用反胶束萃取法提取与分离蛋白质和酶
蛋白质反胶束萃取
• 离子强度
离子强度过小时，表面活性剂与溶剂相无法形成反 胶束，而形成了稳定的乳液，使其无法用于蛋白质 萃取。 离子强度增大时，它会： 1. 使反胶束内的双电层变薄，减弱蛋白质与反胶束内 表面间的静电引力，从而减小蛋白质溶解度。 2. 减弱表面活性剂之间的斥力，使胶束变小，不利于 蛋白质的溶解进入。 3. 增大了离子向反胶束内的迁移，并取代蛋白质，使 蛋白质从反胶束中析出。
蛋白质的反胶束萃取
Outline
蛋白质概述
蛋白质的常见分离方法
蛋白质反胶束萃取的原理 蛋白质反胶束萃取的应用举例 蛋白质的选择性萃取
蛋白质
化学分析试剂
化工用催化剂 …… 蛋白质
蛋白质分离上的常见问题
1 2 3 4 对温度、溶剂等敏感，易变性失活 原料中目标蛋白成分浓度小 杂质含量高，成分复杂 种类繁多，批量的特异性分离比较困难
有机相 萃取，实质上是蛋白质在 水相和反胶束内微水相间 的分配过程
水相
反胶束萃取的驱动力
静电相互作用 空间相互作用 疏水性相互作用
• 表面活性剂种类和浓度
影响反胶束萃取的因素
表面活性剂的种类： 1. 阳离子表面活性剂对表富集负电荷的蛋白质有较大分配比。 2. 阴离子表面活性剂对表富集正电荷的蛋白质有较大分配比。 表面活性剂的浓度： 1. 表面活性剂浓度增大，有利于形成更多的反胶束，可以加 速蛋白质的萃取。 2. 通过调节水率 w0，即胶束内水和表面活性剂的比，可调 节反胶束的大小。反胶束体积越大，其对大分子蛋白质的 分配比越大。
水相
反胶束分离蛋白质举例
选择性反胶束萃取
向反胶束体系加入亲和配体后，可显著增强反胶束萃 取的选择性。 如对与刀豆球蛋白A的萃取，通过向反胶束中添加生 物表面活性剂octyl β-D-glycopyran（表面活性剂总量 的2-20%），作为参比的核糖核苷酸酶不受影响，而 刀豆球蛋白A与配体发生作用使其萃取效率显著提高。 对于抗生物素蛋白的反胶束萃取，同样可以通过加入 一些亲和配体，如带生物素标记的表面活性剂，使得 抗生物素蛋白更容易地进入胶束。 ……
反胶束体系在蛋白质萃取中应用的研究进展
4 反胶束体系萃取蛋白质的影响因素
蛋白质在反胶束中的增溶作用 。与蛋白质的表 面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用 、蛋白质 的疏水性以及反胶束的大小等因素有关 。任何对这 些性能产生影响的因素都将对蛋白萃取产生影响 。
411 体系组成
用于蛋白质分离的反胶束体系 可以 是离 子型 的 ,也 可 以 是 非 离 子 型 的 。其 中 研 究 最 多 的 是 以 AOT为代表的阴离子微乳体系 ,主要是因为 AOT形成 反胶束时不需加助表面活性剂 。但由于它不能萃取分 子量较大的蛋白质 ,其应用受到一定的限制 ,需进行改 性或加入某些表面活性剂进行复配 。如加入具有亲和 作用的生物表面活性剂 (磷脂等 )来改善萃取性能 。
312 纯化
D ekker[18 ]等用 TOMAC /异辛烷 +非离子型表面 活性剂反胶束体系 , 使 α- 淀粉酶的浓度提高了 l7 倍 ,收率达 85 % ;王金枝 [19 ]等用十六烷基三甲基溴化 铵 ( CTAB ) /正己醇 /正辛烷反胶束体系纯化胰蛋白
酶 ,商业用酶的纯化倍数最高为 1197 倍 ,粗酶为 7115 倍 ,且粗酶纯化后比活在 200U /m g以上 。
另外 ,许多反胶束萃取的实验研究表明 ,随着表征 水池大小的参数 w0 (反胶束中水与表面活性剂摩尔浓 度之比 )的降低 ,蛋白质的萃取率也减少 ,这充分说明了 位阻效应的存在。目前常用的阴离子表面活性剂 AOT 形成的反胶束 ,由于其胶束尺寸不够大 ,直接用于相对 分子质量较大的蛋白质的萃取时 ,萃取率不高 [15] 。
生物分离—补充反胶束
反胶束萃取法
参考：《生物物质分离工程》 第二版严希康主编P142
传统的分离方法，不适用蛋白质的提取和分离。
原因： ⑴蛋白质易变性 ⑵萃取剂问题，普通的离子缔合萃取剂很难奏效。
优点： ⑴具有成本低，溶剂可反复使用。 ⑵萃取率和反萃取率很高。 ⑶解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活。 ⑷能直接从细胞中提取蛋白质和酶。
影响因素2：离子强度对萃取率的影响
离子强度对萃取率的影响主要是由离子对表面 电荷的屏蔽作用所决定的
–I上升，反胶束内表面的双电层变薄，减弱了蛋白质 与反胶束内表面之间的静电吸引，从而减少蛋白质的 溶解度。 –反胶束内表面的双电层变薄后，也减弱了表面活性 剂极性基团之间的斥力，使反胶束变小，从而使蛋白 质不能进入其中。
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话题5：反胶束萃取体系及 其操作
1. 单一反胶束体系：由单一表面活性剂形 成，结构简单、反胶束体积较大适合等 电点较高，相对分子量较小的蛋白质分 离，如AOP/异辛烷体系 2. 混合反胶束体系：二种或二种以上 3. 亲和反胶束体系
蛋白质增溶于反胶束溶液 方法
注入法:直接向含有表面活性剂的有机相 注入浓缩蛋白质溶液.(主要用于水溶性蛋 白质) 溶解法:直接将蛋白粉加入到反胶团相.(多 用于 非水溶性蛋白质)
话题3：反胶束萃取蛋白质基本原理
1.三元相图
蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程。即
1. 在两相（有机相和水相）界面间的表面活性剂 层，同邻近的蛋白质发生静电作用而变形 2. 在两相界面形成了包含有蛋白质的反胶束，此 反胶束扩散进入有机相中
续
返 回
2.反胶束的萃取原理 1、 静电作用
反胶束萃取一般采用离子型表面活性剂（如 AOT、TOMAC、CTAB）制备反胶束，这些表 面活性剂所形成的反胶束的内表面带有负电荷 （如AOT）或正电荷（如TOMAC，CTAB）。 带有电荷的溶质与表面活性剂发生强烈的静电相 互作用，影响溶质在反胶束的溶解度，即影响两 相间的分配系数。
反胶束萃取
反胶束萃取技术在蛋白质分离和酶固定化上的应用和发展The application and development of Reversed micelle technology in protein separation and enzyme immobilization2011年10月6日反胶束萃取技术在蛋白质分离和酶固定化上的应用和发展摘要：反胶束是表面活性剂在有机溶剂中自发形成的与正常胶束结构相反的纳米尺度的一种聚合体。
反胶束可用于蛋白质的分离、酶的固定化等生物上的物质的分离，是一种新型的生物分离技术，本文就该技术的原理、方法、在以上物质分离上的应用及其最新研究进展进行介绍。
关键词：反胶束；萃取；蛋白质分离；酶固定化The application and development of reversed micelle technology in protein separation and enzymeimmobilizationAbstract: Reversed micelle is surfactants in organic solvents spontaneously formed with normal glue beam structure of the opposite of a kind of nanometer scale polymers. Reverse micelle can be used for protein separation, such as enzyme immobilization of the separation of biological material, a new type of biological separation technology, this paper the principle and method of this technology in the application of more substances separation, and the latest research on progress into introduction.Keywords:reversed micelle; extraction ; protein separation; enzyme immobilization1 引言传统的液-液萃取分离技术成本低，易于操作，已广泛用于多组分物质的分离。
反胶束萃取技术及其在植物蛋白质提取中的应用研究进展
反胶束萃取技术及其在植物蛋白质提取中的应用研究进展郭珍;陈复生;李彦磊;李润洁【摘要】Reverse micelle extraction is a new separation technique suitable for macromolecular separation and purification, and has broad application prospect in the extraction of biological active substances . In this paper, the meaning,reaction mechanism and the domestic and foreign research progress of reverse micelle extraction applied to plant protein extraction are summarized, the existing problems are reviewed.%反胶束萃取是一种适合生物大分子分离纯化的新型技术,在生物活性物质的萃取上有着广泛的应用前景.文章阐述反胶束萃取的含义、反胶束萃取蛋白质机理,并对近年来国内外有关反胶束萃取在植物蛋白质提取中的应用研究进行综述,对该领域目前存在的问题进行评述和展望.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2013(029)001【总页数】3页(P240-242)【关键词】反胶束;植物蛋白;萃取;注入法;固溶法;相转移法【作者】郭珍;陈复生;李彦磊;李润洁【作者单位】河南工业大学,河南郑州 450001;河南工业大学,河南郑州 450001;河南工业大学,河南郑州 450001;河南工业大学,河南郑州 450001【正文语种】中文反胶束萃取技术是继双水相萃取之后的一种适合生物大分子分离纯化的新型分离技术，该技术已经在食品工业、医药行业［1］，甚至纳米材料［2，3］的制备上得到了广泛的研究。
反胶束萃取技术及应用
蛋白质溶解模型：
蛋白质或酶在静电或疏水作用下溶解于反胶束微粒,其 溶解模型通常有以下三种形式: 一、 Luisi[ 2 ]的水壳模型认为,蛋白质分子的溶解导致 反胶束的尺寸增大; 二、Martinek[ 3 ]的诱导契合模型认为,当蛋白质分子 尺寸大于反胶束微粒时,表面活性剂可在蛋白质分子诱 导下重新分配,形成更大聚集数的胶束,使蛋白质溶于 其中; 三、固定尺寸模型[ 4 ]认为蛋白质分子等于或小于反 胶束微粒尺寸时,溶解后的反胶束尺寸不变。
结束语
随着生物技术及基因工程的发展, 开发研究适合多种用途的分离 方法显得日益重要。 反胶团萃取技术的发现, 是分离技术研究领域的一项突破。该技 术应用过程中, 较少使用毒性试剂, 对人体无害, 而且反胶团溶 液可反复利用, 亲和配体的引入, 还可提高目标物的萃取率及分 离的选择性。 近年来, 反胶团及与其他技术的结合, 显示了较大的应用潜力。 与传统的分离方法相比, 反胶团萃取技术还是一个相对年轻的领 域, 某些理论和方法都是针对具体的反胶团体系而言的, 目前可 利用的反胶团体系还相当有限, 给该技术的应用带来了局限性。 随着研究的深入, 有理由相信, 反胶团技术在生物化学、有机化 学、分析化学、药物化学和日用化学等领域的应用将更为广泛。
正常胶束：表面活性剂溶于水中, 当浓度超过临界胶 束浓度(CMC)时, 就会聚集在一起而形成正常胶束，亲 水基向外、疏水基向内。 反胶团: 是指当油相中表面活性剂的浓度超过临界胶 束浓度(CMC)后, 其分子在非极性溶剂中自发形成的亲 水基向内、疏水基向外的具有极性内核(polar core) 的 多分子聚集体(aggregates) 。 反胶束的形态： 反胶束的形态：球形或近似球形，也呈柱状。
反胶束萃取技术的产生背景
综合性实验五 用反胶束萃取技术提取胰蛋白酶
实验五用反胶束萃取技术提取胰蛋白酶目录1前言2 实验I3 实验II4 结论5 参考文献1 前言反胶束是表面活性剂在有机溶剂中自发形成的纳米尺度的一种聚集体。
表面活性剂是由亲水的极性头和疏水的非极性尾两部分组成的分子。
在反胶束系统中，表面活性剂的非极性尾端指向有机溶剂，极性头向内排列形成一个极性核，溶解水后形成“水池”(waterp001)。
此“水池”可以增溶蛋白质等大分子。
上世纪70年代开始，瑞士的Luisi等首次提出了用反胶束萃取蛋白质。
反胶束萃取具有成本低，可以重复利用的优点，所以具有广阔的工业应用前景。
目前，国内外对反胶束技术的研究取得了很大的进展。
Cortez等用CTAB反胶束体系从季也蒙假丝酵母组织中分离提取木糖还原酶，回收率近100％。
Su等从牛乳清中分离得到90％纯度的IgG。
FerreimMJ使用反胶束萃取技术成功地从黑曲霉中提取葡萄糖氧化酶。
2 实验I 反胶束萃取法提取胰蛋白酶的工艺研究2.1 实验目的和要求2.2 实验原理2.3 实验器材与试剂2.4 操作步骤2.4.1 反胶束相系统的萃取操作1不同pH值对萃取的影响（1）萃取。
分别吸取不同pH值的酶溶液和等体积含15%.............胰蛋白酶充分转移至反胶束团中。
（2）离心并测定酶活。
将充分混合的……………………….按下式计算萃取率：萃取率（E）=2不同KCl离子强度对萃取的影响（1）萃取。
分别吸取不同KCl浓度的酶溶液和等体积含15%.............胰蛋白酶充分转移至反胶束团中。
（2）离心并测定酶活。
方法同上。
2.4.2 反胶束相系统的反萃取操作（1）反萃取。
在萃取离心后的上层有机相………….使胰蛋白酶转入水相。
（2）离心并测定反萃液酶活。
按下式计算反萃率：反萃率(E’)=2.5 结果与讨论2.5.2 pH值对萃取和反萃取的影响在通常情况下，pH值对反胶束的萃取和反萃皆有很显著的影响，研究者们也经常通过pH值的调节以达到提高萃取率和反萃取率的目的。
实验七 反胶束萃取法PH对萃取率的影响
微水相中的分配萃取。 从原理上，可当做“液膜”分离操作的一种。 如下图所示 ：
反胶束萃取的动力来自于两方面： （1）静电作用：当溶剂所带电荷与表面活性相反时，
由于静电引力的作用，溶质易溶于反胶团，溶解 率或分配系数较大，反之，则不能溶解于反胶团 中。 （2）空间位阻作用：增大反胶束极性核的尺寸，以 减少大分子蛋白质进入胶核的阻力。
都有影响。 常用的溶剂有：烷烃类（正己烷、环己烷、正辛烷、
异辛烷等）。 有时也使用助溶剂，如醇类。可以调节溶剂体系的
极性，改变反胶团的大小，增加蛋白质的溶解度。
反胶体萃取技术的优点
(1)反胶束萃取具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反 萃取率都很高等突出的优点。
（2）反胶束萃取还有可能解决外源蛋白的降解，即蛋白质 (胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题，而且由于构成 反胶束的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，因此可用 于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。反胶束萃取技术为蛋 白质的分离提取开辟了一条具有工业开发前景的新途径
正常胶束：
表面活性剂的极 性头朝外，疏水
水
的尾部朝内，中
间形成非极性的
“核”
非极性“尾”
非极性的“核”
极性“头” 图a
（三）反胶束
若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使 其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚 集体，这种聚集体称为反胶束，其结构示意见图b。 在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性 的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极 性核。此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶 解水后，就形成了“水池”。
常用表面活性剂 表面活性剂的存在是构成反胶团的必要条件，
大豆分离蛋白提取方法总结
大豆分离蛋白提取方法总结作者：丽水天工环保1、酸沉碱提法。
这是一种传统的分离提取方法。
该法是利用大豆中大多数蛋白质在等电点(pH415) 时沉淀的特性,与其他成分分离,沉淀的蛋白质经调节pH 后溶解,因此称之为酸沉碱提法。
酸沉碱提的缺陷是: 耗酸、耗碱量大,废水处理费用高,产品收率低。
该分离提取方法有待改进。
但目前仍然是工业化生产的基本方法。
2、膜分离法。
根据大豆蛋白的分子量大小、形状及膜与大豆蛋白的适应性,选择膜材料和不同截留分子量的膜,对大豆蛋白提取液超滤分离,超滤净化,使非截留组分排除,达到符合标准的分离大豆蛋白液,接着将净化后的大豆蛋白提取液超滤浓缩到所需的浓度后出料,喷雾干燥成粉状大豆分离蛋白。
3、反胶束萃取分离法。
反胶束是表面活性剂在有机溶剂中形成的一种聚集体,其中表面活性剂的非极性尾在外,与有机溶剂接触,极性头在内,形成极性核,该核具有包含水溶液和溶解蛋白质的能力,因而可以用此含有反胶束的有机溶剂从水相中萃取蛋白质。
利用反胶束技术从全脂豆粉萃取大豆蛋白,可一次萃取50 %左右。
大豆蛋白萃取过程非常快,用非扩散模型解释较为合理。
该法需要的主要仪器有:自动水分测定仪、气浴恒温震荡器、离心机、凯氏定氮仪、分析天平、恒温磁力搅拌器和微量进样棒等。
影响反胶束萃取过程的主要因素有表面活性剂的种类及浓度、水相的pH 值、离子强度、温度等。
反胶束萃取技术的优点是:选择性高、操作方便、放大容易、萃取剂(反胶束) 相可循环利用、分离和浓缩同步进行。
其缺点是:蛋白质在现有反胶束体系中稳定性不高,导致萃取前后蛋白质的活性损失较大,因而制约其工业化应用。
4、反相高效液相色谱法这是对大豆蛋白中7 S 和11 S 球蛋白进行快速分离的一种方法。
在分离条件为40 ℃、流速1mL/ min 的条件下,9 min 可完成相应球蛋白的分离。
具体方法为:（1）试剂与试样。
乙腈(CAN) (HPLC 级) 、三氟乙酸( TFA) (HPLC 级) 、HPLC 级水用于移动相的制备。
反胶束萃取技术在提取分离生物制品中的应用
ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｔｒｅｎｄｓ ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＩＭＥ ｗｅｒｅ ｉｎｔ ｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ
ｒｅｖｉｅｗ ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｒｅｖｅｒｓｅ ｍｉｃｅｌｌｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
表 面 活性 分子 溶 于非 极性 溶剂 中达到 一定 临界 浓 度 时形成 的具 有 热力 学稳 定和 光学 透 明的极 性核 （极 性头 向 内、非 极性尾 向外且 中 间含 有微量水 ，形成 “微 水池 ”）纳 米 聚集体 ，即 为反胶 束。反胶 束溶 液呈 油 包水 结 构，组 成成 分 一般 包括 表面 活性 剂、有 机溶 剂及助 表面活性剂 。
２０１６年第 ２９卷第 ５期
粮食 与油脂
９
反胶束 萃取技术在提取 分离 生物 制品 中的应 用
范 景辉 ，李 志平 ，李 海燕 ，赵 玉梅 （牡 丹 江 医学 院红旗 医院 药学部 ， 黑龙 江牡 丹 江 １５７０１１） 摘 要 ：反胶束萃取技 术已广泛应用于提取分 离生物制品 ，如氨基酸、蛋 白质、酶 、核酸、抗 生素等。 主要介 绍反胶 束 形成 特 点 ，以及 其在 提 取 分 离生物 制品 中的应 用 、所 面临的 问题及 展 望 。 关键词 ：反胶束萃取 ；提取分 离；生物制品 ；应 用
反胶束 萃取技术 是 一种适 合生物 大分子 （如蛋 白 质 ）分 离纯 化的新 技术 ，研 究 主要涉 及萃 取工 艺和萃
取过程动力 学 两方 面 。萃取 工艺包括 前萃和反萃 ，前 萃 可将 目标 物从溶 液 中萃取 到反胶束 中，反萃则 将 目 标物从反胶 束中释放到水相 中。一般 反萃过 程的时间 较 前萃 长。影 响前 萃 因素有水 含 量 Ｗｏ（含水 量与 表 面 活性剂 摩尔比）、离子强度 、温 度、表 面活性剂种 类和 浓 度、有 机溶剂 种类 以及 ｐＨ等 。反 萃 的影响 因素 有 水相 ｐＨ和盐浓 度等。可通过控制影 响因素来优化 萃 取 工艺和研 究萃取过程 动力学 。近 年来 ，反 胶束萃 取 技术在 提取 蛋 白质 、氨基 酸、核酸 、抗生素等 生物物 质 中的应用逐渐 受到关 注。 ２．１ 反胶 束萃取技 术提取分 离蛋 白质