灰葡萄孢菌的细胞形态观察及菌种保存
葡萄灰霉病，看完这些就够了
葡萄灰霉病，看完这些就够了最近走访很多葡萄园子发现，今年的灰霉病相当普遍而且还很难控制，所以今天就来跟大家探讨下葡萄的灰霉病。
葡萄灰霉病在世界上的任何葡萄园都可以发现。
葡萄灰霉病侵染葡萄，在产量和品质上都会造成影响，包括由于穗轴的干枯造成没有成熟的果穗或部分果穗的脱落，或干枯、缩水。
但是造成的危害因葡萄的用处不同而有差别。
对于鲜食葡萄，不但造成产量降低，而且在葡萄的贮藏、运输过程中继续腐烂，成为贮藏和运输过程中葡萄腐烂的罪魁祸首；对于酿酒葡萄主要是影响质量，混杂或含有灰霉病病果的葡萄酿造的葡萄酒，有怪味或味道欠佳，并且容易被氧化和被细菌感染，也不容易存放，影响葡萄的陈酿和年份。
一、症状在我国，灰霉病的发生危害包括花期、成熟期和贮藏期。
但冬季雨水多和春季多雨的地区，早春也侵染葡萄的幼芽、新梢和幼叶。
幼芽和新梢受害，成褐色病斑，导致干枯。
在晚春和花期，叶片上被侵染后会形成大的病斑，一般在叶片的边沿、比较薄的地方，病斑为不规则形状、红褐色在花帽脱落前（开花前至开花），病菌可以侵染花序，造成腐烂或干枯，而后脱落。
开花后期，病菌会频繁侵染逐渐萎篶的花帽、雌蕊和败育（或发育不完全）的幼果，这些花帽、雌蕊和败育的幼果如果遇到特殊气候，会黏贴在果穗或果粒上。
这样，病菌从这些黏贴的组织开始，侵染果梗和穗轴。
这些受感染的果梗和穗轴开始形成小型的褐色病斑，之后病斑颜色逐渐加重变为黑色。
在夏末，这些病斑发展成围绕果梗或穗轴一圈的病斑，导致果穗萎篶（有时脱落）（在气候干燥时），或产生霉成导致整个果穗的腐烂（气候湿润时）进入成熟期，灰霉病病菌可以通过表皮和伤口直接侵入果实。
比较紧的果穗，果实互相挤压，先通过相邻的果粒传染，然后霉层会逐渐侵染整个果穗。
白色品种被感染，果穗变成褐色，有色葡萄品种（户太八号葡萄）被感染，果穗变成红色。
如果气候干燥，被侵染的果粒干枯：如果气候湿润，果粒会破裂，并且在果实表面形成鼠灰色的霉层二、发病规律分生孢子在1～30℃都可以萌发（萌发的最适合温度是18℃），但要求有90%以上的湿度或有水分存在。
灰葡萄孢菌形态特征
灰葡萄孢菌形态特征嘿，朋友们！今天咱来聊聊灰葡萄孢菌的形态特征。
你看啊，这灰葡萄孢菌就像是一个小小的“神秘精灵”。
它的菌丝呢，细细长长的，就好像是一根根微小的丝线，在它们的世界里穿梭交织，编织着属于它们的“秘密网络”。
再说说它的分生孢子梗，那可是相当有特点哟！就像是一个个挺直了腰板的小士兵，直直地站立在那里，随时准备着执行什么神秘任务似的。
这些分生孢子梗的顶端还会产生分生孢子呢，那些分生孢子就像是一群小精灵们随身携带的“魔法粉尘”。
灰葡萄孢菌还有一个特别的地方，就是它产生的菌核。
这菌核呀，就像是一个小小的“能量球”，蕴含着不知道多少的秘密和力量。
你想想，一个小小的菌里面居然藏着这样的“宝贝”，是不是很神奇呢？这灰葡萄孢菌在我们的生活中可不算陌生哦，它有时候会在一些植物上出现呢。
要是你在花园里看到有些花朵或者果实上突然出现了一些奇怪的斑点或者腐烂的地方，说不定就是这小家伙在捣乱呢！哎呀，它可真是让人又爱又恨呀！你说它怎么就这么会“隐藏”自己呢？平时不注意还真发现不了它。
但只要它一出现，就会带来一些麻烦。
就像那调皮的孩子，总是在你不经意间搞点小破坏。
那我们怎么才能更好地了解和应对它呢？这就需要我们更加仔细地去观察它的形态特征呀，只有这样，我们才能在它出现的时候及时发现它，然后想办法对付它。
我们可不能小瞧了这灰葡萄孢菌的形态特征，它们就像是它的“身份证”一样，让我们能准确地认出它来。
而且通过研究它的这些特征，我们还能更好地了解它的生活习性和行为方式呢。
所以啊，朋友们，对于灰葡萄孢菌的形态特征，我们一定要重视起来呀！这可不是闹着玩的，这关系到我们身边的植物健康呢！要是我们不好好了解它，那它岂不是要在我们的眼皮子底下“为所欲为”啦？难道我们就眼睁睁地看着它捣乱吗？那肯定不行呀！我们要行动起来，和这灰葡萄孢菌好好“斗一斗”！原创不易，请尊重原创，谢谢!。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法
微生物菌种的保藏是非常重要的，因为这些菌种可能用于各种实验和研究中。
以下是一些常见的微生物菌种保藏方法：
1. 冷冻保存：将菌种在液氮或-80的冰箱中冷冻保存。
这是最常见的保藏方法，能够长期保存菌株并保持其遗传稳定性。
2. 干燥保存：将菌种在无菌室中取出，用无菌纸或吸水纸吸干，然后放入无菌瓶中密封保存。
干燥保存适用于某些孢子或芽孢的微生物，比如放线菌、链霉菌等。
3. 明胶斜培养基保存：将菌种接种在含有明胶的固体培养基上，然后密封保存。
这种方法适用于某些菌株，如革兰氏阳性菌和厌氧菌。
4. 低温保存：将菌种保存在4的冰箱中。
这种保存方式可以在短时间内保持菌株的活性，但不能长期保存。
5. 液氮保存：将菌种在锅内预冷冷冻过的无菌玻璃管中加入10%甘油或蔗糖，然后立即在液氮中保存。
这种方法适用于大多数微生物，并且可以长期保存。
食用菌类栽培中的菌种保存与管理
食用菌类栽培中的菌种保存与管理菌种保存与管理在食用菌类栽培中起着至关重要的作用。
正确的保存和管理方法能够保证菌种的活力和纯度，从而提高菌丝的生长速度和产量。
本文将介绍几种常用的菌种保存与管理的方法。
一、菌种保存方法1. 冷冻保存法：冷冻保存是目前常用的一种菌种保存方法。
首先，将需要保存的菌种培养在含有适宜营养物质的琼脂平板上，进行培养。
然后，选择菌落良好、生长健壮的菌株进行保存。
将菌株切取一小块，放入无菌的保存管中，加入适量的冷冻保护剂，如甘油或乳糖。
最后，将保存管密封并放入低温冷冻箱中保存。
2. 雪藏保存法：雪藏保存也是一种常见的菌种保存方法。
首先，将需要保存的菌种培养在琼脂平板上。
然后，将培养好的菌落切取一小块，放入无菌的冰醋酸纤维素管或PCR管中。
接下来，将菌种在-80℃的环境中迅速冷冻至冰冻状态。
最后，将冷冻好的菌种保存在液氮罐中。
3. 干燥保存法：干燥保存法适用于某些特殊的菌种，可以有效地保护菌种的特殊形态。
首先，将需要保存的菌株培养在琼脂平板或液体培养基中。
接着，取一部分菌株，在无菌环境下置于无菌纸上，用干燥器或者通风处进行干燥。
最后，将完全干燥的菌株保存在无菌瓶中，密封保存。
二、菌种管理方法1. 菌种记录：在食用菌类栽培中，菌种管理的第一步是建立完整的菌种记录。
每个菌株需要有唯一的编号，记录培养的来源、传代次数、保存方法等信息。
同时，应建立菌种保存的数据库，记录每个菌株的详细信息，以便随时查询和管理。
2. 菌种传代：菌种的传代是菌种管理的重要环节。
传代是指将菌株从一个培养基转移到下一个培养基的过程。
在传代过程中，应注意消毒操作，避免外界的污染。
同时，要确保传代的菌株与原始菌株保持一致，不出现突变。
3. 菌种保持：对于长期保存的菌株，应定期复苏和保持活力。
通过以上介绍的保存方法，可以将菌株保存在恰当的条件下。
定期检查保存的菌株，保证其活力和纯度。
如果有发现菌株衰弱或受到污染的情况，应及时更换或重新培养。
灰葡萄孢菌的细胞形态观察及菌种保存
野生型与突变型灰葡萄孢菌的细胞形态观察及菌种保存1.实验目的通过灰葡萄孢菌的培养实验，观察灰葡萄孢菌生长过程中菌丝形态的变化及孢子的萌发过程；通过对灰葡萄孢菌孢子的活化与复壮，保存活力强的菌种。
2.实验内容野生型及突变体灰葡萄孢菌的培养、菌丝形态的观察；野生型及突变体灰葡萄孢菌的活化、复壮及保存。
3.实验材料3.1实验菌株灰葡萄孢菌是从典型的患灰霉病的番茄上分离并进行了单孢培养，由浙江大学农业与生物技术学院李红叶教授实验室提供；灰葡萄孢菌突变体由本实验室通过紫外诱变获得。
3.2仪器电子天平，高压灭菌锅，酸度计，蒸馏水器，超净工作台，恒温培养箱，显微镜3.3 试剂PDA培养基：称取马铃薯200g，洗净，去皮，切成小块，加入1000ml水中煮沸30分钟，再用纱布过滤煮过的马铃薯，弃残渣，在滤液中加入蔗糖20g，1.5%琼脂粉，充分溶解，再用蒸馏水定容至1000ml，分装三角瓶，置高压蒸汽灭菌锅中，0.1Mpa的大气压、121℃条件下，灭菌20min，室温冷却待用。
4 .实验方法与步骤4.1血球计数板的使用血球计数板是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，总共400小格。
(1)将孢子从培养皿的菌丝上洗下来。
(2)稀释孢子至每小方格内含有4-5个孢子为宜,一般稀释10倍即可。
(3) 将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专用的盖玻片。
(4)将稀释后的孢子悬液,用移液器吸取一滴置放大后的计数室于盖玻片的边缘,使孢子悬液液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,稍待片刻,使孢子悬液全部沉降到血球计数室内。
(5)计数时,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的细胞数。
(6) 位于大格线上的孢子,一般只计数大方格的上方和右方线上的孢子(或只计数下方和左方线上的孢子)。
(7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数。
细胞数/ml=(80小格内的细胞数/80)×400×1000×稀释倍数。
实验三菌种保存及细菌形态观察分解
二、革兰氏染色法
1.制片：取菌种培养液（大肠杆菌、金黄色葡萄球 菌）常规涂片，干燥，固定（涂片不宜过厚； 火焰固定不宜过热）
2.初染：滴加结晶紫，染色1－2min，水洗 3.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，
水洗 4.乙醇脱色：滤纸吸去残水，倾斜玻片用95％乙醇
洗涤脱色至无色，立即水洗（20s－30s） 5.复染：番红液复染约2min，水洗 6.镜检：革兰氏阳性菌（蓝紫色），革兰氏阴性菌
一．液体培养基接种
二．穿刺接种
1.细菌
形态观察主要包括群体的形态和个体的形态观察。 细菌的基本形态主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类， 近年还发现星状和四方形细菌等。细菌形态受培养时 间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等发生 变化。 细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小， 质地颜色均匀，同培养基结合不紧密。 细菌个体微小，较透明，必须染色方可呈现。根据细 菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为3种类型： 简单染色、鉴别染色、特殊染色。
实验内容
一.菌种保存 二.简单染色法 三.革兰氏染色法 四.芽孢染色法
菌种保培养基上。
配制牛肉膏蛋白胨培养基每班配制500ml，每组分装2支试管，摆斜面。 1.接种前用记号笔在距试管口2－3cm位置上，注明菌名、接种日期等。 2.将试管放于手掌中，并用手指夹住，使两支试管呈“V”字形。 3.用火焰将接种环烧红，然后将接种环来回通过火焰数次。 4.用小指、无名指和手掌拔下试管塞，并持于手中。 5.将试管口在火焰上微烧一周。 6.将烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基 部分，使其冷却， 以免烫死菌体，然后用环在菌苔上轻轻地接 触，刮下少许培养物，并将接种环慢慢的从试管中抽出，并迅速 地伸入另一试管中，在斜面上划线（波浪或直线），使菌体沾附 在培养基上。 7.将接种环抽出，灼烧管口。 8.塞上棉塞。 9.将接种环经火焰灼烧灭菌。
灰葡萄孢菌的形态特征
灰葡萄孢菌的形态特征最近又仔细研究了下灰葡萄孢菌，有了新发现。
先说说灰葡萄孢菌的菌丝吧。
这菌丝可挺特别的。
让我想想这个特征，它的菌丝是有隔菌丝呢。
就是像一根根小管子拼接起来似的，中间有隔断，就跟咱们盖房子时，一块块砖头砌起来中间有缝隙一个道理。
菌丝颜色呢，大部分时候是那种灰色的，就像那种很淡很淡的乌云的颜色，不过也不总是很标准的这个颜色，有时候感觉颜色会稍深或者稍浅一点，我之前还怀疑过是不是看错了呢。
再说说它的分生孢子梗吧。
这个分生孢子梗是细长细长的，从菌丝上长出来。
我一开始老是找不到这个分生孢子梗上头产生孢子的地方，因为它们太小了。
后来观察久了发现，在顶端会产生分生孢子。
好比是一个微型工厂的小烟囱，在烟囱顶部不断地释放着产品，这个产品就是分生孢子啦。
说到分生孢子，这分生孢子是那种卵形或者椭圆形，就像迷你版的小鸡蛋或者小橄榄似的，只不过超级超级小。
而且这些分生孢子是成串成串的，就像糖葫芦一样，挂在分生孢子梗的顶端。
我还发现有时候这灰葡萄孢菌会长在植物的叶片上，感染的叶片会出现那种不规则的病斑。
病斑周围的颜色和正常叶片对比可明显了，就像在一块碧绿的画布上突然被泼了一块脏灰色的颜料。
我还不确定这个病斑到底是怎么一步一步形成的呢。
是菌丝先入侵然后孢子再繁殖导致的，还是有别的原因。
另外，在有些环境下，灰葡萄孢菌的这些特征好像还会有点变化。
就比如说湿度比较大的时候，感觉菌丝的生长速度好像变快了。
我一直不太能确定是不是湿度造成的，不过对比了几次在干燥点的环境下，确实感觉湿度大的时候它的菌丝蔓延得更迅速些，就像是在肥沃的土地上比在贫瘠的土地上植物长得更快一样。
目前大概就是这些观察结果啦，以后要是有新发现还能再接着说。
葡萄灰葡萄孢生长及产孢条件研究
2021(2): 6-11 SINO-OVERSEAS GRAPEVINE & WINE葡萄灰葡萄孢生长及产孢条件研究李廷刚1，陈广霞1，张倩倩1，巩东营2*（1. 山东省葡萄研究院，山东济南 250100；2. 山东省农业科学院农产品研究所，山东济南 250100）摘要：灰葡萄孢（Botrytis cinerea）可引起葡萄灰霉病，严重影响葡萄产量和品质。
探索不同培养基、温度、光照、碳源、氮源等对葡萄灰葡萄孢菌丝生长和分生孢子产生的影响，以及菌丝与分生孢子的致死温度和时间，旨在探索灰葡萄孢生长及产孢的最佳条件。
结果显示，灰葡萄孢菌丝生长的最适培养基为PDA培养基，最适温度25 ℃；产孢最适培养基为MSM培养基，最适温度23 ℃；在培养基pH3～11范围内灰葡萄孢均能生长并产生分生孢子，菌丝生长和产生分生孢子的最适pH均为6；灰葡萄孢以葡萄糖和乳糖为碳源时生长速率和产孢量达到最佳，而蛋白胨则为灰葡萄孢生长和产孢的最佳氮源；菌丝的致死条件是50 ℃处理25 min或55 ℃处理10 min；分生孢子的致死条件是45 ℃处理30 min 或50 ℃处理10 min。
研究为葡萄灰霉病的有效防治及分子生物学研究提供理论依据。
关键词：葡萄；灰葡萄孢；菌丝生长速率；产孢量中图分类号：S663.1；S432.4 文献标志码：ADOI：10.13414/ki.zwpp.2021.02.002Study on growth and sporulation conditions of grape Botrytis cinereaLI Tinggang1, CHEN Guangxia1, ZHANG Qianqian1, GONG Dongying2*(1. Shandong Academy of Grape, Jinan 250100, China; 2. Institute Agro-Food Science and Technology,Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China)Abstract: Botrytis cinerea can cause grape gray mold and seriously affect the yield and quality of grapes. The effects of different media, temperature, light, carbon source and nitrogen source on the hyphae growth and conidia production of B. cinerea were explored, as well as the lethal temperature and time of hyphae and conidia. The aim was to explore the best conditions of B. cinerea for hyphae growth and conidia production. The result showed that the most suitable culture medium was PDA, the optimum temperature was 25 ℃ for hyphae growth. In the process of conidia production, the most suitable culture medium was MSM, the optimum temperature was 23 ℃. Within the pH range of 3-11, the hyphae could grow and produce conidia, optimum pH was 6 for hyphae growth and conidia production; when glucose and lactose as carbon source B. cinerea hyphae growth rate and conidia production quantity was best, while peptone as the best nitrogen source for B. cinerea hyphae growth and conidia production. The lethal conditions were50 ℃ within 25 min or 55 ℃ within 10 min for hyphae and 45 ℃ within 30 min or 50 ℃ within 10 min for conidia. Itcould provide a theoretical basis for the effective control of grape gray mold and molecular biology research.Key words: grape; Botrytis cinerea; hyphae growth rate; conidia production收稿日期：2021-01-06基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（31901866）作者简介：李廷刚（1989—），男，博士，主要从事葡萄病害综合防控研究。
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野生型与突变型灰葡萄孢菌的细胞形态观察及菌种保存
1.实验目的
通过灰葡萄孢菌的培养实验，观察灰葡萄孢菌生长过程中菌丝形态的变化及孢子的萌发过程；
通过对灰葡萄孢菌孢子的活化与复壮，保存活力强的菌种。
2.实验内容
野生型及突变体灰葡萄孢菌的培养、菌丝形态的观察；
野生型及突变体灰葡萄孢菌的活化、复壮及保存。
3.实验材料
3.1实验菌株
灰葡萄孢菌是从典型的患灰霉病的番茄上分离并进行了单孢培养，由浙江大学农业与生物技术学院李红叶教授实验室提供；灰葡萄孢菌突变体由本实验室通过紫外诱变获得。
3.2仪器
电子天平，高压灭菌锅，酸度计，蒸馏水器，超净工作台，恒温培养箱，显微镜
3.3 试剂
PDA培养基：称取马铃薯200g，洗净，去皮，切成小块，加入1000ml水中煮沸30分钟，再用纱布过滤煮过的马铃薯，弃残渣，在滤液中加入蔗糖20g，1.5%琼脂粉，充分溶解，再用蒸馏水定容至1000ml，分装三角瓶，置高压蒸汽灭菌锅中，0.1Mpa的大气压、121℃条件下，灭菌20min，室温冷却待用。
4 .实验方法与步骤
4.1血球计数板的使用
血球计数板是一个大方格分成25个中方
格，而每个中方格又分成16个小方格，总共
400小格。
(1)将孢子从培养皿的菌丝上洗下来。
(2)稀释孢子至每小方格内含有4-5个孢子为宜,
一般稀释10倍即可。
(3) 将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数
室上加盖专用的盖玻片。
(4)将稀释后的孢子悬液,用移液器吸取一滴置
放大后的计数室
于盖玻片的边缘,使孢子悬液液缓缓渗入,多余
的菌液用吸水纸吸取,稍待片刻,使孢子悬液全部沉降到血球计数室内。
(5)计数时,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的细胞数。
(6) 位于大格线上的孢子,一般只计数大方格的上方和右方线上的孢子(或只计数下方和左方线上的孢子)。
(7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数。
细胞数/ml=(80小格内的细胞数/80)×400×1000×稀释倍数。
4.2野生型灰葡萄孢菌的活化
取PDA 培养基在超净工作台内倒平板，培养基冷却凝固后将野生型和突变体灰葡萄孢菌
的菌种用接种环挑取少量分别放入各个培养皿中，记号笔标记菌种、接种时间，将培养皿放入28℃培养箱中倒置培养，第一次活化时间为一周，待其菌丝变为灰绿色长满平皿后，再按照上述方法进行二次活化。
4.3菌株的培养与观察
在紫外灯灭菌20min后的超净工作台中，对已制备培养基进行编号，并将已灭菌培养
基移取少许置于已备载玻片上制成固体培养基。
培养基凝固后将野生型灰葡萄孢菌孢子悬液
接种于已置培养基的载玻片上，为防止培养基干燥接种前可用移液枪移取适量灭菌水于培养
皿底部滤纸上，用记号笔作标记，记下接种日期与时间，将其置于恒温培养箱（28℃）中进
行培养。
培养期间每隔12h，重复上述操作，直至第六号培养菌培养12h后，打开培养皿盖，取出载玻片，将1至6号培养菌依次置于显微镜下观察并拍照。
观察野生型灰葡萄孢菌孢子
萌发、芽管、菌丝和菌落形态。
4.4灰葡萄孢菌孢子悬液的制备
活化后的灰葡萄孢菌再培养7天（28 ℃），待菌体产生孢子即可。
用无菌水洗菌体数次得到孢子悬液，孢子悬液用血球计数板计数，将孢子悬液的浓度稀释到2×105个孢子/ml待用。
4.5灰葡萄孢菌的复壮
选取四个大小相近、相对成熟、无损伤的番茄，在超净工作台内用解剖刀分别撕去一平方厘米区域大小的表皮，并在这些区域用分别接野生型和突变体灰葡萄孢菌孢子悬液，用记号笔分别标记（野生型CK,突变体TG)。
找一长方体或正方体盒子，去掉盖子用细线将其缠绕形成网状顶部，取适量无菌水倒至底部，将接有孢子悬液的番茄置于其网状顶平面，保鲜膜将其密封，于28℃下培养二至三天，观察菌种生长情况，并拍照。
5实验结果
通过观察野生型灰葡萄孢菌在培养基上的萌发状态，发现野生型灰葡萄孢菌生长12h
萌发长出单极性芽管，24h菌丝分支，36h后长满菌丝，分支增多， 48h时形成分生孢子头，部分开始散发分生孢子，60h时散发分生孢子，72h时分生孢子散发完，部分还在散发分生
孢子（图1）。
通过观察不同时段野生型灰葡萄孢菌在培养基上的菌落生长状态，发现24h
时培养基上无肉眼可见菌落长出，36h时有明显的菌落长出，48h长满整个培养基，60h长
至培养基边缘，72h有更多菌丝长出，菌落颜色加深（图2）。
野生型和突变体孢子侵染番茄，置室温下均有菌丝长出，说明两类孢子均具有侵染活性（图3）。
12h 24h 36h
图1野生型灰葡萄孢菌不同时段的细胞生长形态
图2 野生型灰葡萄孢菌不同时段菌落生长形态
图3野生型和突变体灰葡萄孢菌侵染番茄
48h 60h 72h
12h 24h 36h 48
h 60h 72h
A B。