抗汉坦病毒鼠_人嵌合抗体真核表达载体的构建及表达_张晓晓

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TV H 和 PMD18T双酶切含有轻重链嵌合基因的载体 PMD18V L 均为本室前期构建，用 DNA 电泳 凝 胶 回收 试剂盒 回收 目 neoM 和 pCIM 连 接， 的酶切产物 后 与 经 过 同 样 酶 切 的 pCI14℃ 连接 16 h 后 将 连 接 产 物进 行 转 化。 通 过 菌 液 PCR 初步 鉴定出阳性克隆后提取质 粒，进 一 步 通 过 双 酶 切 验 证 阳 性 克 neoease2． 1cmv5vlIRESDHFRL22R 和 pCIease2． 1隆 pCIcmv5vhIRESDHFRL22R 送南京金斯瑞生物公司进行测序。 1． 2． 2 细胞培养和 汉 坦 病毒 76 － 118 病毒株 的 扩 增 CHOK1 细胞和 E6 细胞培养 于 RPMI1640 培养基中( 含 100 mL / L 新 生牛血清) ，每隔 2 d 换液。待细胞生长至培养瓶底 80% 汇 合度时进行胰酶消化传代 处理。 汉坦 病毒 76 － 118 病毒 株 的 增殖采用乳鼠脑内扩增方法。取 第 21 代 感染 乳鼠的 脑 组 织， 用含 20 mL / L 的新 生 牛 血 清 的 RPMI1640 研 磨 成 100 g / L 的 感染鼠 脑 悬 液，反 复 冻 融 3 次，于 4℃ 以 13 000 g / min 离 心 30 min，取上清，过滤、分装，置 － 80℃ 冻存备用［4 － 5］ 。
［ 关键词］ 汉坦病毒; 人源化改造; 二氢叶酸还原酶; 真核表 K1 细胞 达; CHO［ 中图分类号］ R392 ［ 文献标识码］ A
汉坦病毒( hantavirus，HV) 属 于 布 尼 亚病毒 科 汉 坦病毒属，主要可 引起 肾 综 合 征 出 血 热 ( hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS ) 和 汉坦 病毒 肺 综 合 症( hantavirus pulmonary syndrome，HPS ) 等 急 性病毒 性传染病，临床上 HFRS 以发热、出血和急 性肾 功 能 ［1 ］ 损害为主要 特 征 。 中 国是 世 界 上 HFRS 疫 情 最 严 重的国家，主要 表 现 在: 流 行 范围 广、发 病人 数多、 病死率高、传 播 途径 多 样 等 方 面。 临床 上 尚 缺 乏 特 异有效的治疗药物， 因而更增加了 HFRS 防治任务的 长期性和艰巨性。 目前对 HFRS 的 具 体 发 病 机制 尚 不清 楚。 据报 道汉坦病毒主要 在人 血管内皮 细胞和 巨噬 细胞 内进 行复制，具有中和活性的 mAb 可 在体 内 外 抑制 或 阻 断病毒感染
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Nhe I 和 Mlu I 双 酶 切 阳 性 克隆 pCIneoease2． 1cmv5vlIRESease2． 1cmv5vhIRESDHFRL22R 后 10 g / L DHFRL22R 和 pCI琼脂糖凝胶电泳分析 ( 图 1 ) : 嵌合抗 体 重 链 片段 约1 400 bp， 轻链片段约 700 bp 片段大小均与预期一致。测序结果显 示 嵌 合抗体轻重链基因 大 培养 后 抽 提 质 粒 用 紫 外 分 K1 细胞培养于 RPMI1640 培养基中，消 光光度计定量。CHO化处理对数生长期的 CHO 细胞计数后铺 6 孔板，待细胞 长 满 90% 汇合度时加 1 mL 无 抗生 素和 血 清 的培养基。 每 孔 转染 的细胞先加入 250 μL 无 血 清 培养基 然 后 再 稀 释 表达载体 各 10 μg 和 Lipofectamine TM 2000 4 μL，室温孵育 20 min，将 DNALipofectamine TM 2000 复 合物 直 接 加入各孔 中，前 后 轻 摇 细胞 50 mL / L CO2 温箱培养 6 h 后除去复合物换 板以混合。37℃ 、 新鲜的含双抗和血清的 RPMI1640 培养基。 1． 2． 4 稳定高表达细胞株的筛选 转 染 后 48 h 加 入 600 μg / mL的 G418 ，待生长出 细胞 克隆 并 达 到 一 定 细胞 数量 后按每孔 1 000 个细胞接种 96 孔板，加入 300 mol / L 的 MTX， 待细胞恢复生长后用夹心 ELISA 法 检测 抗 体表达 量，初步 筛 选出表达 较 高的细胞 克隆。 根据 抗 体表达 量、细胞 数 以 及细 胞生长状态选取可继续进行第 2 次筛选的克隆，将细胞按每孔 1 个接种于 96 孔板 中，形 成细胞 克隆 后 挑 选 单克隆 或 克隆数 较少的孔进行检测，挑选出表达较高的孔继续按同样方法进行 第 3 次克隆化培养，通过 ELISA 检测抗体表达量是否提高。 1． 2． 5 表达抗 体的初 步 纯 化 将筛 选 出 的高表达细胞 株 进 行悬浮培养，收集无血清培养上清。把收集到的 200 mL 细胞 上清，每 40 mL 上清使用 1 只 30 K 超 滤 管 浓 缩 到 0． 2 mL 后 10 脱盐柱处理后使用 共得到约 1 mL 的超滤产物。将其用 PD亲和色谱层析技术利用 Protein A HP Spin Trap 进行抗体纯化。 1． 2． 6 嵌 合抗 体的分 子 量 分 析 采 用 还 原 和 非 还 原 SDSPAGE 和还原和非还原 Western blot 鉴定初步纯化的表达 抗 体 的大 小。 收 集 的 纯 化 后 的 抗 体用 100 g / L 的 分 离 胶 做 SDSPAGE，每孔上样 量 为 15 μL，然 后 转移 至 NC 膜。 用 50 g / L 的 脱脂牛奶室温封闭 1 h，TBST 漂洗膜 3 次，每次 10 min，加 入 1∶200 稀释的 山 羊抗 人 IgG，4℃ 过 夜，TBST 漂 洗 膜 3 次， 每次 10 min，然后加入 1∶10 000 稀 释 的 IRDye 标记 小鼠 抗 山 羊红外二 抗，室 温 避光 作用 1 h，TBS 漂 洗 膜 5 次，每 次 5 min，用 Odyssey 红外荧光扫描成像系统扫描分析。 1． 2． 7 嵌合抗 体的中和活性检测 以 汉坦 病毒 76 － 118 株 E6 细 胞 种 入 96 孔 板，培 养 1 d 至 作为攻击 病毒，将 Vero90% 汇合度。用含 100 mL / L 新生牛血清的 RPMI1640 稀释 病 毒后，将之 分 别 与 我 室 前 期 制备 的 抗汉坦 病毒鼠 源 性 mAb 3G1 ( 阳性对照 ) 、抗汉坦 病毒鼠 源 性 mAb 1A8 ( 无 关 对 照 ) 、 超滤后的培养液( 阴性对照) 、超滤后的培养上清( 待 检 样品 ) 等体积混合后 37℃ 孵 育 1 h。 将孵 育后 的 混 合 液 分 别接 种 到 37℃ 孵 育 1 h。 同 时 设置 正 常 细胞作 培养好的 E6 细胞单层， 为未感染组对照。用微量 移 液 器 将 每 孔 的 混 合 液吸 弃，加入 200 μL 温育好 的 RPMI1640 培养 液 继续 培养，每 隔 3 d 换 液 1 次。在第 10 天将 96 孔板在 － 80℃ 和 37℃ 交替冻融 3 次取裂 解上清用前 1 d 已包被 1A8 抗体的酶标板进行 ELISA 检测。
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ISSN1007 － 8738 细胞与分子免疫学杂志( Chin J Cell Mol Immunol) 2012 ， 28 ( 5 )
文章编号: 1007 － 8738 ( 2012 ) 05 － 0506 － 04
抗 汉坦 病毒 鼠 / 人 嵌合 抗体 真核表达载 体的 构建 及 表达
本研究拟在此基础上，应用基因重组技术，构建表达 抗汉坦病毒鼠 / 人嵌合抗 体，旨 在 降 低 鼠 源 单 抗 的免 疫原性、延长抗体在体内的半衰期，为更安全有效的 治疗 HFRS 奠定基础。 1
1． 1
材料和方法
材料 T4 DNA 连接 酶、限 制 性 内 切 酶、DNA 电泳 凝 胶
回收试剂盒、小量质粒提取 试剂盒 均 购 于 大 连 TaKaRa 公司; MTX 和 生 化 试剂 均 为国 产 分析纯 试剂购 于西 安 晨诺 公司; 无 血清培养基 购 于 北 京清 大 天 一 公司; RPMI1640 培养基 购自 Gibco 公司; 新 生 牛 血 清 购 于 杭 州 四 季 青 公 司; G418 购 于 Calbiochem 公司; Lipofectamine TM 2000 试剂购 于 Invitrogen 公 15 司; 脱脂奶粉购于博士德 公司; 30 K 超 滤 管 ( Amicon UltraCentrifugal Filter ) 、NC 膜 购 于 Millipore 公 司; Protein A HP Spin Trap 纯化试剂购于 GE 公司。 抗汉坦 病毒小鼠 源 性 mAb 3G1 、 1A8 为本实验室前期制备; 山 羊抗 人 IgG mAb、HRP 标 记的山羊抗人 IgG 购 于 北 京 鼎 国公司; IRDye 标记 的小鼠 抗 COR 公司。 菌 种 和 质 粒: 真核表达载 山 羊 红 外二 抗 购自 LIneoM 和 pCIM 质 粒 为 本 室 改构的高效表达载体。 体为 pCIT 载体 为 本 室 前 期构 含有 3G1鼠 / 人嵌合抗体基因的 PMD18建。中国仓鼠二氢叶酸还原酶( DHFR) 基因为本室 前 期 保 存。 K1 细胞、E6 细胞 为 本 实验 室 保 存，汉 细胞和病毒株: CHO坦病毒 76 － 118 株为本实验室保存。 1． 2 1． 2． 1 方法 鼠 / 人嵌合抗体基因的构建 首 先 利 用 Nhe I 和 Mlu I
K1 ) 中 获 得 稳定、高效表达， 体，在中国仓鼠卵巢 细胞( CHO并对其生物学活性进 行初步 鉴定。 方法: 利 用基因 重 组 技 术 T将本室前期构建的 含有 轻、重 链嵌合 基因的载体 PMD18TVL 双酶切获得重链、轻 链 基因 后，克隆 到 前 VH 和 PMD18neoM 中，用 脂 质 体 法转染 期改构的高效真核表达载体 pCIK1 细胞，在 G418 和 氨甲 喋呤 ( MTX ) 双 筛 选 压 野生型 CHO力下筛选稳定高效表达细胞 株，ELISA 方法 检测重 组 蛋白 的 表达，用 Protein A HP Spin Trap 纯 化目的 蛋白 后 进 行 SDSPAGE 和 Western blot 法检测，并通过 体 外 中和 实验 检测 其中 和活性。结果: 成功构建了抗汉坦病毒鼠 / 人嵌合抗体真核表 K1 细胞 后 经 过 3 轮 亚 克隆 筛 选 获 得 稳定 达载体，转染 CHO表达抗汉坦病毒鼠 / 人嵌合抗体的细胞系，表达量约为 1 mg / L， SDSPAGE 和 Western blot 法检测到 目的 蛋白 的表达，微 量 细 胞中和实验检测其中和活性，与 亲 本单克隆 抗 体( mAb ) 的中 K1 细 和活性相近。结论: 抗汉坦 病毒鼠 / 人 嵌合抗 体在 CHO胞中成功表达，并具有 良 好 的中和活性，为 该 抗 体 进 一 步 的 实验研究和临床应用奠定了基础。