德国Leica Sp2激光扫描共聚焦显微镜
胞膜 电位 、流式标准小球定量 、染色体分类 、单细胞蛋
白质 组
学
、细胞分选
微
、
生
物活性
等
。
德国 Le ic a S p 2 激光扫描共聚焦显微镜
激 光 扫描 共 聚 焦 显 做镜 是 以 激光 作 为激 发 光源 ， 在传 统 光学 显 微镜基 础 上 采用共 轭 聚焦 的原理 ：
置 ， 对荧 光标记 样 本进行断层 扫描 ， 获得 高分辨率的光学 切 片 ， 并利用 计算机 对所 观察 的对 象进 行数!
B D F A C S v a n t a g e S E 流式细 胞仪
流式细胞仪是集 电子技术 、计算机技术 、激光技术 、流体理 论 于 一 体的先进细胞测量和分析仪器 ，f
处 于 快 速 流 动 液 体 中 的 细 胞 或 生 物 颗 粒 进 行 多 参 数 快 、 速 测 量 ， 定 量 分 析 和 分 选 。
最 强 大 和 最 灵 活 的 j I：具
2 0 0 8 年 ，本科室 流式细 胞 仪共完 成样 品测试 分析 6 0 0 余例 ， 总计 使用有效机 时达 3 0 0 小时 。 其耳 有 6 0 个 针 对 校 外 单 位 服 务 的 机 时 约 ， 5 0 多 个 校 内外 单 位 的 8 0 余 项 科 研 课 题 利 用 流 式 细 胞 仪 完 成 样
检 测 膜 电 位 等 _牛 理 信 号 的 改 变 ；测 定 细 胞 内 和 细 胞 问 物 质 的 流 动 和 运 输 ；蛋 白质 问 的 相 互 作 用 的 研 穷
因 此 激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 已 成 为 形 态 学 、 分 子 生 物 学 、 神 经 科 学 药 、 理 学 、 遗 传 学 等 领 域 中 新 一 代 强 ：
试任务，
我 们 充 分 利 用 B D F A C S v a n t a g e S E 流 式 细 胞 仪 能 进 行 细 胞 分 选 的 功 能 开 ， 展 了 很 多 分选 项 目 ( 如 ：
胞 分 选 、 基 因 转 染 细 胞 分 选 、 外 周 血 中 肿 瘤 细 胞 分 选 ) ， 成 为 重 庆 市 第 一 台 能 进 行 细 胞 分 选 的 仪 器 。 此 夕f
结 构 的荧 光 图 像 ， 可 在 亚 细 胞 水平 上 观 察 细 胞形 态 的 变 化 。 同时 系统配 有功能强 大 的软件包 ，可 以 对 !
及 分 子 的结 构 和 特 性 进 行 研 究 。 例 如 细 胞 三 维 结 构 的 重 建 ；动 态 测 量 细 胞 内 C a “ 、p H 值 和 自由基 的 砬
提 供 丁啦 大 的技 术支持 。我们还将开 展 FR A P 和 J
技 术 ，进 行胞 间通 讯 和膜 流动性 的检测 。
检 测 标 本 ：培 养 细 胞 ；组 织 切 片 ；细 胞 爬 片 。
自主 开 发
了细胞
内氧 化代谢 产物 (如
NO
R OS
、
) 等一
些 新 检测项 目。 将来还 准备利用 流式 细胞仪开 展J
胞蛋
白质组 学
染 色体分类 学
、
的研究
，
应用前景非常
广 l淘 。
检 测 对 象 ：细 胞 ( 包 括 癌 细 胞 、 全 血 细 胞 、 精 细 胞 、
组 织 匀 浆细 胞等 ) 、 生 物颗 粒 (包 括 细 菌 、真菌 、酵母 等
Байду номын сангаас
的研 究工 具 。
我 们充分 利用 L e ic a T CS S p2 激光扫描共 聚焦 显微镜 的各项功能 ， 已 经 开展 了很 多检测项 目。 如!
标记 物 的定位和定量 、细咆 3D 结构的重建 、动态{
细 胞 内 C a 的 。’ 变 化 、 膜 电 位 的 变 化
FRET
、
检测蛋 I
问 的 相互 作用 等 ， 为校 内外众 多科 研 课题 的顺 利!
像处 理 的一 套 观察 、分析和输 出系统 ? 激光 扫描共聚焦显 微镜具有非常广 阔的应用领域和应用前景 。
本 院 的 L e ic a T CS S p 2 激 光 扫描共 聚焦 显 微镜具 有 多 个荧 光通 道和 一 个透 色光通 道 ，可 以 同时采 ：
种 荧 光 信 号 和 透 色 光 信 号 ， 获 取 高 分 辨 率 、 高 清 晰 度 的 光 学 切 片 成 像 效 果 从 ， 而 得 到 细 胞 或 组 织 内部 {
B D F A C S V a m a g e S E 具 有 革 命 化 的 细 胞 分 选 功 能 其 ， 新 功 能 和 新 配 置 通 过 与标 准 多 激 光 、 多 荧 光 ： 以 及 数据处 理 系统 的完 美 整 合 ， 速 度更快 ， 功 能更 强 ， 是 当今 流式技 术 的最卓越体现 ，是通 往 发 现 之路 一
微生 物
)
、 蛋 白质
DNA
、
R NA
、
、染色体 以 及非生物颗 粒
等。
检 测 项 目 ：细 胞 周 期 、 细 胞 凋 亡 、 细 胞 倍 型 、 细 胞
表 型 、 淋 巴 细 胞 亚 群 、 血 小 板 活 化 率 血 、 小 板 转 染 率 、
细 胞 内颗 粒 、 细 胞 内 氧 化 代 谢 、 细 胞 内 钙 离 子 浓 度 细 、
激光扫描共聚焦显微镜
1、 选择好适宜的荧光探针。 原则上讲,无论是荧光素还是荧光标记抗体均 可用于LSCM 。如果打算用2种以上荧光标记物,要 注意它们是否激发光波长及发射光波长能区别开， 还要注意是否与LSCM的激发器相匹配，要根据现有 的激发波长来选择荧光标记物。
• 不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，故除综合 考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找 出最适的荧光探针。
6.观察活细胞、活组织：ＬＳＣＭ在不损伤
细胞的前提下，对活组织、活细胞进行观 察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期 处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观 察过的样品还可以继续用于其他的研究。 这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为 重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。
7. 生化成分精确定位观察配合专用的分子探 针，对于要检测的成分不仅可以定位到细 胞水平，还可以定位到亚细胞水平和分子 水平。
2015/6/12
激光扫描共聚焦显微镜：以激光作为激发光源，采用 光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫 描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统.
形态学研究：组织细胞 标本的抗原免疫荧光检 测，凋亡检测…
目的结构是用荧光探针标记的， 都可以用激光共聚焦显微镜观察
分子生物学：荧光原位杂交对DNA 和RNA定量，外源基因在真核细胞 的表达及定位，蛋白质相互作用 (FRET)…
4. 采 用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细小的激光 束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合成一个整体。传统的 光镜在场光源下一次成像，标本上每一点都会受到相邻点的 衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无 法相比的。
5.光电倍增管：检测设定范围内的光信号，并将光信号转换成 电 信号，相当于相机中的CCD或胶卷。 PMT只能检测到信号的强弱，不能记录信号的颜色，记录 的 结果通过信号强度和填充颜色表示。PMT单位用电压值V 表示，数值越大代表信号倍增越大，提高倍增会同时增加图 像的正常信号强度和噪声信号强度，使图像的信噪比下降。
激光扫描共聚焦显微镜操作流程详解
激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope)激光扫描共聚焦显微镜(laser sea nning con focal microscope)，英文简写LSCM，俗称con focal。
LSCM是一种高科技显微镜，属于最先进的细胞生物学分析仪器。
我们学院使用的是瑞士徕卡公司(Leica)的TCS SP5型号的LSCM。
使用流程1、登陆或5号楼606室公用电脑下载?激光共聚焦预约使用审核表?，打印并填写。
2、联系卢剑清(手机：)审核并签名。
3、持已签名的?激光共聚焦预约使用审核表? 至5号楼610室预约使用时间，及领取钥匙，联系人：窦凯飞(手机：。
4、在熟练使用者的指导下，进行实验。
5、实验结束，及时归还钥匙。
仪器构造和原理LSCM的根本结构主要包括荧光显微镜系统及样品台、激光发射器、扫描器、检测器、图像存储处理和输出设备、计算机控制系统。
激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源，普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。
而LSCM以激光为光源，激光具有单色性强、方向性好、高亮度、相干性好等优点,可以防止普通显微镜的缺点。
一般常用的气体激光器如氩(Ar)、氪(Kr)、氦(He)、氖(Ne)。
illu min ati ng pin hole (照明针孔)：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。
且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。
分光镜(BeamSplitter)：点光源发出的光经分光镜反射后，通过物镜在样品聚焦。
对标本内焦平面上的每一点进行扫描，Focal plane (焦平面)：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。
该光斑经过物镜和分光镜等一系列装置的处理，分别在照明针孔及探测针孔两处聚焦。
德国徕卡TCS SP5 II 激光扫描共聚焦显微镜系统资料
德国Leica TCS SP5 II 激光扫描共聚焦显微镜简介TCS SP5 II系统是德国徕卡仪器有限公司推出的新一代激光扫描共聚焦显微镜，具有高灵敏度(棱镜分光、狭缝扫描的专利技术，全无滤片、全光谱扫描)、高准确率（8192x8192的扫描分辨率；大扫描视野，均一性好；解决串色问题；专业的共聚焦物镜及校正系统；超精细Z轴扫描平台，可进行高精度XZ扫描）、高应用性（智能化的软件）的技术特色。
德国徕卡TCS SP5 II激光扫描共聚焦显微镜具有多种功能，它能够无损伤逐层扫描获取一维、二维及三维图像、多重荧光分离及重组成像、动态时间控制及快速扫描成像、荧光和时空参数定量测定等，因此该仪器常用于生物细胞或组织内的分子原位鉴定和定量、细胞及亚细胞结构形态学观察以及活体细胞或组织功能的动态监测，其在生命科学领域的分子水平、细胞及组织水平的研究中得到广泛应用。
激光扫描共聚焦显微镜主要有四部分组成：1、显微镜光学系统。
2、扫描装置。
3、激光光源。
4、检测系统。
整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
本实验室激光共聚焦显微镜的基本参数： 型号：德国Leica SP5 II激光器：4个发射波长400 nm-800 nm 物镜：10倍20倍63倍通道：多通道多色像素：可到达8192×8192像素系统：windows 7＋LAS AF活体细胞装置：配有基本功能：●多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集●无损伤、连续光学切片，显微“CT”●三维重组●定位、定量分析●时间序列扫描: xyt 、xyzt 扫描等●感兴趣区域扫描●图像处理功能多重荧光分离及重组成像三维图像重构成像活体细胞荧光染色的动态时间控制及快速扫描成像LEICA TCS SP5 II激光扫描共聚焦显微镜操作规程：1.打开显微镜电源开关，等显微镜初始化完毕。
2.打开扫描单元控制器电源开关。
3.打开激光器电源开关及打开激光器的启动钥匙。
Leica激光共聚焦显微镜
仪器功能介绍：
激光扫描共聚焦显微镜是利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察分析对象进行数字图像处理的一套观察、分析和输出系统，包括激光源、共聚焦显微镜、探测器、计算机以及图像输出设备。
它利用光电倍增管接收信号，计算机进行数字图像处理。
通过精细平面光切，
形成生物样品不同平面的精细图像，将一个连续的光切图像Z轴重叠就可形成
一个完整的三维图像。
适用于细胞生物学、细胞生理学、神经生物学和神经生理学等几乎所有涉及细胞研究的医学和生物研究领域。
应用的最大特点是对活细胞进行无损伤性的实时观察分析。
仪器主要技术参数：
1.配有四根激光器九条谱线：405nm、氩离子（442nm、458nm、476nm、488nm、496nm、514nm）、561nm、633nm。
2.配有两个高灵敏度HyD检测器。
3.配有活细胞工作站，可以进行活细胞观察。
4.配有FRET、FRAP、三维重建等分析软件。
5.能够进行xyz、xyt、xyλ等多种方式扫描。
仪器使用注意事项：
1.本台仪器需要预约，使用者请与平台相关人员联系，请不要擅自使用仪器。
2.本机需要专用的耗材进行观察，普通的培养板不能用于上机观察，请提前与相关人员联系。
激光共聚焦显微镜样品制备方法_一_细胞培养样品
第29卷第2期2010年4月电子显微学报Journal of Chinese Electron Microscopy SocietyVol-29，No.22010-04文章编号：1000-6281（2010）02-0185-04激光共聚焦显微镜样品制备方法（一）———细胞培养样品余礼厚（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海200031）摘要：随着激光共聚焦显微镜在生物学研究中的广泛应用，绿色荧光融合蛋白能够提供蛋白质在细胞体内的精确时空信息。
因此免疫荧光样品的制备也成为基本的细胞生物学实验方法。
本文主要介绍在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。
关键词：绿色荧光蛋白；细胞培养；免疫荧光；激光共聚焦显微镜中图分类号：Q336文献标识码：A收稿日期：2010-03-20作者简介：余礼厚（1982－），男（汉族），四川自贡人，博士，E-mail ：lhyu@.随着生物学研究的不断深入，越来越多的研究要求在细胞体内（in vivo ），甚至是动物体水平上研究蛋白质功能或动态变化。
而随着检测设备的提升、各种显微技术的发展和标记手段的提高，使得研究者能够迅速、准确地观察到蛋白质在细胞内的表达情况和定位。
通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记细胞内的蛋白质和分子，为生物学的研究提供了更直观的观测手段。
因此免疫荧光样品的制备也成为生物学研究中的基本技术方法。
鉴于生物体内的复杂多样性，制备免疫荧光样品的方法也存在一些差异。
本文主要介绍构建绿色荧光融合蛋白表达载体，并在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。
1绿色荧光融合蛋白表达载体的构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）及其突变体能在各种不同的生物系统中表达，这对细胞生物学的研究具有重要意义［1］。
而荧光蛋白的折叠能力及其同细胞内蛋白的融合能力，使研究者能直接在细胞体内观察到蛋白质的特性。
Leica激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册
可通过调节控制面板的“Z Position”旋钮找到最适合观察的焦平面（如 下图）；或者调节遥控手轮或显微镜镜体上的调焦旋钮（见第 8 页图）。
图像亮度动态范围可通过调节激光输出功率（见第 9 页图）、Smart Gain 和 Smart Offset（见上图）。
针孔大小：默认值为 1AU。如果样品的荧光非常弱，可通过增大针孔直 径来增加信号强度，所获取图像的光切厚度也会随之增加。
平均：用于降低背景噪音。分为线平均(Line average)和面平均(Frame average)，可在下拉菜单中选择平均的次数。
累加：仅用于荧光非常弱的样品
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2.4.3 预览图像
物镜选择按钮 预览按钮 Live 拍摄按钮 叠加图像显示按钮，在使用两个或以上数量通道拍摄多色图像时，用于显示 所有通道叠加后的图像
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2.3 在显微镜下观察样品
2.3.1 选择物镜：可通过显微镜主机右侧的物镜转换按钮，或软件中的“Objectives” 键进行选择。（如下图）（注意：有时，显微镜主机上的物镜转换按钮不能在干镜 和油镜或水镜之间切换，软件中都可以切换）
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2.3.4 观察完毕后，按显微镜前面板上的“SHUTTER”按钮以保护样品
2.4 采集共聚焦图像 2.4.1 光路设置：
调用已有的设置：选择“Load/Save single setting”下拉菜单中已有的设置，激光波长及 其输出功率、分光镜、检测波长范围、检测器 gain 及 offset 都会自动设置，包含几种最常用 的荧光染料。选择某一设置后，可按样品的实 际情况对参数进行优化(如后述)，并以新的名 称保存。（如右图）
LeicaSp2共聚焦操作手册
Leica TCS SP2 激光共聚焦显微镜系统操作手册一、荧光显微镜Leica DMRE的使用A：步距调节B：电动升台按钮C：电动降台按钮D：微调E：上限设置F：下限设置1、观察、扫描转换拉杆2、卤素灯开关3、透射光探测器开光横档4、荧光光路开关5、荧光滤镜转盘1：DAPI；2：TRITC；3：FITC；4：SCAN6、镜头侧DIC棱镜转盘7、与镜头相配DIC滤块8、起偏器9、检偏器10、镜头侧DIC棱镜微调旋钮11、光强调节纽12、减光滤光片13、孔径光阑14、视场光阑选择合适的镜头Leica TCS SP2 镜头配置镜头类型使用介质放大倍率/数值孔径编号HC PL APO CS DRY 10X /0.4 506511HC PL APO CS DRY 20X/ 0.7 506513HC PL APO CS DRY 40 X 0.85/ CORR 506140HC PL APO Ibd.BC OIL 63X /1.4 506192Leica TCS SP2 AOBS 镜头配置镜头类型使用介质放大倍率/数值孔径编号HC PL FLUOTAR DRY 10X/0.3 506505HC PL FLUOTAR DRY 20X/0.5 506503HCX PL APO OIL 40X/1.25-0.75 506176HC PL APO Ibd.BC OIL 63X/1.4 506192 HCX PL APO CS OIL 100X/1.40-0.70 506038 WATER HCX APO L U-V-I WA TER 63X/0.9 506148荧光观察荧光光路开关至“O”位，转轮至“1.0×”位，转换拉杆完全推进，荧光滤块换到相应号位（1：DAPI；2：TRITC；3：FITC；4：SCAN）图像输出扫描荧光光路开关至“I”位，转轮至“UV”位，转换拉杆完全拉出，荧光滤块换到4：SCAN）荧光观察（以油镜观察为例）1、样品正面朝上正确放在显微镜样品台上，点上镜油。
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。
它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。
本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。
一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。
在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。
与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。
换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。
对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。
二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。
1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。
在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。
荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。
2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。
双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。
在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。
Leica TCS SPE共聚焦显微镜操作规程(1)
Living up to Life
4. 通过显微镜侧面的“INT”按钮进行 光强调节
5. 按“TL/IL”转至荧光观察，通过前 面板按钮 选择 适宜的 滤块，见下 图，样品观察完毕后按 Shutter 键 阻断荧光光路以保护样品
共聚焦——设置采图条件
1. 按顺时针方向打开激光电源 2. 在Beam Path下调用已存的采图参数， 或重新进行光路设置： 1) 选择合适的激光谱线 2) 调节激光输出功率 3) 选择合适的分光镜 4) 选择合适的接收范围 (可拖动黑色滑块或双 击后输入接收波长范围) 5) 选择适宜的伪彩 6) 调节PMT Gain值 (检测器灵敏度) 和PMT Offset值 (背景值)
Living up to Life
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共聚焦——三维层切
1. 单击 Live进行预览，调至合适的 焦平面，再调节激光强度、接收 范围、PMT Gain和Offset等参数 2. 单击Set Plane记录焦平面位置
Living up to Life
3. 继续预览，改变 z 轴层面以确定 层切的起点和终点，红色表示已 设定
Living up to Life
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共聚焦——波长扫描
1. 选择xyλ模式 2. 单击Live进行预览，调至合适的焦平 面，再调节激光强度、接收范围、 PMT Gain和Offset等参数 3. 停止预览 4. 设定接收总范围的起点和终点 5. 设定接收带宽 (默认值为10nm) 6. 设定 采集帧数 ，或接收带宽的 步进 值 7. 适当增加激光强度并提高PMT Gain 值，单击Start按键进行波长扫描
5. 根据图像调节激光强度、接收范 围、PMT Gain及Offset等参数 6. 如对图像满意，单击Live停止预览 7. 如有必要，单击 Save 保存当前参 数，便于以后调用
Leica激光共聚焦显微镜 操作规程
潍坊医学院医学研究实验中心仪器简明操作规程汇编
激光共聚焦显微镜简明操作规程
1. 启动
开启UPS电源，依次开启右侧手柄上的三个开关，从左至右顺序开启，最后开启激光钥匙。
2. 开启软件
电脑进入操作系统界面后，双击电脑桌面启动共聚焦操作软件。
3. 自检
点击对话框的“OK”键进行自检，结束后进入软件界面
4. 开启激光管
点击屏幕上方的“configuration”按钮进入配置界面→点击左边
按钮→打开所需激光（OFF →ON ），Argon激光还需拖动右方滑块以调节输出功率
5. 设置参数
6. 放置样品进行观察。
7. 观察结束保持数据。
8.关机，做好记录。