反胶束萃取方法步骤

反胶束萃取
随着基因工程和细胞工程的发展，尽管传统的分离方法 （如溶剂萃取技术）已在抗生素等物质的生产中广泛应 用，并显示出优良的分离性能，但它却难以应用于蛋白 质的提取和分离。其主要原因有两个：一是被分离对 象—蛋白质等在40~50℃便不稳定，开始变性，而且绝大 多数蛋白质都不溶于有机溶剂，若使蛋白质与有机溶剂 接触，也会引起蛋白质有变性；二是萃取剂问题，蛋白 质分子表面带有许多电荷，普通手离子缔合型萃取剂很 难奏效。因此研究和开发易于工业化的、高效的系列化 物质分离方法已民为当务之急。反胶束萃取法就是在这 一背景下发型起来的一种新型分离技术。
当W0超过60（最大含水量）时，透明的反胶束溶液将 变浑浊，并发生分相。对于季铵盐形成的反胶束， W0一般小于3。在列平衡水相存在的情况下，W0可以 人为地在一定范围内调节。
9.2 反胶束萃取蛋白质的基本原理
9.2.1 三元相图及萃取蛋白质 对一个由水、表面活性剂和非极性有机
溶剂构成的三元系统，存在有多种共存 相，可用三元相图表示，如图10.5是水AOT-异辛烷系统的相图示例。
由于实验方法不同，所得的CMC值往往给于完全一致， 但是突变点总是落在一个很窄的浓度范围内，故用 CMC范围来表示更为方便。
表9.2是几种类型表面活性剂的CMC值，可以看出， CMC值与活性剂的结构有一定的联系。在非极性溶剂 中CMC值的变化范围是
1.0×10-4~1.0×10-3mol/L。
9.1.3 胶束与反胶束的形成
9.2.3 蛋白质溶入反胶束溶液的推动力与 分配特性
9.2.3.1 推动力 蛋白质溶入反胶束溶液的推动力主要包
括表面活性剂与蛋白质的静电作用力和 位阻效应。
（1）静电作用力
在反胶束萃取体系中，表面活性剂与蛋白质都是带电 的分子，因此静电相互作用肯定是萃取过程中的一种 推动力。其中一个最直接的因素是pH值，它决定了蛋 白质带电基团的离解速率及蛋白质的净电荷。
约为1nm，因此从几何角度来看，这一临界值是
合理的。
通常，反胶束溶液在W0>40，两相间界面 张力<0.2mN/m时，系统就不稳定了，因
此能用的反胶束最大半径Rm=6nm，所以 反胶束萃取适用于相对分子质量低于
100000（r=5nm）的蛋白质分子。
9.2.3.2 反胶束萃取中蛋白质的分配特性
当pH=pI时，蛋白质呈电中性；pH<pI时,蛋白质带正电 荷；pH>pI时，蛋白质带负电荷，即随着pH的改变， 被萃取蛋白质所带电荷的符号和多少是不同的。
因此，如果静电作用是蛋白质增溶过程的主要 推动力，对于阳离子表面活性剂形成的反胶束 体系，萃取只发生在水溶液的pH>pI时，此时蛋 白质与表面活性剂极性头间相互吸引，而pH<pI 时，静电排斥将抑制蛋白质的萃取，对于阴离 子表面活性剂形成的反胶束体系，情况正好相 反。
蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程，即在宏 观两相（有机相和水相）界面的表面活性剂层， 同邻近的蛋白质发生静电作用而变形，接着在两 相界面形成了包含有蛋白质的反胶束，此反胶束 扩散有机相中，从而实现了蛋白质的萃取，其萃 取过程和萃取后的情况见图10.6。
改变水相条件（如pH值和离子种类及其强度等） 又可使蛋白质由有机相重新返回水相，实现反萃 取过程。
1977年，瑞士的Luisi等人首次提出用反胶束萃取蛋白 质，但并未引起人们的广泛注意。直到80年代，生物 学家们才开始认识到其重要性，荷兰的Van’t Riet和 Dekker、美国的Gokelen和Hatton首先进行了反胶束萃 取蛋白质的研究。近年来该项研究已在国内外深入展
开，从所得结果来看，反胶束萃取具有成本低、溶剂
在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多 的 是 阴 离 子 表 面 活 性 剂 AOT （AerosolOT），其化学名为丁二酸-2-乙 基已基酯磺酸钠，结构式见图10.1。
这种表面活性剂容易获得，其特点是具有双链， 极性基团较小，形成反胶束时不需加助表面活性 剂，并且所形成的反胶束较大，半径为170nm， 有利于大分子蛋白质进入。
常使用的阳离子表面活性剂名称和结构如下：
– CTAB （cetyl-trimethyl-ammonium bromide） 溴化十六烃基三甲胺
– DDAB（didodecyldimethyl ammonium bromide） 溴化十二烷基二甲铵
– TOMAC（trioctylmethyl ammonium chloride） 氯化三辛基甲铵
实际上，似乎存在着一个临界水含量W临，当 W0>W临，水含量对蛋白质萃取充影响很小，而 当W0<W临时萃取率急剧下降。例如在CTAB-正 已醇-正辛烷系统萃取BSA实验时得到W临≈30， 由式（10.1）计算出Rm=4.48nm（取a0=0.6nm2）， BSA的流体力学半径r=3.59nm，再考虑水壳厚度
此外，离子型表面活性剂的反离子并不都固定在反 胶束表面，对于AOT反胶束，约有30%的反离子处 于解离状态，同时，在反胶束“水池”内的离子和 主体于水相中的离子会进行交换，这样，在萃取时 会同蛋白质分子竞争表面活性剂离子，从而降低了 蛋白质和表面活性剂的静电作用力。
另一种解释则认为离子强度（盐浓度）影响蛋白质 与表面活性剂极性头之间的静电作用力是由于离解 的反离子在表面活性剂极性头附近建立了双电层， 称为德拜屏蔽，从而缩短了静电吸引力的作用范围， 抑制了蛋白质的萃取，因此在萃取时要发尽量避免 后者的影响。
9.2.2 “水壳”模型 （Water-shell Model）
反胶束系统中的水通常可分为两部分， 即结合水和自由水。结合水是指位于反 胶束内部形成水池的那部分水：自由水 即为存在于水相中的那部分水。蛋白质 在反胶束内的溶解情况，可用水壳模型 作解释：大分子的蛋白质被封闭在“水 池中”，表面也存在一层水化层与胶束 内表面分隔开，从而使蛋白质不与有机 溶剂直接接触。
（2）位阻效应 许多亲水性物质、如蛋白质、核酸及氨基酸等，都可
以通过溶入反胶束“水池”来达到它们溶于非溶剂中 的目的，但是反胶束“水池”的物理性能（大小、形 状等）及其中水的活度是可以用W0的变化来调节的， 并且影响大分子如蛋白质的增溶或排斥，达到选择性 萃取的目的，这就是所谓的位阻效应。
反 胶 束 萃 取 中 的 W0 ， 随 表 面 活 性 剂 的 HLB增大而提高，对于离子型表面活性 剂，还与极性头所处环境的介电性能有 关，水溶液的介电常数K有影响，如下式 所示：
许多反胶束萃取的实验研究已经表明，随着W0的降低， 蛋白质的萃取率也减少，说明确实存在一定的位阻效 应。如有人用正已醇作助表面活性剂与CTAB一起形成 混合胶束来萃取牛血清蛋白（BSA），由于正已醇会 使池内溶液的ε减少从而使HLB减小，因此W0变小，使 BSA的萃取率降低，由于醇分子不带电荷，所以正已 醇含量对萃取率的影响，不可能是静电作用，而只有 是位阻效应（W0变化）所引起的。
9.1 反胶束溶液形成的条件和特性
反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。 反胶束（reversed micelle）是表面活性剂 分散于连续有机相中一种自发形成的纳米 尺度的聚集体，所以表面活性剂是反胶束 溶液形成的关键，应该首先介绍。
9.1.1 表面活性剂
表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲 油憎水的非极性基团两部分组成的两性分 子，可分为阴离子表面活性剂、阳离子表 面活性剂和非离子表面活性剂，它们都可 用于形成反胶束。常用的表面活性剂及相 应的有机溶剂见表10.1。
反胶束萃取过程的分配特性不仅取决于起始两相联系 结构和性能，并且随着蛋白质进入反胶束还会使反胶 束的结构发生变化，所以定量分子热力学模型的建立 既复杂又困难。根据上面介绍的“水壳”结构模型， 可提出一种唯象热力学模型。
假设一分子的蛋白质P与n个空胶束M作用，形成了蛋 白质-胶来自配合物PMn，其化学平衡式可写为：
当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶 液接触后，蛋白质及其他亲水物质能够通过螯 合作用进入此“水池”，由于周围水层和极性 基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会 造成失活。蛋白质的溶解过程和溶解后的情况 示意于图10.4中。
9.1.4 反胶束的形状与大小
从上可知，用于萃取蛋白质等生化物质的胶束是反胶束， 反胶束的形状通常为球形，也有人认为是椭球形或棒形； 反胶束的半径一般为10~100nm，可由理论模型推算， 计算公式如下：
Rm 3W0 MW / aau N a W
式中 MW、ρW分别为水的相对分子质量和密度；Na为 阿伏伽德罗常数； aau为表面活性剂，在室温下， aau=0.5~0.7nm，并可近似认为是一常数；
W0为每个反胶束中水分子与表面活性剂 分子数值的比值，假定表面活性剂全用 于形成反胶束并忽略有机溶液中的游离 水、则W0等于反胶束溶液中水与表面活 性剂的摩尔浓度比值：
水壳模型很好地解释了蛋白质在反胶束内的状况， 其间接证据较多，
①从似弹性光散射的研究证实在蛋白质分子周围至少存 在一个单分子的水层；
②a-糜蛋白酶在胶束中的荧光特性与主体水中很相像； ③反胶束中酶所显示的动力学特性接近于主体水中等，
这些事实都有力地支持了水壳模型。
此外，尚有几种别的解释模型，但以水壳模型证 据最多，也最为常用。
P nM PM n
反应达到平衡时，其平衡常数Ka为：
W0≈[H2O]/[Surfactant]。
在反胶束溶液与水相平衡的情况下，W0值取决 于表面活性剂的种类、助表面活性剂、水相中 盐的种类和浓度等等。
对AOT/异辛烷/H2O体系
当W0=50时，反胶束的流体力学半径为18nm，每个反 胶束中的表面活性剂分子数为1380，而极性核表面 的AOT分子的有效极性基团面积可达0.568nm2。
将阳离子表面活性剂如CTAB溶于有机溶 剂形成反胶束时，还需加入一定量的助 溶剂（助表面活性剂）。
反胶束的必要几何条件是堆砌率
(V/L)/a0>1