鸡IgM μ 链在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达
昆虫表达系统
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病毒基因组的结构特点
➢ 病毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组 很小
➢ 病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成
➢ 多数RNA病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成 ，病毒基 因组的大部分是用来编码蛋白质的 ，噬菌体（细胞病毒） 的基因是连续的；而真核细胞病毒的基因是不连续的 ，无内 含子
• 在杆状病毒所表达的一系列蛋白中,有一类蛋白具有较高的表达量,并且均为病毒基因组复制所
非必需, 其中最具代表性的有多角体蛋白与 P10蛋白, 均属于晚期表达的蛋白,受晚期启 动子的调从而提供了外源
DNA插入座位。
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➢ 部分载体具有宿主细胞特异性
➢ 识别受体 ➢ 假病毒颗粒
• 杆状病毒及其基因组模型
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昆虫杆状表达系统简介
• 杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群 ,发现最早 、研
究最多且实用意义很大的昆虫病毒。20世纪80年代以来由
于杆状病毒表达载体系统（baculovirus expression vector system，BEVS）的建立 ,已被公认为是当今 基因工程四大表达系统之一 。该系统具有许多优点, 如多角体启动子控制下的高效表达 ,完善的转译后 加工修饰 ,较易从无血清培养上清中纯化的蛋白,无 内毒素污染等。 • 杆状病毒载体系统主要分为两大类,一类是用于表达单 个外源基因的载体,另一类是多元表达载体,用于插人 并表达2个或多个外源基因
871~ 881.
• （小鼠中枢神经系统）Sarkis C. , Serguera C. , Petres S. , Buchet D. ,Ridet J.L. et al.
杆状病毒——昆虫细胞表达系统
实验材料：1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。
2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。
抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。
实验步骤：一、昆虫细胞转染：1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。
2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。
b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。
c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。
3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。
4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。
加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。
5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。
27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。
二、病毒贮液的制备：1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。
即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。
2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。
长期保存分装冻存于-80℃。
3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：感染所需病毒贮液量(ml)=[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。
4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。
关于生物防治的论文
昆虫杆状病毒的研究与应用现状摘要：杆状病毒是节肢动物的专性病原物，多见于昆虫纲的鳞翅目昆虫。
在昆虫杆状病毒中昆虫杆状病毒表达载体系统的建立和发展，被誉为20世纪80年代真核表达研究领域的一个重大进展。
文章重点介绍了昆虫杆状病毒表达载体系统的研究和在基础研究领域，农、林业的应用现状。
关键词：昆虫杆状病毒表达载体系统，基础研究，农、林业昆虫杆状病毒包含核型多角体病毒和颗粒体病毒两大类，是昆虫专一性病原物，对目标害虫致病性强，不产生抗药性，田间释放安全、环保。
同时由于病毒粒子被抗逆性很强的蛋白（多角体蛋白或颗粒体蛋白）所包裹，在环境中较为稳定，制成农药制剂后，货架寿命相对较长，使用方便，具有很强的商品属性。
其中，昆虫杆状病毒表达载体系统具有表达水平高、表达产物可进行翻译后加工，并可通过感染昆虫幼虫而实现大规模低成本生产基因工程产品。
早在上世纪70年代，昆虫杆状病毒就被美国食品与药品管理局和世界卫生组织推荐为安全的生物杀虫剂用于害虫的防治。
当前，环境保护和食品安全问题日益受到关注，如何解决植物保护和环境污染、农药残留之间的矛盾，是植保工作者必须面对的课题。
昆虫杆状病毒杀虫剂作为生物农药中的重要成员，应该为此做出贡献。
我国昆虫病毒杀虫剂的产业化开发已有30年的历史，有过骄人的成绩，然而同其它产业化成功的生物农药相比（如Bt、井冈霉素、阿维菌素等），无论在生产规模、质量标准、市场份额、社会影响等诸多方面，都存在巨大的差距。
一、昆虫杆状病毒的研究昆虫杆状病毒是最大的环状单一双链DNA病毒，其基因组在90～230 kb之间，具有编码上百种蛋白质的能力。
该病毒基因组可在昆虫细胞核内进行复制和转录，其巨大的DNA复制后组装在杆状的核衣壳内。
由于昆虫杆状病毒DNA具有大量的非复制必需区，能容许基因缺失或替换，且其较大的柔软性，能容纳大片段外源DNA的插入，这为昆虫杆状病毒的重组提供了广阔发展空间。
在昆虫杆状病毒的研究中，杆状病毒表达载体系统是一个以昆虫杆状病毒为外源基因载体，以昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统。
禽流感病毒GD／1／96株M基因在sf9昆虫细胞中的表达
联 合 消 化 ， 低 熔 点 琼 脂 糖 回收 ； 常 规 方 法 将 其 亚 克 隆 至 同 时 用 按 经 Ｅｏ ｃ ＲＩ和 ＨｉｄＩ 联 合 消 化 的 ｐ ａｔ ａ ｌ质 粒 中 ， 建 重 组 ｎ ｌ ｌ Ｆ ｓＢ ｃ 构
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白． 占病 毒 粒 子 总 量 的 ３ ～ ４ 。 Ｍ １蛋 白 参 与 核 衣 壳 的 形 Ｏ Ｏ 成 。 病 毒 粒 子 的 装 配 中扮 演 主 要 角 色 。另 外 ． 与 核 衣 壳 和 表 在 它 面 糖 蛋 白 的 胞 浆 区 共 同 作 用 ． 证 病 毒 粒 子 的 完 整 性 ， 为 病 毒 保 作 的 负 调 控 基 因 与 转 录 酶 有 关 ｊ 本 研 究 采 用 杆 状 病 毒 载 体 系 。 统 来 表 达 禽 流 感 病 毒 ＧＤ／ ／ ６株 的 Ｍ 基 因 ． 在 为 Ｍ１蛋 白 １９ 旨 的进 一 步研 究 和作 为诊 断抗 原提 供必 要 的基础 。
在世 界上 广 为分 布 。近几 年 来 ， 着 禽 类 和 禽 类 制 品 贸易 的 日 随 益 频 繁 ． 我 国 已 分 离 到 多 株 禽 流 感 病 毒 ， 中就 有 高 致 病 力 的 在 其
Ｈ５亚 型 病 毒
威胁。
。这 些 禽 流 感 病 毒 株 对 我 国 养 禽 业 造 成 很 大
杆状病毒昆虫细胞表达系统：原理探微与常见问题解决指南
杆状病毒昆虫细胞表达系统：原理探微与常见问题解决指南在生物技术的广阔天地中，杆状病毒昆虫细胞表达系统以其独特的魅力和广泛的应用前景，正逐渐受到研究者们的青睐。
这一系统巧妙地利用经过改造的杆状病毒基因组，在大肠杆菌中高效复制，并通过精密的转座过程将目的基因精准地插入到bacmid的特定位点。
这一过程不仅展示了生物技术的精巧与奇妙，更为科研工作者提供了强大的工具，用以探索和研究蛋白质的功能与结构。
然而，任何技术在实际应用中总会遇到一些问题和挑战。
为了帮助大家更好地掌握和运用这一系统，本文将深入探讨其原理，并分享在实际操作中可能遇到的常见问题及其解决方案，以期为大家的科研工作提供有益的参考和指导。
杆状病毒昆虫细胞表达系统原理：经过精心改造的病毒基因组（即杆状病毒穿梭载体Bacmid）在此系统中展现了非凡的复制能力。
它们能在大肠杆菌如DH10Bac菌株中自如地繁衍。
这一复制过程得益于供体质粒中目的基因两侧所锚定的Tn7转座原件。
这些原件与DH10Bac菌株中的helper质粒所编码的转座酶活性相互作用，将目的基因精准地转座到bacmid的特定位点上。
当目的基因成功插入后，会导致bacmid上的LacZ基因发生移码，进而通过蓝白斑筛选法轻松鉴定出阳性重组bacmid。
经过提取后，这些bacmid便能转染昆虫细胞，开启其在昆虫细胞中的高效表达之旅。
昆虫-杆状病毒表达平台的常见问题解答1、义翘神州是否接受已构建的表达载体进行蛋白表达？对于众多常规蛋白表达项目，义翘神州确实欢迎并接受客户直接提供的表达载体，如pFastBac等，进行专业的蛋白表达。
我们深知每个蛋白的特性独一无二，因此，我们始终致力于与客户保持紧密的沟通，共同探讨并确定最佳的纯化方案，确保最终交付的产品符合客户的期望和需求。
我们承诺，通过我们的专业知识和丰富经验，将客户的表达载体转化为高质量的蛋白产品。
2、义翘神州是否接受包被好的杆状病毒直接进行蛋白表达？对于一些常规蛋白表达项目我们同样也可以直接使用客户制备好的杆状病毒进行蛋白表达，我们也会根据蛋白的实际特性与客户沟通交流纯化方案和最终交付形式。
[课程]生物技术制药课后习题答案
![[课程]生物技术制药课后习题答案](https://img.taocdn.com/s3/m/20b887731fd9ad51f01dc281e53a580216fc50f2.png)
第一章绪论1生物技术是以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。
2生物技术的主要内容：P1基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程蛋白质工程：运用基因工程全套技术改变蛋白质结构的技术。
染色体工程：探索基因在染色体上的定位，异源基因导入、染色体结构改变。
生化工程：生物反应器及产品的分离、提纯技术。
3生物技术制药采用现代生物技术人为创造条件，借助微生物、植物或动物来生产所需的医药品过程被称为4生物技术药物采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物才能被称为5生物药物生物技术药物与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为PPT复习题第二章基因工程制药1、简述基因工程制药的基本程序。
P162、说明基因工程技术用于制药的三个重要意义。
P15第一段第一行3、采用哪两种方法来确定目的cDNA克隆？P18（7目的基因cDN A的分离和鉴定）①核酸探针杂交法用层析法或高分辨率电泳技术(蛋白质双向电泳技术或质谱技术)分离出确定为药物的蛋白质，氨基酸测序，按照密码子对应原则合成出单链寡聚核苷酸，用做探针，与cDNA文库中的每一个克隆杂交。
这个方法的关键是分离目的蛋白，②免疫反应鉴定法（酶联免疫吸附检测）4、说明用大肠杆菌做宿主生产基因工程药物必须克服的6个困难。
①原核基因表达产物多为胞内产物，必须破胞分离，受胞内其它蛋白的干扰，纯化困难；②原核基因表达产物在细胞内多为不溶性(包含体, inclusion body)，必须经过变性、复性处理以恢复药物蛋白的生物学活性，工艺复杂；③没有翻译后的加工机制，如糖基化，应用上受到限制；④产物的第一个氨基酸必然是甲酰甲硫氨酸，因无加工机制，常造成N-Met冗余，做为药物，容易引起免疫反应；⑤细菌的内毒素不容易清除；⑥细菌的蛋白酶常常把外源基因的表达产物消化；5、用蓝藻做宿主生产基因工程药物有什么优越性？蓝藻：很有前途的药物基因的宿主细胞①有内源质粒，美国Wolk实验室已构建1200种人工质粒，可用做基因载体。
杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定)
昆虫细胞的培养
Atmosphere：air, 100%
Temperature：27.0—28.0 ℃
Primer-Forward（IFN-γ/IL-4/β-actin）
Primer-Reverse（IFN-γ/IL-4/β-actin） 2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix cDNA ROX H2O
1µ l（10 µ M）
1µ l（10 µ M） 12.5 µ l 1µ l 0.05 µ l 9.45 µ l 总25 µ L
Subculturing：
pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your hand
Preservation：
90% serum, 10% DMSO 严格程序降温，-80 ℃过夜后转移液氮保存。
每次包被板子条件一致， 4 ℃ 16-18h。 方阵滴度确定最佳抗原包被浓度。
2. 血清样品不溶血，防止干扰结果。
3. 设置空白孔（不加血清），统计结果时，所有实验组的 OD值先减掉背景值，再计算比值和滴度。
中和抗体
微量中和实验技术
中和实验 固定血清—稀释病毒法（用的很少）
获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells
1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周 2. 转染试剂：Cellfectin® ⅡReagent 3. 转染后细胞的形态变化
提高双特异性抗体生产和质量的策略
提⾼双特异性抗体⽣产和质量的策略2020-06-12 12:49：双特异性抗体可以同时靶向两种不同的抗原，其结构多样性的快速发展产⽣了⼤量新摘要摘要：颖的双特异性抗体⽀架，并提供了巨⼤的功能多样性。
⽬前医药研发中最常⽤的两种形式的双特异性抗体是基于单链可变⽚段（ scFv ）的抗体（⽆Fc⽚段）和全长IgG样不对称抗体。
与传统的单克隆抗体不同，双特异性抗体的数量，质量和稳定性等都阻碍了其更⼴泛的临床应⽤。
其在设计，⽣产和质量⽅⾯的最新类型，描述了其在研设计，⽣产和质量⽅⾯的最新研这两种主要的双特异性抗体抗体类型，描述了本⽂基于本⽂基于这两种主要的双特异性和性能提升的策略。
究进展进展和性能提升的策略1.抗体概述1.1抗体的肿瘤治疗机理：通过靶向在肿瘤细胞上过度表达或独特表达的表⾯抗原，单克隆抗体已成功⽤作癌症治机理疗剂。
基于抗体的癌症免疫疗法的功效主要涉及以下两个因素：（ 1 ）阻断或结合因⼦激活的细胞死亡，或通过抑制癌症细胞信号通路的激活以导致肿瘤细胞死亡。
例如，曲妥珠单抗靶向乳腺癌和胃癌细胞中的 HER2 受体，以抑制其增殖和存活，西妥昔单抗抑制结肠直肠癌和肺癌中的表⽪⽣长因⼦受体（ EGFR ）;（2）通过免疫细胞上的Fc受体（FcR）与抗体的Fc⽚段结合产⽣的免疫效应⼦功能诱导肿瘤靶细胞死亡，如F ig .1b 所⽰的抗体依赖性细胞毒性（ADCC ），补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞吞噬作⽤（ADCP）。
缺陷：传统抗体治疗的⼀个主要缺点是肿瘤的渗透率和保留率低。
许多针对肿瘤特异性抗原的缺陷治疗性 mAb ⼤多保留在⾎液循环中，通常只有 20 %的给药剂量与实体瘤的表⾯蛋⽩相互作⽤。
此外，⼤多数 mAb 起到阻⽌⽣长因⼦与其受体结合的作⽤，但是通常由于患者的免疫应答不⾜（尤其是重新激活 T 细胞以破坏肿瘤）⽽⽆法诱导肿瘤的凋亡。
1.2基本结构双特异性抗体：双特异性抗体可以同时靶向两种不同的抗原，例如同时结合肿瘤细胞受体和募双特异性抗体集细胞毒性免疫细胞。
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鸡IgM µ 链在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及其反应原性的测定赵莉1，2，3，步志高2*，鲍恩东1*（1.南京农业大学动物医学院南京 210095；2.中国农科院哈尔滨兽医研究所国家重点实验室生物技术六室，哈尔滨 150001； 3.瑞普（天津）动物药业有限公司天津 300300）摘要：本研究构建了表达鸡IgM µ链蛋白的重组杆状病毒rBac-c IgMµ。
采用抗c IgM µ 链蛋白的多克隆抗体间接免疫荧光检测重组杆状病毒表达的c IgMµ 蛋白，显示出良好的特异免疫反应原性。
以感染rBac-c IgMµ 的昆虫细胞裂解液上清包被96孔ELISA板，抗鸡IgM µ 链蛋白多克隆抗血清为一抗间接ELISA 检测，同样具有良好的敏感性和特异性。
结果表明，重组杆状病毒能良好表达鸡IgM µ 链蛋白，且其表达产物具有良好的反应原性。
关键词：鸡IgM µ 链； 重组杆状病毒；反应原性IgM是机体初次体液免疫应答中最早出现的免疫球蛋白，其在血清中的含量会在首次接触抗原的几天内达到高峰（杜念兴，1997），然后通过免疫球蛋白类转换作用转变为IgG而使其含量逐渐下降（Nossal et al, 1964；Coleclough et al, 1980; DePinho et al, 1984；Wabl et al, 1978；Yancopoulos et al, 1986；Burrows et al, 1983）。
由于记忆B细胞并不大量分泌IgM，所以IgM的升高预示近期机体内有抗原出现，因此，IgM在动物疾病的早期诊断方面发挥着重要作用（杨汉春, 2003）。
由于目前各类传染病危害严重，迫切需要一种有效的早期诊断试剂进行快速诊断以控制病情，淘汰感染畜禽，减少损失。
本试验利用杆状病毒—昆虫细胞系统表达了鸡IgM µ 链蛋白，由于杆状病毒表达系统在外源基因的表达方面具有糖基化、磷酸化和蛋白切割加工修饰过程，表达产物的理化性质和生物学特性与天然蛋白相似（刘高强等，2004；王清华等，2006；董双林等，2006；李雪菲等，2005），因此用该蛋白包板建立的间接ELISA便于筛选出可以与天然IgM表位特异性反应的单抗，从而可为进一步建立快速灵敏的抗鸡IgM µ 链诊断试剂盒奠定基础。
1材料和方法1.1材料pFastBac1（Invitrogen）供体质粒、sf9细胞系、DH10Bac感受态细胞（Invitrogen）均由国农科院哈尔滨兽医研究所生物技术六室保存和提供；pBlue-cIgM µ质粒、抗鸡IgM µ 链多克隆抗体均由国农科院哈尔滨兽医研究所生物技术六室制备保存；荧光素（FITC）标记的羊抗兔IgG购自北京中杉生物技术公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG购自Sigma 公司；Grace’s培养基、转染试剂（Cellfectin Reagent）购于Invitrogen公司；引物（M13 Forward 5，GTTTTCCCAGTCACGAC 3，，M13 Reverse 5，CAGGAAACAGCTATGAC）由上海博亚生物工程公司合成。
1.2原核表达重组cIgMµ 免疫血清的制备以cIgMµ-f原(5’CTAGTGAATTCCCCATACAGATGA3’)和cIgMµ-r原(5’ CTTGCGTCGACCAACACCCAGGAG3’)为引物，以pBlue-cIgM µ 扩增cIgM µ原去信号肽片段，将PCR扩增目的片段用EcoR I和SalＩ双酶切后克隆于表达载体pET-30a(+)的EcoR I和Sal Ｉ位点，使鸡IgM µ 蛋白的表达框架与载体上的His标签融合。
将构建好的重组质粒pET-30a-IgM µ转化BL21，IPTG诱导目的蛋白表达，并通过SDS-PAGE检测蛋白是否正确表达以及表达量大小，Ni化琼脂糖柱纯化。
将纯化的蛋白浓缩后进行SDS-PAGE，估测其浓度后，按每只约100 µg的剂量接种家兔。
共免疫3次，免疫间隔为3周，首免用弗氏完全佐剂乳化抗原，后腿肌肉注射；二免用弗氏不完全佐剂乳化抗原，背部皮下多点注射；三免用弗氏不完全佐剂乳化抗原，颈部皮下注射。
三免后10天采血分离血清，检测抗体效价，制备多抗血清。
1.3 重组杆状病毒的构建和重组阳性种毒的制备以cIgMµ-f真(5’GTGGAGAATTCATGCAGATGAATCAA3’)和cIgMµ-r真(5’ AATGTCGACTCATTACAACACCCAGGA3’)为引物，以pBlue-cIgM µ 扩增cIgM µ真片段，将PCR扩增目的片段用EcoR I和SalＩ限制酶双酶切后克隆至转移载体pFastBac1的EcoR I和SalＩ位点，将pFastBac1-cIgM µ 转化至DH10Bac，PCR筛选阳性重组杆状病毒基因组克隆rBacmid-cIgM µ。
利用脂质体转染试剂，将制备的阳性重组杆状病毒的基因组DNA转染sf9细胞，待细胞出现病变后，按文献（Cho-Hua Wan et al, 1995）进行重组病毒嗜斑纯化和病毒扩增，蛋白酶K-SDS-酚/氯仿抽提法提取病毒基因组DNA，并以其做模板，M13-48f和M13-47r为引物，PCR验证cIgM µ 基因在纯化病毒中获得稳定重组，重组病毒命名为rBac-cIgM µ。
扩增种毒完成嗜斑形成单位（PFU）滴定后，于4℃保存备用。
1.4间接免疫荧光上述rBac- cIgMµ 种毒液按1:10体积比感染新鲜制备的sf9细胞，至细胞病变达90％时，收获细胞，PBS洗涤重悬后滴一滴于载玻片上，自然阴干后95％乙醇固定，同时设野生型杆状病毒感染细胞为阴性对照。
分别以1:200倍稀释的兔抗IgM µ原高免血清和相同稀释倍数的正常非免疫兔的阴性血清为一抗。
PBST洗涤后加入1:50倍稀释的荧光素（FITC）标记的羊抗兔二抗，作用30 min，PBST洗涤，荧光显微镜观察并拍照。
1.5间接ELISA将rBac- cIgM µ 种毒液按1:10体积比感染新鲜制备的sf9细胞，至细胞病变达90％时，1000 rpm ，离心10 min 收获感染细胞，PBS 离心洗涤两次，用PBS 重悬，三次冻融后超声波裂解细胞，离心后收获上清，用Na 2CO 3/NaHCO 3（pH 9.6）缓冲液10倍稀释后，按每孔100 µL ，4℃包被96孔ELISA 板过夜；10%脱脂乳（0.05％ Tween20）封闭2 h ；兔抗IgM µ原 高免阳性血清（1:500）为一抗作用2 h ；HPR 标记山羊抗兔IgG （1:3000）为二抗作用1 h ；另设野生杆状病毒感染细胞上清和正常非免疫兔的血清为阴性对照； PBST 洗涤，底物邻苯二胺（OPD ）作用15 min ，2 M 硫酸终止反应后，测定OD 值。
每个稀释度至少设3个平行孔，取平均值计算P/N 值。
2结果2.1 鸡IgM µ 原核表达蛋白的鉴定pET-30a-cIgM µ 阳性质粒转化BL21，IPTG 诱导表达蛋白鸡IgM µ 蛋白，将菌液裂解后进行12%SDS-PAGE ，电泳结果表明, 鸡IgM µ 蛋白已经获得表达，分子量（含融合部分）为49.7 KD （图1）。
图1含有重组质粒pET-30a-cIgM µ 的大肠杆菌诱导及SDS-PAGE 鉴定结果1.含阳性质粒pET-30a-cIgMµ诱导1h 后菌体裂解物;2.含阳性质粒pET-30a-cIgMµ诱导2h 后菌体裂解物;3.含阳性质粒pET-30a-cIgMµ诱导3h 后菌体裂解物;4.含空质粒pET-30a 诱导3h 后菌体裂解物;5.含阳性质粒pET-30a-cIgMµ诱导前菌体裂解物6.低分子量标准蛋白。
Fig 1 SDS-PAGE Analysis of E.coli BL21 containing recombinant plasmid of pET-30a-cIgMµ after induced1.Cell extraction of E .coli containing pET-30a-cIgMµ induced 1h;2.Cell extraction of E .coli containing pET-30a-cIgMµ induced 2h;3.Cell extraction of E .coli containing pET-30a-cIgMµ induced 3h;4.Cell extraction of E .coli containing pET-30a induced 3h;5.Cell extraction of E .coli containing pET-30a-cIgMµ uninduced.6.Protein marker of low molecular weight.2.2表达鸡IgM µ蛋白的重组杆状病毒rBac-cIgM µ的构建与鉴定为构建表达鸡IgM µ 蛋白的重组杆状病毒，首先将鸡IgM µ 基因亚克隆至pFastBac1，构建重组转移载体pFastBac1-cIgM µ，EcoR Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切后获得约4700 bp 和1170 bp 两个片段，与理论预期值相符（图2）。
将pFastBac1-cIgM µ 转化至DH 10Bac ，经蓝白斑筛选和PCR 鉴定获得转移质粒rBacmid-cIgM µ。
进一步提取重组质粒rBacmid- cIgM µ，转染sf9细胞拯救重组杆状病毒，提取病毒基因组核酸DNA ，以M13-48f 和M13-47r 为引物PCR 扩增出特异的2.8 kb 的产物（图3），表明鸡IgM µ 基因在杆状病毒rBac- cIgM µ 中获得重组。
2.3 IFA 检测昆虫细胞表达重组鸡IgM µ 蛋白抗原间接免疫荧光方法检测特异性抗体具有特异性强、快速简便的突出优点（胡清海等，2001）。
为此，分别以rBac-cIgM µ 和野生杆状病毒感染sf9细胞，至CPE 达90％时收集细胞悬液制备涂片，再分别以1:200稀释的兔抗IgM µ原 高免血清和相同稀释倍数的正常非免疫兔的阴性血清为一抗进行间接免疫荧光染色。