免疫组化-切片
免疫组化组织细胞的取材、固定、切片操作方法及要点
免疫组化组织细胞的取材、固定、切⽚操作⽅法及要点从⼤体标本上切除适量的组织材料进⾏研究就是取材。
取材不仅在免疫组化⽽且在常规病理检查中也⼗分重要。
⽤于免疫组化的组织⼀般取材⼤⼩为1．OcmXl．OcmX0．2cra。
取材时应剔除脂肪和钙化，否则会影响切⽚，出现假阳性或假阴性结果。
组织标本包括动物标本、⼿术活检标本、⼫体解剖标本及细胞标本等，有关各种标本的取材⽅法分述如下。
⼀、动物的致死法及取材(⼀)致死法(1)空⽓栓塞法向动物静脉内注⼊⼀定量的空⽓，使动物很快死亡。
⼀般适⽤⼤动物，例如兔、⽝、猫等动物。
(2)⿇醉法可将浸有⼄醚或氯仿(三氯甲烷)的棉球连同动物⼀起放⼈密闭容器内进⾏⿇醉，也可⽤4％戊巴⽐妥作静脉注射，或⽤20％氨基甲酸⼄酯做腹腔注射。
适⽤于⿏等⼩动物。
(3)断头法⽤剪⼑剪去动物的头部，待⾎液流出后⽴即取材。
适⽤于⼩动物。
(4)去头法⽤重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。
(5)股动脉放⾎法动物⿇醉后，切开股动脉放⾎致死。
(⼆)取材注意事项(1)最好在动物⼼脏还在跳动时⽴即取材，并迅速投⼊环保组织固定液内。
脏器的上⽪组织易变质，争取在死后半⼩时内取材完毕，否则免疫组化染⾊时会产⽣背景染⾊。
(2)切取组织使⽤的⼑、剪要求锋利，避免来回挫动组织。
因动物组织质脆，因此夹取组织时切勿⽤⼒过重，以免挤压损伤组织。
⼆、⼫体解剖的取材⼫体解剖的取材应根据实际需要进⾏，⼀般取材部位和数量如下。
(1)⼼和⼤⾎管右⼼室⼀块，左⼼室⼀块，主动脉⼀块，取材部位可在距主动脉瓣5cm处。
(2)肺右下叶⼀块，切成正⽅形；左下叶⼀块，可切成长⽅形。
(3)肝右叶⼀块，切成正⽅形；左叶⼀块，切成长⽅形。
(3)脾⼀块。
(4)胰⼀块。
(6)肾两肾各⼀块，包括⽪质、髓质和肾盂。
右肾⼀块切成正⽅形，左肾⼀块切成长(7)膀胱⼀块。
(8)肾上腺左、右各取⼀块。
(9)消化道⾷管⼀块，胃窦部⼀块，⼩肠⼀块，淋巴结⼀块，直肠⼀块。
(10)⾻脊椎⾻⼀块。
免疫组化操作流程
免疫组化操作流程免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测细胞或组织中是否存在其中一种抗原或蛋白质，并进一步定位其在细胞或组织中的分布情况。
下面是免疫组化的一般操作流程：1.样本制备：a.细胞培养：对于体外培养的细胞，将其定植在培养皿中，使其附着在载玻片上。
b.组织切片：将组织固定、石蜡包埋后，用切片机将其切割成小片。
2.抗原修复：a.细胞：用4%的甲醛或冰醋酸将细胞固定，然后用PBS（磷酸缓冲盐溶液）进行洗涤。
b. 组织：将石蜡包埋的组织切片用xylene去除石蜡，并通过一系列浓度递减的酒精进行洗涤。
3.抗体选择和制备：a.选择合适的一抗体与待检测的目标蛋白或抗原有特异性结合。
b.对于小分子抗原，可以直接用抗体进行染色。
对于较大的蛋白质抗原，需要通过特殊方法将抗体标记。
4.抗体染色：a.细胞：将细胞孵育在含有一抗体的PBS中，并进行特定时间的孵育，然后通过洗涤去除未结合的抗体。
b.组织：将抗体加到待检的组织切片上，经过适当的孵育时间，然后通过洗涤去除未结合的抗体。
5.反应显色：a.一抗染色：根据抗体的结合情况，选择适合的检测方法，如发光、颜色显现等。
b.二抗染色：对于无法直接检测的一抗染色结果，需要加入二抗，二抗可以与一抗特定的Fc部分结合，形成复合物。
二抗通常被标记为酶，可以与底物反应产生颜色或发光。
6.显微镜观察：a.细胞：将染好的细胞载玻片通常先底片固定，然后在显微镜下观察并拍照。
b.组织：将染好的组织切片在载玻片上，然后将其加入显微镜下观察，并通过摄影或记录图像。
7.数据分析和结果解读：a.根据具体的研究目的，对显微镜下观察到的结果进行统计和分析。
b.根据染色的结果和显微镜下观察到的细胞或组织分布情况，对目标蛋白或抗原的表达进行解读。
总结：免疫组化是一种重要的实验方法，可用于检测和定位细胞或组织中的目标蛋白或抗原。
操作流程包括样本制备、抗原修复、抗体选择和制备、抗体染色、反应显色、显微镜观察、数据分析和结果解读。
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
一、石蜡切片免疫组化技术
石蜡切片免疫组化方法是一种流行的染色技术，它利用抗原特异性抗
体结合抗原将一种特定蛋白质标记出来，然后对组织交叉剥离切片进行染色，得到对特定抗原的特异性染色，进而可以测定组织中其中一蛋白质的
分布情况及其表达水平。
石蜡切片免疫组化方法主要分为热稳定抗原抗体
保护法、热稳定化学法和抗原保护法三种。
1.热稳定抗原抗体保护法
热稳定抗原抗体保护法又称抗原连接法，它是最常用的一种免疫组化
技术，依赖高温对抗原的特殊保护作用。
其原理是经过化学固定的组织切片，在石蜡上产生隆起；然后用高温阳性抗体（双抗体）将抗原完全覆盖，并产生痕迹，这样便可清楚地观察抗原的分布情况；此外，在有抗原保护
的条件下，抗原保护的组织切片可以用客体抗体染色。
2.热稳定化学法
热稳定化学法是一种特殊的抗原保护法，也是最常用的石蜡免疫染色
技术。
免疫组化技术在制作病理组织切片中的应用价值分析
免疫组化技术在制作病理组织切片中的应用价值分析随着医学科学的不断发展，病理诊断成为了临床医学中不可或缺的一部分。
病理组织切片是一种常见的临床检测手段，可以通过镜下观察组织的结构和形态，帮助医生进行疾病的诊断和治疗。
而免疫组化技术则是在病理组织切片中起着重要作用的一种技术手段，它利用特定的抗体对组织中的特定分子进行标记，能够帮助医生进行更加准确的诊断和鉴别诊断。
本文将从应用价值的角度对免疫组化技术在制作病理组织切片中的应用进行分析。
一、提高病理诊断的准确率免疫组化技术能够对组织中的特定分子进行标记，如细胞膜标记物、细胞核标记物、细胞质标记物等，通过观察这些标记物的表达情况，可以帮助医生对疾病进行准确的诊断和鉴别诊断。
在癌症的诊断中，免疫组化技术可以帮助医生鉴别肿瘤的来源、类型和分化程度，对于一些难以鉴别的疾病，免疫组化技术可以提供更加准确的诊断依据，从而提高病理诊断的准确率。
二、指导疾病治疗方案的制定除了对疾病进行准确诊断外，免疫组化技术还可以帮助医生对疾病的预后进行评估，这对于指导疾病的治疗方案制定非常重要。
在肿瘤的治疗中，免疫组化技术可以帮助医生对肿瘤的分子表达特征进行分析，从而指导精准治疗的制定，包括靶向治疗、免疫治疗等。
通过对疾病治疗的指导，可以使患者获得更加有效的治疗效果，减少治疗的不必要性和副作用。
三、研究疾病的发病机制和预后预测免疫组化技术在疾病的发病机制和预后预测中也发挥着重要作用。
通过对特定分子的表达情况进行分析，可以深入了解疾病的发病机制，揭示疾病发生、发展的规律，并为新药研发和个性化治疗提供理论依据。
免疫组化技术还可以帮助医生对患者的预后进行预测，对于一些预后不明确的疾病，可以通过免疫组化技术对患者的分子表达情况进行评估，为临床预后判断提供客观依据。
四、开启个性化医疗的新时代随着精准医学的不断发展，个性化医疗成为了医学发展的新趋势。
而免疫组化技术的应用为个性化医疗提供了重要的技术支持。
免疫组化的原理及试验步骤
免疫组化的原理及实验步骤一免疫组化的原理免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
二免疫组化的实验步骤固定１．浸入式：将组织样本直接放入固定液（4%的多聚甲醛等固定液）内，4℃浸泡2小时，不超过12小时２. 灌注式：主要适用于脑部组织，用从心室灌注生理盐水排空血管中血液后灌注固定液切片1.石蜡切片：(1) 使用从低浓度到高浓度的乙醇使组织脱水；(2)将组织浸入二甲苯中透明；(3)在溶蜡箱中，组织被石蜡包埋；(4)将包埋好的蜡块冷却后固定于切片机上，切成薄片，并将薄片贴于玻片上；(5)用二甲苯脱蜡并重新从高到底浸泡乙醇；注意：石蜡切片制备好后还需要进行抗原修复以解开被甲醛交联的抗原决定簇上的氨基或羧基，常用方法有微波热修复，煮沸热修复，酶消化方法２. 冰冻切片：将固定的组织放入液氮或干冰-丙酮中迅速冷却，然后切片机切片，并将片贴于玻片上封固1.防止脱片，可以使用树脂胶或多聚赖氨酸进行黏附。
2.避免内源性过氧化酶的影响，可以用3%双氧水处理15min,(针对用过氧化酶标记的抗体)3.避免内源生物素的影响，可以鸡蛋清或卵白素进行封闭；4.避免非特异性染色，可以用二抗来源的血清进行封闭染色1.滴加稀释后的一抗，4℃过夜，PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；2.滴加稀释后的二抗，37℃孵育30min,PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；显色：选择与二抗配套的显色系统，进行反应，PBS终止反应后，用苏木素村然胞核，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，37℃干燥48小时，显微镜下观察。
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
免疫组化染色切片优良率标准
免疫组化染色切片优良率标准免疫组化染色技术是一种广泛应用于生物学和医学领域的实验技术，其主要用于研究生物组织的特定蛋白表达情况。
为了确保实验结果的准确性和可靠性，需要对免疫组化染色切片的优良率进行评估。
以下是一些评估免疫组化染色切片优良率的标准：1.染色效果染色效果是评估免疫组化染色切片优良率的重要指标之一。
优良的染色效果应该具有颜色鲜艳、对比度适中、背景清晰等特点。
如果染色效果不佳，会导致蛋白表达的信号弱或者无法区分阳性细胞与阴性细胞。
2.定位准确性免疫组化染色切片的另一个重要指标是定位准确性。
通过对特定蛋白在组织中的定位，可以了解其在生物组织中的分布和作用。
如果定位不准确，会使得对蛋白分布和作用的判断产生误差。
3.细胞形态完整细胞形态的完整性对于免疫组化染色切片的优良率也是非常重要的。
优良的切片应该具有清晰的细胞轮廓和完整的细胞结构，这有助于对蛋白的表达进行准确的判断。
4.抗原抗体结合特异性抗原抗体结合的特异性是免疫组化染色技术的重要基础。
优良的免疫组化染色切片应该具有高特异性的抗原抗体结合，即只有目标蛋白与相应的抗体结合，而非其他蛋白。
5.切片制备质量切片制备的质量直接影响到免疫组化染色切片的优良率。
优良的切片应该具有厚度适宜、边缘整齐、无裂痕等特点。
切片过厚或过薄都会影响对蛋白表达的判断。
6.阳性对照与阴性对照阳性对照和阴性对照的设置是免疫组化染色实验的重要环节，也是评估切片优良率的重要标准之一。
阳性对照应该显示出预期的蛋白表达信号，而阴性对照应该没有蛋白表达信号。
如果阳性对照或阴性对照不符合预期，说明实验存在误差，需要对实验条件进行优化或重新进行实验。
综上所述，免疫组化染色切片优良率的评估需要从多个方面进行考虑。
通过对染色效果、定位准确性、细胞形态完整、抗原抗体结合特异性、切片制备质量和阳性对照与阴性对照等方面的综合评估，可以较为全面地评价免疫组化染色切片的优良率。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
免疫组化——切片
包埋
1、剪取小鼠的整个耳部组织放入1XHBSS中，解剖出颞骨，放入4%PFA中固定（1ml
16%PFA+3ml 1XPBS），在颞骨的顶端打孔，用注射器分别从圆窗、椭圆窗处注射4%的PFA，shake 1-2h,4°过夜
2、如果小鼠大于8天，把颞骨放入0.5M EDTA中脱钙1-3天
P8-P15，1天
P15-P30，2天
大于P30，3天
3、1X PBST洗3次，每次3分钟
4、把颞骨转入15%的蔗糖溶液中，真空1h,4°过夜
5、把颞骨放入20%蔗糖溶液中，真空1h，之后转入30%蔗糖溶液中，真空1h，4°过夜
6、把颞骨放入50% 30%蔗糖溶液+50% OCT中，真空1h,4°过夜
7、把颞骨放入30% 30%蔗糖溶液+70% OCT中，真空1h,把颞骨放入15% 30%蔗糖溶液+85%
OCT中，真空1h,把颞骨放入100% OCT中，调整位置，圆窗、椭圆窗着地，真空1h,4°过夜
8、把放入100%OCT的颞骨继续真空1h,调整位置，放入冰冻切片机中速冻20min,再放入-80°
冰箱。
9、切片,切好的片子先放入-20°，过夜，再放入4°
实验前一天准备好玻片：用10%的多聚赖氨酸涂玻片，放在实验桌上晾干。
提前半小时调冰冻切片机：刀片温度和机内温度调至-20°，切片子时刀片要用新的，切好的片子在切片机的玻璃上烤30min-1h.当天切的片子一般第二天才可以用。
染色
1、挑选切好的片子，在staining box中用PBST洗涤3次（为防止sample脱落，每次都是先倒入PBST再放片子，洗完片子，用无纸屑的纸巾擦干玻片之后再加试剂）
2、用液体蜡画方格，先画出整体轮廓，再分成每个小格，每个小方格内加blocking medium
约50μl，RT,封闭1-2h（为了防止blocking medium挥发，湿盒里加有水）
4、把一抗加入PBT-1中vortex，每个sample 50ul ，4°overnight（蜡笔画的方格容易脱落，
每次加入试剂之前都要再重新画方格，玻片放在湿盒里，湿盒中加有水，以防一抗挥发）
3、PBST洗涤3次/5min
4、把二抗加入PBT-2中，每个sample 50ul ,1h（此步骤在黑暗的环境下操作，以防荧光淬
灭，玻片放在加有水的湿盒中）
5、PBST洗3次/5min,擦干（不要让sample过于干燥）
6、每个sample加半滴DAKO
7、盖上盖玻片，用指甲油封片。
1、100ml 16%PFA配制：称取
16g PFA加到84ml的1X PBS中
2、1L 0.5M EDTA的配制：186.1g EDTA溶于ddH2O中，调节PH至8.0，定容至1L
3、1000ml PBST的配制：10ml 10%Triton-100+990ml 1XPBS
4、300ml 30%蔗糖配制：90g蔗糖+210ml ddH20
5、10%Triton-10配制：500ml 1XPBS+56ml Triton-100 一抗：
SOX2 1:200
GATA3 1:1000
MYO7A 1:1000
二抗：
Cy5 1:200
FITC 1:400
TRIC 1:400。