衣原体病,弓形虫间接血凝(IHA)试验操作方法
金标法、间接血凝法与酶联免疫法检测弓形虫IgG抗体的对比研究
实验研究CHINESE COMMUNITY DOCTORS 弓形虫是寄生于猫科动物肠道的一种寄生虫，同时，人体脑、心脏、眼、肺、淋巴结等组织也是弓形虫的寄生场所。
弓形虫是一种机会致病原虫，寄生宿主免疫功能低下时，便可能导致严重后果。
全世界范围内，弓形虫广泛分布，其中西方发达国家和地区弓形虫的感染率比较高，国外相关报道称，人群弓形虫平均感染率25%～50%。
近年来，我国人群感染弓形虫病原体的比例越来越大，弓形虫病原体感染会引起人畜共患病，因此，探究有效的检测方式是十分有必要的。
目前常用的检测方法有金标法、间接血凝法与酶联免疫法。
本次调查研究旨在探究这些方法检测弓形虫IgG 抗体的临床价值，为防治工作提供一定的参考，现报告如下。
资料与方法阳性血清(家兔血清呈阳性)：12只实验感染弓形虫病原体家兔血清(由上海市疾控中心提供)，并且要用染色方法对这已经确诊的12只感染家兔血清进行阳性标记。
阴性血清(家兔血清呈阴性)：12只正常健康家兔血清(由上海市疾控中心提供)，并且要用染色方法对这已经确诊的12只健康家兔血清进行阴性标记。
试剂的选用：本次调查研究所采用的所有试剂均由珠海海泰生物有限公司提供，其生产批号及主要成分为：①显色液A，720130867；②显色液B，730140847；③酶标记物，20131007；④样品稀释液，72014064；⑤终止液，740131215；⑥浓缩洗涤液，772540263；⑦阴性对照，20131108；阳性对照，20131108；临界对照，20131108。
仪器：恒温培养箱(Thermo815)、微型振荡器、酶标仪(SPECTRAmax340pc)、各种刻度的微量移液器有机玻璃板(12×8孔1100V)等。
检测方法：间接血凝法：①配置诊断液：严格按照标示的毫升数在试剂中添加无菌蒸馏水，并且稀释摇匀，离心10min，将清液弃除，加上等量的稀释液，放置在4℃下静置24h。
猪衣原体病的发病症状及其防治和净化策略分析
猪衣原体病（又被称为鹦鹉热）是由猪衣原体感染引发的，其发病率较低，但致死率却极高，该病的传播速度非常快，猪场内一旦有一头生猪发生感染，则会快速地在猪群中传播，给猪群的健康带来严重的威胁，最终导致大批量的猪只感染死亡。
各个年龄段的生猪均可感染本病，但对仔猪以及妊娠母猪的危害性最大，会导致妊娠母猪流产、死胎等情况，仔猪感染后会对其健康发育造成严重的不良影响，同时该病非常容易被误诊，延误治疗时机而导致猪群大量死亡。
因此，饲养人员在养殖过程中应深入了解该病的致病原、发生原因、临床表现、防治措施以及净化方案等，以减少该病在生猪养殖中的发生率。
1病原学与流行病学1.1病原学分析该病是由猪衣原体感染引起的，衣原体是介于病毒和细菌之间的一种微生物，革兰氏染色后显阴性[1]，其生长周期分为原体和网状体两个发育阶段，当易感细胞接触原体后即可被感染，然后就会变成网状体以二分裂的增殖方式在细胞中繁殖，经过2～3d 增殖后，网状体又会变为衣原体，并且通过胞外分泌完成其感染过程或者被机体溶解后排出。
衣原体对外界环境的抗性较弱，一般在自然光照的环境中可存活7d ；在自然的水域当中能够存活15d ，在干燥的环境中则可存活30d 以上。
但衣原体在低温环境中可以存活较长的时间，在4℃的环境中可以存活一周左右，在0℃环境中可以存活几周时间。
对常用消毒制剂较为敏感，如使用浓度为0.5%的石炭酸或者浓度0.1%的甲醛溶液处理24h ，可令其失活，而使用浓度为70%的酒精处理后，几分钟就可以将其杀灭；而使用浓度为3%的过氧化氢处理片刻即可将其杀灭。
1.2流行病学分析研究发现有几十种哺乳动物以及100种以上的鸟类可以感染衣原体病，并进行携带和传播。
通常情况下，任何年龄段、任何品种的生猪均对本病易感，尤其是妊娠母猪和仔猪更易感染。
感染该病原体的患猪可经唾液、粪尿、乳汁或者其他分泌物向外界排出致病原，妊娠母猪流产后的羊水、产出的死胎或者胎衣中均会含有病原体，特别是被治愈后的患猪仍可以长期向外排毒，成为重要的传染源。
猪的疾病 猪衣原体病 的知识和防治
猪的疾病猪衣原体病的知识和防治一、概述：猪衣原体病(Swine Chlamydiosis)是由鹦鹉热亲衣原体(旧称鹦鹉热衣原体)的某些菌株引起的一种慢性接触性传染病，又称流行性流产、猪衣原体性流产。
临诊上可表现为妊娠母猪流产、死产和产弱仔，新生仔猪肺炎、肠炎、胸膜炎、心包炎、关节炎，种公猪睾丸炎等。
常因菌株毒力，猪性别、年龄、生理状况和环境的变化而出现不同的征候群。
国外于20世纪60年代首先确认猪衣原体病，随后许多国家相继报道了该病。
我国在20世纪80年代初，从羊流产和猪繁殖障碍病料中分离出鹦鹉热亲衣原体，从而证实我国动物衣原体病的存在。
目前，在我国规模化养猪场，猪群存在有不同程度的衣原体感染，并时有发病和流行的报道。
二、病原：衣原体（Chalmydiae）是一类具有滤过性、严格细胞内寄生，介于细菌和病毒之间，类似于立克次氏体的一类微生物，呈球状，大小为0.2～1.5µm，革兰氏染色阴性。
不能在人工培养基上生长，只能在活细胞胞浆内繁殖，依赖于宿主细胞的代谢，可在鸡胚、部分细胞单层及小鼠等实验动物中生长繁殖。
目前，较重要的衣原体有4种，即沙眼衣原体、鹦鹉热亲衣原体、肺炎亲衣原体和牛羊亲衣原体。
其中，鹦鹉热亲衣原体在兽医上有较重要的意义，可致畜禽肺炎、流产、关节炎等多种疾病，是猪衣原体病的病原。
衣原体具有3种抗原：一是属特异性抗原，所有衣原体均具有，在不同种之间可引起交叉反应，为细胞壁脂多糖，耐热(100℃，30min)，耐0.5％的石炭酸，对乙醚、胰酶、木瓜蛋白酶等有抵抗力，但可被过碘酸盐灭活，具有补体结合特性；二是种特异性抗原，存在于细胞壁中，对热敏感(60℃，30min)，可被石炭酸或木瓜蛋白酶等所破坏，耐高碘酸盐；三是亚种或型的特异型抗原，是一种含量丰富的半胱氨酸大分子。
鹦鹉热亲衣原体的致病力可分为强毒力和弱毒力菌株两大类。
强毒力菌株可使动物发生急性致死性疾病，导致重要器官发生广泛充血和炎症，死亡率可达30％；弱毒力菌株引起疾病的临诊症状不明显，死亡率低于5％。
一种用于间接血凝(IHA)法检测日本血吸虫抗体的特异抗原制备方法
专利名称：一种用于间接血凝（IHA）法检测日本血吸虫抗体的特异抗原制备方法
专利类型：发明专利
发明人：汪天平,王恩木,章乐生,张世清,呼明闯
申请号：CN201910797781.4
申请日：20190827
公开号：CN110609138A
公开日：
20191224
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种用于间接血凝(IHA)法检测日本血吸虫抗体的特异抗原制备方法，包括以下步骤：步骤一：制备血吸虫特异抗原：步骤1、制备日本血吸虫可溶性成虫抗原；步骤2、制备日本血吸虫可溶性尾蚴抗原；步骤3、制备日本血吸虫可溶性虫卵抗原；步骤4、过碘酸钠处理抗原；步骤5、将经过碘酸钠处理过的日本血吸虫可溶性成虫抗原、日本血吸虫可溶性尾蚴抗原和日本血吸虫可溶性虫卵抗原按体积比1:0.5:2比例混合，即为特异抗原；步骤二：特异抗原制备间接血凝试剂：本发明将粗制的日本血吸虫成虫、尾蚴及虫卵可溶性抗原，经过碘酸钠处理后进行配比混合，制备出诊断试剂，该试剂降低了与其他疾病的交叉反应，同时保持了原本的高敏感性和特异性。
申请人：安徽省血吸虫病防治研究所
地址：230000 安徽省合肥市芜湖路377号
国籍：CN
代理机构：北京和信华成知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：胡剑辉
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实验四 间接血凝试验(IHA)
• 3、间接血凝试验：亦称被动血凝试验，将 可溶性抗原致敏于细胞表面，再与相应的 抗体结合，出现肉眼可见的凝集，称为间 接血凝试验。 • 作用：用以检测相应抗体。 • 若将抗体吸附于红细胞表面，再加入相 应抗原出现凝集，称为反问间接血凝试验。 • 作用：用以检测检样中相应抗原。
三、实验步骤
孔号
1
++++
25
++++
25
++++
25
++++
25
++++
25
++++
25
+++
25
++
25
++
25
gglutination. +： mild agglutination，about 10-25% agglutination. ++： moderate agglutination, about 50% agglutination. +++：heavy agglutination about 75% agglutination. ++++： very heavy agglutination about 90100% agglutination.
原液
2
1：21
3
1：22
4
1：23
5
1：24
6
1：25
7
1：26
8
1：27
9
1：28
间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验(IFA)是一种用于检测抗体或抗原的灵敏方法。
以下是其基本步骤：
1.样品准备：根据待测样本类型（如贴壁细胞、悬浮细胞、组织等）
进行相应的处理。
对于贴壁细胞，需将洁净的盖玻片进行浸泡处理，并用无菌的镊子放置到培养皿中。
对于悬浮细胞，可以先进行固定步骤，然后将细胞滴加在载玻片上。
对于冷冻切片或石蜡切片，需进行相应的处理。
2.固定：固定是为了防止离体组织自溶和抗原扩散。
常用的封闭液
包括与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。
通透或固定后的样品需用PBS进行洗涤。
3.封闭：封闭是为了减少一抗和二抗与非特异性位点结合，常使用
山羊血清作为封闭液。
4.一抗孵育：根据一抗的说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释
一抗，吸水纸吸尽封闭液后，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。
洗涤后回收一抗。
5.二抗孵育：滴加适当稀释的荧光标记的二抗溶液，使其完全覆盖
标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间。
取出玻片，洗涤后加一滴缓冲甘油以盖玻片覆盖。
6.观察：立即用荧光显微镜观察标本的特异性荧光强度。
待检标本
特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为(±)或(-)，
即可判定为阳性。
请注意，这些步骤仅是间接免疫荧光试验的基本流程，实际操作中可能需要根据具体情况进行调整。
如果对具体操作有疑问，建议咨询专业人士。
羊流产嗜衣原体病和弓形虫病IHA与ELISA诊断方法的比较
关 键词 ： 山羊 ； 流产嗜 衣原 体病 ； 弓形 虫病 ； 断 诊
中 图 分 类 号 ： ８ ２ ６ ； ８ ５ ９ ￥５．７￥５． １ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ０ ７５ ３ （ ０ ２ ０ — ０ ９０ １ ０ —０ ８ ２ １ ） ６ ０ ４ — ３
（ Ｌ Ｓ 检 测结 果 ， Ｅ Ｉ Ａ） 选择 适 宜贵 州省 山羊 流产 血 清 学调 查 的检 测 方 法 。通过 Ｉ ＨＡ 和 Ｅ ＩＡ 两种 方 法对 贵 ＬＳ 州省 １ ５份 山羊血 清进行 羊 流产嗜 衣原 体与 弓形 虫抗 体 的检 测 ， ９ 统计 并 分析 两种 疫病 的阳性 符合 率 、 阴性符 合 率和 总符 合 率 。 结 果 表 明 ， 流 产 嗜 衣 原 体 与 弓形 虫 Ｉ 羊 ＨＡ 与 Ｅ Ｉ Ａ 的 总 符 合 率 分 别 为 ７ ． ５ 和 ＬＳ ７ ９ ７ ．７ ， ８ ９ 阳性符 合率 均仅 为 ５ ， Ｏ／ 阴性 符合 率 为 ８ ． ５ 和 ７ ． ７ 。说 明在检 测 两种 疫 病 血清 抗体 方面 ， ９ ６ Ｏ ４ ９ ２
ａ ｏｔｓ 是专性 寄 生于真 核细 胞 内的微 生物 ， 引起 ｂ ｒｕ ） 可
阳性 标准 血清 、 阴性 标 准 血 清 购 自中 国农 业 科 学 院
兰州 兽 医研 究 所 （ 号 为 １ ０ ２ ） 批 １ ９ ５ 。羊 流产 嗜 衣 原
体病 和 弓形 虫 病 抗 体 Ｅ Ｉ Ａ 定 量 检 测 试 剂 盒 均 购 ＬＳ
性标 准血 清 、 阴性 标 准 血 清 购 自中 国农 业 科 学 院兰 州兽 医研究 所 （ 批号 为 １ １ ３ ） １ ０ １ 。弓形虫 Ｉ ＨＡ抗 原 、
间接血凝试验(IHA)应用于牛血吸虫病诊断效果的观察
现明显的病理组织学变化。
由此可以说明，抗感败毒口服液按推荐剂量（1mL/L ）饮水给药对靶动物鸡是安全的。
█参考文献：[1]胡超群,王湘妍,段梦迪,等.抗感败毒口服液解热镇痛抗炎试验[J].中国兽医杂志,2017,53(1):106-108.[2]农业部兽医局.中华人民共和国农业部公告第1569号公告[S].2011.[3]王永彬,周绪正,张继瑜.板黄口服液在靶动物鸡中的安全性研究[J].中国畜牧兽医,2014,41(9):126-131.[4]许春燕,刘希望,孔晓军,等.银翘蓝芩口服液对鸡的安全性试验[J].动物医学进展,2017,38(7):62-65.[5]贾兴,刘欣,魏丽娟,等.复方芩兰口服液长期毒性试验研究[J].中国兽药杂志,2019,53(7):49-55.[6]段梦迪,王湘妍,胡超群,等.抗感败毒口服液对大鼠生长和血液理化指标的影响[J].中国兽药杂志,2017,51(9):30-35.作者简介：刘雪芹（1986.11—），女，农学硕士，执业兽医师。
间接血凝试验（IHA ）应用于牛血吸虫病诊断效果的观察刘雪芹（山东畜牧兽医职业学院山东潍坊261000）我国血吸虫病流行程度逐年降低，以粪便毛蚴孵化法为主要技术手段的家畜病原学诊断技术的敏感性也逐步降低，造成漏检现象时有发生，对我国传染源控制措施的实施造成潜在威胁。
我国目前在血吸虫病流行区仍施行家畜普查政策，但由于可操作性等多方面的原因，血清学诊断技术在家畜血吸虫病诊断，尤其初筛应用较少。
以间接血凝试验为基础的试剂盒在人群血吸虫病筛查中发挥重要作用，是基层血防站点必备的试剂和必掌握的技术，极大的减少了工作量，节省了工作时间。
为适应现阶段家畜血吸虫病流行新形势，在全县新一轮家畜（牛）血吸虫病筛查时应用IHA 试剂盒进行初筛，并与病原学检测结果进行对比，以评估IHA 在牛血吸虫病的筛查效果。
接血凝试验（IHA ）；牛血吸虫病；诊断效果间接血凝试验自20世纪50年代末引入我国，是典型的利用抗原检测抗体的特异性反应，因其技术包容性强，制备工艺相对简单，且具备较高敏感性和较好的重复性，很快应用于多种疾病的诊断，并研发出一系列的疾病检测试剂盒[1]。
弓形虫病血清学诊断技术
弓形虫病血清学诊断技术一、实验目的及要求掌握弓形虫病血清学诊断技术，通过对弓形虫的检测和鉴定，为防治和预防弓形虫病提供科学依据。
二、实验器材弓形虫虫株、小白鼠、恒温箱、离心机、血清、G3砂蕊漏斗、纤维素滤膜、试管、载玻片、盖玻片、显微镜、荧光显微镜、冰冻切片机、吸管、湿盒、微量血凝试验型V反应板、微量加样器、无菌试管、一次性灭菌注射器、冰箱、胶乳试验玻璃板、常规石蜡切片机、染色缸、水浴锅、微量加样仪、ELISA 板、等。
药品：生理盐水、胰酶、美蓝染液、PBS、弓形虫诊断制剂（IHA抗原）、碘酒、70%酒精、无菌生理盐水、5%柠檬酸钠、DAB、Tris盐酸、牛血清白蛋白(BSA)等。
三、实验方法步骤和操作要领。
弓形虫病血清学诊断技术主要有以下几种方法：（一）染色试验（Sabin—Feldman dye tese，DT）染色试验（Sabin—Feldman dye tese，DT）。
是弓形虫特有的血清学诊断法，此法特异性高而且被认为是标准的诊断方法。
其原理是活的弓形虫速殖子与正常血清混合，在37℃作用1h或室温数小时后，大部分滋养体由原来的新月形变为圆形或椭圆形，细胞质对碱性美蓝具有较强的亲和力而被深染。
但当弓形虫与含特异性抗体和补体(辅助因子accessoryfactor.AF)的血清混合时，虫体受到抗体和补体的协同作用而变性，对碱性美蓝不着色。
计算着色与不着色虫体比例即可判断结果。
1.辅助因子。
存在于正常人新鲜血清内，不耐热。
用作辅助因子的血清需预先筛选，即将候选血清与弓形虫速殖子混合，37℃作用1h后，有90％以上虫体经美蓝染色后，着色者即含有辅助因子（AF）。
含辅助因子血清可分装后于一2O℃保存备用。
2.抗原制备。
弓形虫速殖子经腹腔感染小鼠，3d后抽取腹腔液，生理盐水洗涤3次 (300Or/min×lOmin)，收集纯净虫体。
也可将小鼠腹腔悬液用胰酶消化，经G3砂蕊漏斗或纤维素滤膜过滤纯化，所获虫体用辅助因子血清稀释至每高倍视野50个左右虫体，即为抗原液。
ELISA和IHA检测弓形虫抗体的比较试验研究
学术研究
ｄ ｉ ０３ ６ ６ｉ ｎ１０ － ７４２ １ ． ． ９ ｏ： ．９ ９ ．ｓ．０ ８ ４ ５ ． ２１ ０ １ ｓ ０ ００
Ｅ ＩＡ和 ＩＡ检测弓形虫抗体的比较试验研究 ＬＳ Ｈ
罗才庆 ’游景洲 ， 晶晶 ｓ黄翠 琴 ｓ ， 刘 ，
（． １ 永定县农业局动物防疫监督检查站 福建龙岩 ３４０ ； ６ １０
２中华人 民共和国龙岩 出入境检验检疫局 福建龙岩 ３ ４０ ；． ． ６ ０ ０３ 龙岩学院生命科学学院 福建龙岩 ３４ ０ ） ６０ ０
摘 要： 目的： 分析 Ｅ Ｉ ＬＳ Ａ方法和 Ｉ Ａ方法检测 弓形 虫病的可靠性 。方法： Ｈ 本文应用酶联免疫吸附试验
（ ＬＳ 和 间接 血凝试 验 （ＨＡ） Ｅ ＩＡ） Ｉ 两种 方 法 ， 平行检 测 来 自 岩 市某 个猪 场的 ３ 龙 ２份猪 血 清 中的抗 弓形 虫特
Ｌ ｏＣ ｉ ｉｇ， ｏ ｉｇ ｈ ｕ， ｉ ｉｇ ｉｇ， ｕ ｎ ｉｉ。 ｕ ａｑ ｎ ’Ｙ ｕＪｎ ｚ ｏ ＬｕＪｎ ｊ 。Ｈ ａ ｇＣｕｑ ｎ ｎ
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十一、衣原体病间接血凝（IHA）试验操作方法衣原体属的三个种都存在共同的属特异性抗原。
衣原体病间接血凝试验，则是用已知的属抗原检测人、畜、禽血清或分泌物中的抗体。
具有特异、敏感、简便、快速之优点。
（一）试剂盒内容
包括衣原体属抗原致敏绵羊红细胞、阳性和阴性对照血清。
（二）试验方法
1．将生理盐水滴于V型反应板也孔中，每孔50微升。
2．取被检样品（血清或分泌物）50微升于第1孔中，与生理盐水混匀后吸50微升加于第2孔，依次作对倍稀释至所要求的稀释度。
3．每孔加抗原25微升，作定性检查时只需加两孔。
人血清只加1：4和1：8两孔。
阴道分泌物只加1：2和1：46。
孔哺乳动物血清只加1：32和1：64两孔，禽类血清只加1：8和1：18两孔。
如作定量试验则可根据实际需要自行决定。
试验：设阳性血清+抗原、阴性血清+抗原、生理盐水+抗原各1孔。
（三）结果判定
1．判定标准
“++++”红细胞全部凝集，形成一层均匀的膜，布满整个孔底
“+++”红细胞在孔底形成一层薄膜，面积比前者稍小
“++”红细胞在孔底形成薄层凝集，边缘松散或呈锯齿状
“+”红细胞在孔底呈稀薄、、散在、少量凝集，孔底有小圆点
“±”红细胞沉于孔底，但周围不光滑或中心有空斑
“-”红细胞完全沉于孔底，呈光滑的圆点
“++”经上的凝集判为阳性凝集
2．对照试验出现如下结果试验方可成立，否则应重试，阳性血清+抗原呈“++++”；阴性血清+抗原呈“—”，抗原+生理盐水呈“—”。
3．被检样品判定标准：
人群血清效价≥1：8（++）者判为阳性；效价≤1：2者判为阴性；介于二者之间判为可疑。
人群阴道分泌效价≥1：2（++）者判为阳性；效价≤1：2（++）者判为阴性。
哺乳动物血清效价≥1：64（++）者判为阳性；效价≤1：16（++）者判为阴性；介于二者之间判为可疑。
禽类血清效价≥1：16（++）者判为阳性；效价≤1：4（++）者判为阴性；介于二者之间判为可疑。
[注]被检样品采集及处理方法：
1.血清：按常规方法采血及分离血清，要求无腐败。
2. 阴道分泌物：用灭菌棉拭子插入阴道3厘米，蘸取分泌物，浸入1毫升生理盐水中，挤压后取液体，经20000转/分钟离心5分钟，取上清液作待检样品。
(邱昌庆)
十二、弓形体间接血凝集试验（IHA）操作方法本细试验系用弓形体间接红细胞凝集试验冻干抗原（IHA抗原），检测人和动物血清中弓形体（虫）抗体的方法。
检测在96（12×8）孔110°V型有机玻璃（聚苯乙烯）微型反应板上进行。
（一）操作方法
1．将IHA抗原按瓶签所标毫升数用灭菌蒸镏水稀释摇匀，1 500~2 000转/分钟离心5~10分钟，弃上清液，加等量稀释液摇匀，置4℃左右24小时后使用。
稀释后诊断液，10天内效价不变。
2．被检血清（以下称样品）的采取采欲测弓形虫抗体的人或动物血液2~2.5毫升，大约能分离1毫升左右血清（应无血球）。
3．加稀释液每孔加0.075毫升，如果没有取液器（移液器），可以把磨钝（齐）了的12号针头接在盐水接头（针头接嘴）上，后装一橡皮乳头，组成移液管，将移液管竖直加三滴，每一滴约0.025毫升（每毫升约40滴，下同）。
定性检查时，每个样品加4孔，定量检查加8孔，一块反应板上定性能检20个样品，定量能检10个样品。
每块板上不论检测几个样品，均应设阳、阴性血清对照，对照均加8孔。
4．加样品、阳、阴性对照血清第一孔加相应血清0.025毫升。
5．稀释定性检查时，稀释至第3孔，定量和对照至第8孔，为稀释液对照至第7孔。
定性的第4孔，定量和对照的第8孔，为稀释液对照；按常规用取液器稀释，如无取液器，可用0.025毫升的稀释棒稀释。
将稀释棒放入第1孔内，用左手掌、右手背夹住稀释棒，左右往复搓动，使棒旋转30次以上，然后将棒夹紧、夹平提起，移入相应的第2孔内，如法依次往下稀释，至应稀释的最后一孔，将棒取出。
棒上带走0.025毫升液体。
每个孔内的液体仍为0.075毫升，移棒时切莫使棒相互接触，旋转时不要让棒上下捣，否则容易产生气泡。
6．加诊断液（IHA抗原）将诊断液摇匀，每孔加0.025毫升。
用移液管加，每孔一滴，加完后将反应板置微型振荡器上振荡1~2分钟，直至诊断液中的血球分布均匀、从振荡器上取下反应板，盖上一块与反应板大小相近的玻璃片或干净的纸，以防灰尘落入，置22~37℃下2~3小时后观察结果。
（一）结果判定
在阳性对照血清滴度不低于1：1 024（第5孔），阴性对照血清除第1孔允许存在前滞现象（+）外，其余各孔均为（—），稀释液对照为（—）的前提下，对被检血清进行判定，否则应检查：①操作是否正确无误；②反应板、稀释棒等是否洗涤干净；③稀释液、诊断液、对照血清是否有效；④其它原因。
(兰州兽医研究所)。