清液，定容，混匀，贮于冷凉处备用。
2．比色测定取光径1cm比色杯2只，于1只中加入已混匀的反应混合液3m1，KH2PO4溶液1ml，作为参比液；另一只中加入反应混合液3ml，酶液1m1(如酶活性过高可稀释之)，立即记时并置于分光光度计中。
在470nm下测定光密度，每隔1min读数一次，连续测30min，每次测定前重新用对照校准。
若气温较低，应适当提高室温，以37℃为最适宜。
四、实验结果1．以时间为横坐标，光密度为纵坐标作图。
反应前期过氧化氢酶活性随反应时间直线上升，升到最大值后，其相关曲线出现转折点，转折出现的早晚取决于温度。
一种过氧化物酶的提取方法
一种过氧化物酶的提取方法介绍如下:
过氧化物酶是一种重要的水解酶，在生物医药、食品工业等领域有着广泛的应用价值。
下面我们来介绍一种可行的过氧化物酶的提取方法：
提取方法：
1.准备新鲜植物、肝脏或其他组织或细胞培养物。
2.将组织或细胞用生理盐水洗净，然后切成小块。
3.加入适量的冰冷酒精，浸泡3-4小时，使细胞破裂可释放出过氧化物酶。
4.轻轻搅拌，然后过滤去除细胞残渣，得到纯化的过氧化物酶。
5.使用离子交换色谱和凝胶过滤等色谱方法，对提取得到的酶进行纯化。
6.通过测定酶活性，确定其纯度和酶活性。
7.最后，将得到的纯化酶溶液进行减压冷冻干燥或冻干，存放于低温处备用。
此提取方法的优点在于，具有简单易行、操作方便、纯度较高等特点，同时可以获得良好的酶活性和稳定性。
然而，在实际操作的过程中，还需要注意控制提取温度、时间和酒精浓度等因素，以使提取效果更加理想。
此外，还可以使用其他提取方法，比如超声波辅助提取、酸碱法提取、酶学法提取等，每种方法都有其各自的适用范围和优缺点，需要根据具体情况进行选择。
大豆过氧化物酶的提取与分离纯化研究
2018年8月m i tJournal of Green Science and Technology第16期大豆过氧化物酶的提取与分离纯化研究刘力(武汉华测检测技术有限公司食品实验室，湖北武汉430223)摘要：利用超声辅助法提取大豆过氧化物酶（P O D酶），对大豆不同部位P O D酶含量进行了比较，采用硫酸铵一丙酮沉淀法对P O D酶进行了分离纯化，结果得到的大豆胚芽P O D酶的比活力是豆壳P O D酶的2. 61倍，较豆壳而言大豆胚芽为P O D酶提取的最佳原料。
经硫酸铵沉淀、丙酮沉淀和硫酸锌除杂后，大豆P O D 酶活力为13765.00U/m L,蛋白质浓度为3. 11m g/m L,酶的比活力为4432. 52U/m g,R z值 1. 59,且纯化倍数达38. 30。
同时，经S D S—P A G E电泳分析后，可推断出该大豆P O D酶的分子量大约在65〜95k b之 间，且只出现了一个条带，可看出纯化效果较好。
关键词：过氧化物酶;提取；分离纯化中图分类号：Q814文献标识码：A文章编号=1674-9944(2018)16-0256-041引言大豆过氧化物酶（POD)是从豆壳或大豆胚芽中提 取的一种活性很高的过氧化物酶，是由单一肽链和卟琳 构成的血红素蛋白，脱辅基蛋白分子需与血红素结合能 构成全酶[1]。
分子量为37000D,300多个氨基酸残基组 成，等电点为3.9,是酸性蛋白质[2]。
大豆POD酶由两 个结构域组成，中间是血红素辅基，Kamal[3]等推出由 77%的螺旋、16%的|3 —折叠和p—转角及其它结构 组成其结构域。
大豆过氧化物酶和辣根过氧化物酶的 结构及作用机理有许多相似之处，都属于植物过氧化物 酶超家族的D I类酶[4]。
它们具有相似的三维折叠模式，氨基酸序列有57%的同源性，两者都含有1个色氨酸，2个Ca2+，4个二硫键和8个多糖。
现在，对辣根过氧 化物酶的研究较成熟，大豆过氧化物酶的研究甚少。
植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制、酶学及分子特性
植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制、酶学及分子特性一、本文概述植物抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase，AP）是一种在植物细胞内广泛存在的关键酶，其在植物抗氧化防御系统中发挥着至关重要的作用。
本文旨在全面探讨植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制、酶学特性以及分子特性，以期为深入理解植物抗氧化防御系统的运行规律，以及提高植物抗逆性和农业生产力提供理论基础。
我们将详细介绍抗坏血酸过氧化物酶的生化功能，包括其催化抗坏血酸清除活性氧的能力及其在细胞氧化还原稳态中的作用。
接着，我们将深入探讨抗坏血酸过氧化物酶的酶学性质，如酶的动力学特性、抑制剂和激活剂的影响等。
我们将对抗坏血酸过氧化物酶的分子特性进行阐述，包括其基因结构、表达调控以及蛋白质结构等方面的研究。
通过本文的综述，我们期望能够为植物生物学、农业生物技术以及植物抗逆性研究等领域提供有益的参考和启示。
二、植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制植物抗坏血酸过氧化物酶（AP）是一种关键的抗氧化酶，主要作用是清除植物细胞中的过氧化氢（H2O2），以防止氧化应激对细胞造成的损伤。
AP的作用机制主要涉及到酶的催化活性以及其与底物的相互作用。
在AP的催化过程中，抗坏血酸（AsA）作为还原剂，将H2O2还原为水（H2O），而自身则被氧化为单脱氢抗坏血酸（DHA）。
这个过程可以表示为：2AsA + H2O2 → 2DHA + 2H2O。
DHA随后通过抗坏血酸再生系统被还原回AsA，从而维持了AP的催化循环。
AP的作用机制还涉及到其在细胞内的定位。
在植物细胞中，AP 主要分布在叶绿体、细胞质和线粒体等细胞器中。
这些细胞器中的AP通过特定的信号肽序列被定位到相应的位置，从而实现了对特定区域H2O2的高效清除。
AP的活性还受到多种因素的调节，包括光照、温度、pH值以及底物和抑制剂的浓度等。
光照和温度可以影响AP的稳定性和活性，而pH值则可以影响AP与底物的结合能力。
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实验结果
记录实验的操作程序，检查是否和原设计 相符合？ 将各胶柱中酶带条数、宽度、着色深浅和 移动距离填入表中。 选择比较组分凝胶中着色最深的酶带或特 殊酶带（即该组分特有酶带），计算酶带 的相对迁移率Rf值。
四、植物过氧化物同工酶电泳技术
实验原理 同工酶（isozymes）是指作用于底物相似或完全相同的 酶的不同分子形式，即催化同一种反应而结构不同的一 族酶。它们是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。利 用凝胶电泳技术（PAGE）可以将它们分开，用专一的 作用底物和特殊染料，把需要分析的酶染色，在胶柱上 呈现同工酶谱。 实验目的 通过实验掌握植物同工酶实验技术，了解植物同工酶分 析在遗传学研究中的意义。 着重掌握过氧化物酶的提取，电泳与染色技术和分析方 法。
三、植物过氧化物酶活性的测定（比色法）
原理
过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过 氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶 褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。 分光光度计 离心机 秒表 天平 研钵 磁力搅拌器 愈创木酚 30%过氧化氢 20mmol/L KH2PO4 100mmol/L 磷酸缓冲液， pH6.0（见附表2） 反应混合液
植物过氧化物酶的提取、 活性测定及同工酶的凝胶电泳分析
综合性、设计性实验 广州大学生命科学学院生物工程专业适用
2010年9月
一、植物过氧化物酶的提取
目的要求 学习制备植物过氧化物酶粗酶液的原理和方法 为后续实验提供酶液。 器材与仪器 电子天平； 冰冻高速离心机； 可见光分光光度计； 电动玻璃匀浆机等。 试剂 20mM KH2PO4， 100mM PBS：取0.2M 的Na2HPO4 12.3ml与0.2M的 NaH2PO4 87.7ml混合。加入100ml水稀释即成。
加样和电泳 样品（1）：胚芽酶液、溴酚蓝、50%蔗糖各0.05毫升； 样品（2）：胚芽酶液0.1毫升、溴酚蓝、50%蔗糖各0.05毫升； 样品（3）：胚轴酶液、溴酚蓝、50%蔗糖各0.05毫升； 样品（4）：胚轴酶液0.1毫升、溴酚蓝、50%蔗糖各0.05毫升； 上、下电泳槽加电极缓冲液后在低于15℃气温中，恒压160V（每 板电流约10mA）进行电泳，当溴酚蓝迁至离凝胶下 端0.5—1厘米 时停上电泳。电泳时间2—3小时。 用长针头注射器注水法自凝胶板上取出凝胶，凝胶要完整，不能断 裂。 染色：将完整的凝胶置于大号培养皿中，加入染色液，浸泡整块凝 胶，室温下染色15—20分钟，呈现酶带后取出凝胶，用脱色液分3 次脱去背景颜色，然后用水漂洗。 带型清楚的胶应作摄影记录或作扫描测定，胶凉干后还作永久保存。
仪器药品
操作步骤 取出贮于冷处备用的粗酶液。 取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3ml， KH2PO4 1ml，作为校零对照，另1只中加入反应混合 液3ml，上述酶液0.1ml用提取液稀释到1.0ml（因酶活 性过OD值会过大），立即开启秒表记录时间，于分光 光度计上测量吸光度值，每隔1分钟读数一次，读数于 波长470nm下进行。 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 △A470/min· mg蛋白质（或鲜重g）表示之。蛋白质含 量测定参阅实验二。
实验步骤 取粗酶液，加入等体积的50％的蔗糖溶液，电泳前可在冰箱中保存。
电泳槽的安装：封口胶封底和两侧，每侧用2个长尾夹夹住，防止 漏胶。 聚丙烯酰胺凝胶系统的配制 配胶：A∶B∶C∶H2O=1∶2∶0.2∶4.8 ，每块胶需胶液20ml（需 要溶液A=2.5ml,B=5.0ml,C=0.5ml,H2O=12ml）。配胶后将胶液做 好的夹层玻璃板倾斜30°，并立即将胶液缓缓灌入夹层中，随后将 玻板平放，再插入样品梳至梳齿3/4高度，待胶凝固后，小心拔出 梳子，并切记取出玻板底部的胶条。
学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue） 法测定蛋白质浓度的原理和方法。
试剂
考马斯亮蓝试剂； 标准和待测蛋白质溶液
器材
试管及试管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV－ 2000型分光光度计。
操作方法：取6支试管，按下表制定标准曲线。
试管编号 0.1mg/ml 标准蛋白溶液/ml 0.15mol/L NaCl/ml 每管中蛋白质浓度μ g/ml 考马斯亮蓝 G250 溶液 A595nm 0 0 1.0 0 1 0.2 0.8 20 2 0.4 0.6 40 5ml 3 0.6 0.4 60 4 0.8 0.2 80 5 1.0 0 100
操作方法
取绿豆胚芽、下胚轴和胚根各1g剪碎。 置入冰浴研钵中（加入少量石英砂），加 入预冷的20mM KH2PO4 2ml进行冰浴研 磨提取。 匀浆液离心4500rpm 10min。 上清液为酶粗提液，用提取液定容到10ml 供测定。
二、蛋白质浓度的测定──考马斯亮蓝染色法
目的要求
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在电脑 上绘制标准曲线。
未知样品蛋白质浓度测定 测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在 标准曲线的直线范围内。 根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于 标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度 （μg/ml）。 注意事项 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁 上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完 后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
实验材料（以下内容任选一组或二组即可） 新种子和储藏2—3年陈种子。 发芽不同天数的绿豆幼苗同一部位材料。 相同发芽天数的绿豆幼苗的不同部位材料。 其他材料。 实验器具和药品 仪器：电泳仪，电泳槽，注射筒及针头，微量注射器， 离心机。 药品：三羟甲基氨基甲烷（Tris），四甲基乙二胺 （TEMED），丙烯酰胺（Acr），甲叉双丙烯酰胺 （Bir），甘氨酸，过硫酸铵，蔗糖，溴酚蓝，联苯胺， 过氧化氢。