实验一 特殊显微镜及其使用
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实验一特殊显微镜的工作原理和使用
实验一特殊显微镜的工作原理和使用特殊显微镜是一种能够观察微观尺度物体的仪器，它通过利用光学、电子、声波等原理来放大和显示样品的细节。
特殊显微镜在科学研究、医学诊断、材料分析等领域起着重要的作用。
本文将重点介绍光学、电子和声学显微镜的工作原理和使用。
一、光学显微镜光学显微镜是一种利用可见光作为照明源的显微镜，其主要由物镜、目镜、调焦机构和光源构成。
它的工作原理是通过物镜将样品上的光聚焦到目镜上形成放大的影像。
光学显微镜的使用步骤如下：1.确保显微镜放置在平稳的台面上，并保持垂直。
2.调节光源亮度，使其能够提供足够的照明。
3.将样品放在载物台上，并使用样品夹夹紧。
4.用粗调焦机构将物镜与样品靠近，然后用细调焦机构调节焦距，直到看到清晰的影像。
5.调节目镜，使影像更为清晰。
6.根据需要，可以使用滤光片或偏振片来改变光的属性。
7.使用目镜检查样品，并调节焦距和目镜，如有需要。
光学显微镜的优点是成本较低、易于操作，并且可以观察到样品的活体细胞。
缺点是分辨率有限，仅能观察到大约200-300纳米的细节。
二、电子显微镜电子显微镜是一种利用电子束取代可见光来照射样品的显微镜，它可以提供比光学显微镜更高的分辨率和放大倍数。
电子显微镜的工作原理是通过电子束的散射、透射和反射来获得样品的影像。
具体而言，电子束通过电子枪产生，然后经过准直系统和电子透镜聚焦。
在样品中穿透或被散射后，电子束最终落在屏幕或探测器上生成影像。
电子显微镜的使用步骤如下：1.准备样品，通常需要制备薄片并清洁表面。
2.打开电子显微镜，等待其预热。
3.将样品放置在样品台上，并将其安装在显微镜中。
4.调节电子束的对焦，使其尽可能锐利。
5.对样品进行调节，以便获得所需的放大倍数和分辨率。
6.观察和记录样品的影像，可以使用照相机或电子影像探测器。
电子显微镜的优点是具有更高的分辨率和放大倍数，可以观察到更小的细节，如原子尺度。
缺点是设备复杂、操作困难，并且样品必须处于真空环境中才能进行观察。
实验一 特殊显微镜的工作原理和使用(共46张PPT)
4、有不同程度的衰减
5、 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、 荧光效率
荧光的产生
➢ 一次荧光：又叫自发荧光或固有荧光，经过紫外光照射直接 发出荧光。
➢ 二次荧光：又叫继发荧光，被观察物体经过荧光染料处理之后，经 过紫外光照射才能发出荧光。
➢ 荧光染料种类很多：
荧光显微镜原理
➢ 荧光显微镜利用一个高发光效率的点光源，经过滤 色系统发出一定波长的光(如波长短的紫外光 365nm或紫蓝光420nm)作为激发光、激发标本内 的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过 物镜和目镜的放大进行观察。
➢ 暗视场显微镜就是利用此原理设计的。
丁达尔现象
➢ 暗视场显微镜是在普通光学显微镜中去除明视场聚光器，换上 一个暗视场聚光器而成。
➢ 它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视场聚光器，常用的 是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡,不能由下而上地通 过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的 标本上。
➢ 特殊显微镜是与明视场普通显微镜相对而 言，在成像原理、结构和用途上存在差异 的显微镜。
➢ 这里介绍： 1、暗视场显微镜 2、相差显微镜 3、荧光显微镜
一、 暗视场显微镜
应用：微小粒子、细菌形 态、细菌记数，透明标 本观察等。
(一) 原理和结构特点
➢ 在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不 易被看见的，但在暗的房间中若有一束光 线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了， 这是光学上的丁达尔现象。
要求与注意事项
➢ (1)制作标本时所用的载玻片和盖玻片均应清洁干净，必须使用薄玻片(载玻片厚度约 1.O～1.1mm，盖玻片厚度约0.1mm)，否则会影响暗视野集光器斜射光焦点的调节， 如载玻片太厚，焦点只能落在载玻片内，就不能看到物像。标本也不能过厚。
5、 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、 荧光效率
荧光的产生
➢ 一次荧光：又叫自发荧光或固有荧光，经过紫外光照射直接 发出荧光。
➢ 二次荧光：又叫继发荧光，被观察物体经过荧光染料处理之后，经 过紫外光照射才能发出荧光。
➢ 荧光染料种类很多：
荧光显微镜原理
➢ 荧光显微镜利用一个高发光效率的点光源，经过滤 色系统发出一定波长的光(如波长短的紫外光 365nm或紫蓝光420nm)作为激发光、激发标本内 的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过 物镜和目镜的放大进行观察。
➢ 暗视场显微镜就是利用此原理设计的。
丁达尔现象
➢ 暗视场显微镜是在普通光学显微镜中去除明视场聚光器，换上 一个暗视场聚光器而成。
➢ 它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视场聚光器，常用的 是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡,不能由下而上地通 过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的 标本上。
➢ 特殊显微镜是与明视场普通显微镜相对而 言，在成像原理、结构和用途上存在差异 的显微镜。
➢ 这里介绍： 1、暗视场显微镜 2、相差显微镜 3、荧光显微镜
一、 暗视场显微镜
应用：微小粒子、细菌形 态、细菌记数，透明标 本观察等。
(一) 原理和结构特点
➢ 在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不 易被看见的，但在暗的房间中若有一束光 线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了， 这是光学上的丁达尔现象。
要求与注意事项
➢ (1)制作标本时所用的载玻片和盖玻片均应清洁干净，必须使用薄玻片(载玻片厚度约 1.O～1.1mm，盖玻片厚度约0.1mm)，否则会影响暗视野集光器斜射光焦点的调节， 如载玻片太厚，焦点只能落在载玻片内，就不能看到物像。标本也不能过厚。
实验一特殊显微镜的使用(共33张PPT)
荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。
一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在 而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变
化(相应发生的差异即相位差)，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。
物镜后面需加阻断滤光片。它的作用有二：一是 两种滤光片必须选择配合使用。
什么是荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。
吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损 相差显微镜在使用时，聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合（共轭重合
落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要 求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。
3．放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意：末 装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；
4．高压汞灯关闭后不能立即重新打开， 需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定， 影响汞灯寿命。
五、用途
1 观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记 的细胞和结构
3 细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA综合，进行细胞内DNA含量测定。
波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸 而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变
化(相应发生的差异即相位差)，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。
鱼、草履虫、甲醇、5‰ 丫啶橙、滤纸、吸管、载玻片、荧光 显微镜、暗视野显微镜、普通光学显微镜
一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在 而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变
化(相应发生的差异即相位差)，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。
物镜后面需加阻断滤光片。它的作用有二：一是 两种滤光片必须选择配合使用。
什么是荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。
吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损 相差显微镜在使用时，聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合（共轭重合
落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要 求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。
3．放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意：末 装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；
4．高压汞灯关闭后不能立即重新打开， 需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定， 影响汞灯寿命。
五、用途
1 观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记 的细胞和结构
3 细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA综合，进行细胞内DNA含量测定。
波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸 而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变
化(相应发生的差异即相位差)，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。
鱼、草履虫、甲醇、5‰ 丫啶橙、滤纸、吸管、载玻片、荧光 显微镜、暗视野显微镜、普通光学显微镜
实验1 特殊显微镜的原理及其使用
2 .结构特点 结构特点 使用中央遮光板或暗 视野聚光器（ 视野聚光器（常用的是抛 物面聚光器）， ），使光源的 物面聚光器），使光源的 中央光束被阻挡。 中央光束被阻挡。不能由 下而上地通过标本进入物 从而使光线改变途径， 镜。从而使光线改变途径， 倾斜地照射在观察的标本 上，标本遇光发生反射或 散射， 散射，散射的光线投入物 镜内， 镜内，因而整个视野是黑 暗的。 暗的。
三、实验步骤 1.样品制备：在一张无划痕、 1.样品制备：在一张无划痕、清洁的载玻片上滴一 样品制备 滴生理盐水， 滴生理盐水，用牙签取牙垢或用镊子撕洋葱内表 皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀， 皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀，盖上盖 玻片，用滤纸条吸取盖片四周多余的水分，镜检。 玻片，用滤纸条吸取盖片四周多余的水分，镜检。 2.将暗视野聚光器安装在显微镜上，调强照明光。 2.将暗视野聚光器安装在显微镜上，调强照明光。 将暗视野聚光器安装在显微镜上 3.在聚光器透镜的上表面滴上镜头油。向上缓慢调升 在聚光器透镜的上表面滴上镜头油。 在聚光器透镜的上表面滴上镜头油 聚光镜，使镜头油与载玻片下表面缓缓接触。 聚光镜，使镜头油与载玻片下表面缓缓接触。只 有在油滴与载玻片的底面相接触后， 有在油滴与载玻片的底面相接触后，光线才能射 向标本。 向标本。 4.将标本置于载物台上，插入10x物镜，用调焦螺旋 4.将标本置于载物台上，插入10x物镜， 将标本置于载物台上 10x物镜 聚焦样品。 聚焦样品。
• 6.观察物镜后焦面，调节仪器使聚光器中环状光阑的像和 观察物镜后焦面， 观察物镜后焦面 相差物镜中相板的圆环互相吻合， 相差物镜中相板的圆环互相吻合，这一步是调好相差最重 要的步骤。具体方法是：取下一个目镜， 要的步骤。具体方法是：取下一个目镜，插入一个聚焦望 远镜，转动望远镜的接目镜， 远镜，转动望远镜的接目镜，直到在望远镜中观察到清晰 的环状光阑（在聚光器中）和相板（在相差物镜中）的像。 的环状光阑（在聚光器中）和相板（在相差物镜中）的像。 如果环状光阑的明亮光圈与圆形相板不吻合，可以通过调 如果环状光阑的明亮光圈与圆形相板不吻合， 节聚光器上的调中螺旋使之吻合。调节吻合后， 节聚光器上的调中螺旋使之吻合。调节吻合后，取出聚焦 望远镜，插入目镜， 望远镜，插入目镜，就可在目镜中观察到一个清晰的口腔 上皮细胞的相差像。 上皮细胞的相差像。 • 7.如果换用高倍相差物镜观察，需要移入相应的高倍相差 如果换用高倍相差物镜观察， 如果换用高倍相差物镜观察 物镜的聚光器环状光阑进行观察。 物镜的聚光器环状光阑进行观察。
实验指导_实验一、显微镜的使用和微生物形态的观察
实验一显微镜的使用和微生物形态的观察一、目的要求1、熟悉普通光学显微镜的构造及其使用方法。
2、了解油镜的原理，并掌握其使用方法。
3、观察各种染色标本，认识微生物的基本形态和特殊结构。
二、基本原理显微镜包括普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。
微生物个体微小，难于用肉眼观察形态结构，只有借助显微镜，才能对其进行研究和利用。
普通光学显微镜是一种精密的光学仪器，是观察微生物最常用的工具。
细菌等原核细胞型微生物个体微小，一般需要使用油镜观察其形态结构。
而油镜头晶片极小，投入光线少，从载玻片透过光线，又被空气折射（空气折光广率1.00、玻璃折光率为1.52），更不易射入镜头内，致使光线较弱物像不清。
当在镜头和载玻片之间滴加香柏油后，由于香柏油折光率为1.515，与玻璃相近，可消除光线通过玻璃与物镜间空气时发生折射现象，避免光线损失，使亮度和清晰度都得到了提高，几乎可以看清所有细菌。
三、实验材料及仪器（1）标本及试剂：微生物标本片、香柏油、二甲苯。
（2）仪器及其他用具：普通光学显微镜、擦镜纸等。
四、实验步骤1.普通光学显微镜的构造及使用方法。
1）普通光学显微镜的构造。
普通光学显微镜有机械部分和光学部分组成。
A．显微镜的机械部分。
包括镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、推动器、粗调节器（粗调螺旋）和细调节器（微调螺旋）等部件（图1-1）普通光学显微镜机械部分各部件的构造与功能见表1-1B．显微镜的光学系统。
由反光镜、聚光镜、物镜、目镜、虹彩光圈等组成，光学系统使标本物像放大，形成倒立的放大物像。
表1-2普通光学显微镜光学系统的构造与功能2）普通显微镜的使用①取镜。
从镜箱中取镜时，一手握镜臂，一手托镜座，保持镜体直立，以防反光镜及目镜脱落被摔坏，将显微镜放置于平稳的实验台上。
端正坐姿，镜检时两眼同时睁开，单目显微镜一般用左眼观察，用右眼帮助绘图或做记录。
双目显微镜用双眼观察。
②使低倍镜与镜筒呈一直线，调节反光镜，让光线均匀照射在反光镜上，电光源显微镜打开照明光源，并使整个视野都有均匀的照明。
相差显微镜PhaseContrastMicroscope
Phase contrast light pathways
用途：观察未经染色的玻片标本
（三）荧光显微镜 Fluorescence Microscope
原理：利用一定波长的光（通常是波 长短的紫外光和蓝紫光）照射被检样 品，激发荧光，现场中所见到的像， 主要是样品的荧光映射。有两个特殊 的滤光片；照明方式通常为落射式。
显微镜的能力
1. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。其公 式如下：
R:分辨率；λ：入射光线波长；N．A．（数值孔径）
＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=镜口角（样品对物 镜镜口的张角）。
2. 显微镜的几个光学特点：
–制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65～1.78，所用 介质的折射率越接近玻璃的越好。
（四）激光共聚焦扫描显微境 Laser Confocal Scanning Microscope
• 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 • 能显示细胞样品的立体结构。 • 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 • 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形
成立体图像。
laser confocal scanning microscope, LCSM
2、暗视场显微镜
应用丁达尔现象，装配了一类特殊聚光器——暗视 场聚光器，使用入时光束，从聚光器斜向照明被检 验样品。
实验原理
3、相差显微镜
由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差 的差别太小，只有在变相差为振幅差（明暗之差） 之后，才能被分辨。
4、荧光显微镜
荧光显微术是利用一定波长的光（通常是波长短的 紫外光和蓝紫光）照射被检样品，激发荧光物质发 出可见的荧光，现场中所见到的像，主要是样品的 荧光映像。
• 1952年，Nomarski发明， 利用两组平面偏振光的干 涉，加强影像的明暗效果， 能显示结构的三维立体投 影。标本可略厚一点，折 射率差别更大，故影像的 立体感更强。
实验一 特殊显微镜的使用
实验一.几种特殊光学 显微镜的使用
• 相差显微镜与普通显微镜结构相比较 具有以下特殊结构: 1.转盘聚光镜. 2,相差物镜. 3,合轴调中望远镜. 4绿色滤色镜 • 相差显微镜主要用于观察活细胞
一,相差显微镜的结构及 使殊光学部件: 1.光源. 2.激发滤色镜. 3.阻断滤色镜 • 荧光显微镜主要用于被荧光染 料染色的标本的观察
三.暗视野显微镜的结构及 使用
• 特殊光学部件:暗视场聚光镜. • 暗视野显微镜的分辨率可以达到 0.004微米,可清楚地观察植物细胞 的细胞质环流.
四.将普通光学显微镜改装成 暗视野显微镜
• 1.剪一适当大小的园形黑纸片贴在 聚光镜上面(用清水贴). • 用洋葱鳞茎内表皮细胞制成一装片 在改装后的显微镜下观察.
微生物实验实验一显微镜的使用及微生物形态观察
结果分析和报告撰写
分析实验结果
对观察到的微生物形态特征进行详细 记录和分析，确定其分类和鉴别结果 。
撰写实验报告
根据实验结果和分析，撰写实验报告 ，包括实验目的、实验过程、结果分 析等内容。
05
注意事项
显微镜的保养与维护
01
02
03
04
清洁
每次使用后，应用软布轻轻擦 拭显微镜表面，以防止灰尘和 污垢积累。
放大倍数较高，可观察微生物的超微结构，但操作复杂且成本较 高。
载玻片
• 用于放置显微镜观察的样品，通常为透明无色的玻璃片。
盖玻片
• 用于覆盖样品，防止样品移动或干燥，同时起到一定的放大作用。
细菌或真菌样品
细菌
常见的肠道细菌、病原菌等。
真菌
酵母菌、霉菌等。
染色剂（如美蓝、结晶紫等）
美蓝
用于染色细菌细胞壁，使其易于 观察。
逐渐调高倍数，仔细观察微生物的形态特征，如形状 、大小、颜色、细胞结构等。
记录观察结果，绘制微生物形态图谱，以便后续分析 。
04
结果分析
微生物形态特征的识别
80%
识别微生物的形状
通过显微镜观察，可以识别出微 生物的形状，如球形、杆形、螺 旋形等。
100%
识别微生物的大小
通过测量显微镜下观察到的微生 物，可以得出其大小，通常以微 米（μm）为单位。
结晶紫
常用于染色革兰氏阳性菌，使其 呈现紫色。
03
实验步骤
显微镜的使用
打开显微镜电源，调整光源亮度，确保光源稳 定。
01
打开显微镜的载物台，放置待观察的样本 。
03
02
放置显微镜于平坦的台面上，调整显微镜的 高度和角度，确保观察舒适。
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4 用途：
用于观察组织培养中活细胞形态结构或未染色标本。
5、标本
活细胞
三、荧光显微镜
1、原理
荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系 统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为 激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的可见 荧光，再通过物镜和目镜的成像、放大，以供检视和拍摄。
3.2.反射荧光显微镜：
光源：高压汞灯或卤素灯。
聚光镜：因为物镜作为聚光镜，所以不需要聚光镜。
物镜：所用的物镜必须能透过足够的紫外光，而且本 身不产生荧光，对数值孔径没有限制。
标本：厚的标本或不透明的标本都能观察。
优点：
• 由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。
• 采用柯拉照明法，可利用孔径光阑和视场光阑的效果。 • 物镜数值孔径不受限制，在高放大被率时，也可以获得高 分辨率的像。 • 厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。 • 其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透 射微分干涉差法相结合。 • 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。
荧光显微镜具特殊光源，提供足够强度和波长 的激发光，诱发荧光物质发出荧光。
当一个物体吸收了紫外光或者短波光的能量，它能发 射出比原来吸收的波长更长的光。这种波长长于激发光的 可见光称为“荧光” 。
荧光染色分类：
自发荧光（不加染色）：有些物质不加染色，也能发 出荧光（自发荧光或原发荧光），但在医学和生物学 领域中，只有很少物质具有自发荧光。 二次荧光（用化学染色）：非荧光性的物质（蛋白质、 碳水化合物）用荧光色素染色，由荧光色素产生荧光 （二次荧光），以便进行观察。对特定物体选择合适 的荧光色素，该物体就能和周围的组织或细胞区别出 来而可以观察到。 抗体荧光技术（用免疫染色）：利用特定的抗原必然 和特定的抗体相结合这一个事实，有意识地使带荧光 标记的抗体和标本中的抗原进行抗原/抗体反应，这样 两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。
阻断滤光镜(barrier filter)：
位于物镜之上，二向色镜与目镜之间，用以阻断 或吸收没有被标本吸收的激发光，以防伤害眼睛，使 荧光透过。在荧光中也仅有部分波长被选择透过。
选用的原则，以能完全阻断或吸收波长长于所需 荧光的光线，并透过样品发出的荧光。
2.4、荧光显微镜的光路
因荧光激发的方式不同，分为： 透射荧光显微术光路
2.3、滤色镜系统
激发滤色镜(exciter filter) 为被检样品的荧光燃料提供最佳波段的激发光。
加放于汞灯和二向色镜之间，物镜之前。
几种主要的激发滤色镜
激发方法 紫外 紫 兰紫 兰 绿 代号 UV V BV B ， B2 G 主波长 365nm 405nm 436nm 495nm 546nm
清点器械
实验报告
节 约 规 范
实验室卫生
实验一 特殊显微镜及流式细胞仪 的使用
实验所需的材料：
1、口腔上皮细胞 2、活细胞（细胞系） 3、培养的紫菜或小新月菱形藻 4、流式细胞仪的演示 实验所需的试剂： 香柏油、乙醚:酒精=7:3
暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜
实验目的： 掌握暗视野显微镜、相差显 微镜、荧光显微镜及流式细胞仪的原理、 构造及其使用方法。 学习特殊显微镜操作的目的： 暗视野显微镜：看到运动的物体，利用 目标物体的轮廓与背景区分开 荧光显微镜：辨别含有荧光物质所在的 位置
一、 暗视野显微镜
1. 原理
利用暗视野聚光器（或挡板）使入射光束的中央光 束被阻挡．不能由下而上地通过标本进入物镜，只能倾 斜地照射在观察的标本上。标本遇光发生反射或散射， 物镜接触不到入射光源的光线，只能接触标本的反射和 散射光。因而整个视野的背景是黑的，物体的边缘是亮 的，使在黑暗的背景上呈现出明亮的像。
4、使用方法（反射荧光显微镜）
1）打开灯源开关（汞灯及普通灯光源），超高压汞灯要预 热几分钟才能达到最亮点。 2）反射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发 滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。 3）放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意：末装滤 光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤； 4）高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再 启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。 5）先在普通光源下（数字调为1）用10倍物镜调整好玻片的 焦距，后转至40倍物镜。材料目标与焦距调好后，关闭普 通光源的电源（或用载物台下面的挡板将来自下面的普通 光源挡住），数字调至2-4，其中2为红色激发光，3为蓝 色激发光，4为绿色激发光，蓝色激发光波长最短，一般 应用蓝色3，即可看到荧光照片。 荧光显微镜主机的上部分右侧分别有调整荧光光圈、 光强的拉杆及照相拉杆。
相差：同一光线经过折射率不同的介质其相位发 生变化并产生的差异。
相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于 折射率与厚度的乘积之差（光程差），介质越厚或折射率越 大，光波减速也越大。
肉眼看不到的相差，利用光的衍射和干涉现象，把相位差 变成振幅差(明暗差)，就可以看到。
2 结构特点
相差显微镜与普通显微镜的 主要不同之处是： 1）用环状光阑代替可变光阑 2）用相差物镜(通常标有PH的 标记)代替普通物镜； 3）带有一个合轴调中望远镜CT: 用于环状光阑的环孔与相差 物镜相板共轭面的环孔（暗 环）在光路中准确合轴，使 成像的相位差变为振幅差； 4）有绿色滤色片：用于消色， 可吸收红色和蓝色光，只透 过绿光，使波长范围小的单 色光线进行照明，并有吸热 作用，能使相差观察获得良 好的效果
荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）
6、 实验内容、材料与仪器
内容：荧光显微镜下观察单细胞藻类 材料：小新月菱形藻 仪器：载玻片、盖玻片、荧光显微镜
四、流式细胞仪(flow cytometer, FCM)
1、FCM的结构可分为5部分： ①流动室及液流驱动系统； ②激光光源及光速形成系统； ③光学系统； ④信号检测与存储、显示、分析系统； ⑤细胞分选系统。 2、FCM的工作原理： 1） 将待测细胞染色后，制成单细胞悬液。用一定压力 将待测样品压人流动室，同时，不含细胞的磷酸缓冲液 在高压下从鞘液管喷出，鞘液管人口方向与待测样品流 成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动， 组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行 排列，依次通过检测区域。
5、用途
1)观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细 胞和结构 2)标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的荧光， 借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。 3)细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙 锭与吖啶橙可与DNA综合，进行细胞内DNA含量测定。 4)荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰 酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗或二抗），用该标 记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测 该抗原的存在与分布。
反射荧光显微术光路
透射荧光显微镜光路图
反射荧光显微镜光路图
目镜
阻断滤镜
激发 滤镜
二向色镜 物镜 样品 集光镜 汞灯
3、荧光显微镜的分类：
3.1.透射荧光显微镜：
光源：高压汞灯或卤素灯。 聚光镜：使用暗场聚光镜，使激发光和荧光分离出来。
物镜：可用任何种类的物镜。
标本：因为是透射观察，薄的标本比较适合。
丁达尔现象 斜向照明
2.操作方法（P14）
1. 安装暗视野聚光器（或挡板），放在普通显微镜的聚光器 下方。
2. 加香柏油：把被检样品的标本置于载物台上，并在聚光器 透镜的上表面滴香柏油 。向上缓慢调升聚光镜，使香柏 油与载玻片下表面缓缓接触。加香柏油的原因，避免照明 光线于聚光镜上进行全反射，达不到被检物体。 3. 聚光器光轴的调中：用低倍镜对样品聚焦，随之用聚光器 升降螺旋上下缓慢调节聚光器位置，当暗视野中清楚地窥 见一光环或圆形光点时停止什降聚光器，用聚光器调中杆 推动聚光器，把光环或光点调至视野中心； 4. 调节聚光器焦点，使之位于被检样品处，转动聚光器升降 螺旋，使视野中光环调成一最小的圆形光点，此刻聚光器 的焦点恰好位于样品处。
细胞生物学实验
汕头大学生物系 游翠红
本实验课共36学时，由12个实验组成。
实验内容ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1、特殊显微镜及其使用 2、线粒体和叶绿体的分离 3、巨噬细胞的吞噬实验 4、ACP、过氧化物酶等的显示 5、小鼠骨髓细胞染色体标本的制备 6、动物细胞染色体分带技术
实验要求
永久制片 —实验开始前细查张数及有无破损
用途：
1）利用样品的散射光和反射光进行观察，只能看到 物体的存在和运动，不能辩其细微结构；
2）可以看到许多细胞器的明亮轮廓，如细胞核， 线粒体、液泡等
3. 实验内容、材料与仪器
内容：口腔上皮细胞的观察 材料：口腔上皮细胞 试剂：蒸馏水 器材和仪器：载玻片、盖玻片、显微镜、牙签
二、相差显微镜
2、荧光显微镜的基本装置及其光路
2.1 基本装置 普通光学显微镜加附件： 1)荧光光源 2)激发滤片 3)双色束分离器 4)阻断滤片等 的基础上组成的。
荧 光 显 微 镜 内 部 构 造 （ 反 射 式 ）
2.2、光源：采用高压汞灯。
由于荧光和激发光相比，是非常微弱的，因 此荧光显微镜的光源强度必须很高，即使在近紫 外区，也必须有足够的强度。为了满足这些要求 ，通常采用高压汞灯。 使用中严禁频繁启闭，点亮后欲暂停使用时 ，不可切断电源，可用光阀阻断光路。
注意事项
物镜的数值孔径必须小于聚光器的数值孔径； 制作标本时所用的载玻片和盖玻片均应清洁无痕； 必须使用薄玻片(载玻片厚度约0.8~1.1mm，盖玻片厚 度约0.1mm)，否则会影响暗视野集光器斜射光焦点 的调节，如载玻片太厚，焦点只能落在载玻片内，就 不能看到物象；标本也不能过厚。 采用的光源宜强，一般均用强光灯照明。光线暗则物 象不清晰。