三孢布拉氏霉菌

通过三孢布拉霉中添加氧载体来提高生产的番茄红素和β-胡萝卜素
徐芳，袁启平，朱燕
生物工程081班 108043017 杜晓阳摘要
氧载体，N -正己烷和正十二烷，分别加入三孢布拉霉的培养中，番茄红素和β-胡萝卜素的产量增加，这是由于增加了溶解氧浓度。

培养基中添加1％（V/V）正己烷或正十二烷，在控制下，番茄红素的产量分别高出51％或78％，而β-胡萝卜素的产量分别为44％或65％。

在1％（V/V）N -十二烷和0.1％（W/V）Span20两者的条件下，得到最高产量的番茄红素和β-胡萝卜素分别为533毫克/升和596毫克/L，其中分别是对照的2.1倍和1.8倍。

关键词：番茄红素β-胡萝卜素三孢布拉氏霉菌 Span 20
1、简介
番茄红素和β-胡萝卜素，两个重要的脂溶性胡萝卜素，是人类饮食中必需的营养物质，因为它们可以防止心血管疾病，调节免疫系统，被认为是抗致癌剂和抗氧化剂。

古代，类胡萝卜素的天然来源是水果，蔬菜和微生物。

接合菌，三孢布拉霉，用于工业规模生产β-胡萝卜素，而一个半工业化的进程也已为番茄红素生产发展。

三孢布拉氏霉菌是好氧微生物，氧气供应充足，可以提高细胞的生长和类胡萝卜素的合成。

然而，发酵液中，三孢布拉霉交织的菌丝生长和在溶液中的高粘度使氧气在水中的溶解度低，最终导致发酵培养基中的溶解氧缺乏。

如何增加在介质中的溶解氧浓度在三孢布拉氏霉菌的生产工艺中是非常重要的的。

来实现更好的氧气供应的一种方法是添加氧载体。

它可以增加氧气的表观溶解度。

氧载体是疏水液体，氧气在其中比在水中有更高的溶解度。

血红蛋白，全氟化合物和碳氢化合物一般被用作生物技术氧载体。

碳氢化合物在大规模发酵中更受青睐，因为它们比血红蛋白和全氟化合物更便宜。

在本文中，对两个氧载体--正己烷和正十二烷在三孢布拉氏霉菌生产的番茄红素和β-胡萝卜素效果进行了研究，以提高发酵效率。

2、原料和方法
2.1 微生物和培养基
三孢布拉氏霉菌，ATCC14271，接合型（+），和ATCC14272，接合型（-），保持马铃薯葡萄糖琼脂斜面上，生长在种子培养基（淀粉40 g/L，玉米蛋白水解50 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁0.1 g/L，维生素B1 0.01 g/L，pH值6.5），在28℃下，500毫升含100毫升培养基的烧瓶中培养40小时。

用于发酵培养基接种的操作。

2.2 发酵条件
在500毫升，100毫升培养基的烧瓶，和10％的接种量进行发酵，接种了一个1:2（体积比），ATCC 14271（+）和ATCC 14272（-）的混合物。

发酵培养基组成如下（g/L）：淀粉40，豆粕20，玉米蛋白水解物25;磷酸二氢钾，硫酸镁0.1;维生素B1 0.01; pH值6.5。

介质的组成部分加热至完全溶解，再进行高压灭菌。

（注：ATCC:美国模式培养物保藏所）除此之外，灭过菌的正己烷或正十二烷添加到发酵培养基中浓度的1％（V/V），跨度为0.1％（W/V）20，或另有规定。

在旋转烧瓶28℃条件下孵育。

摇床培养箱和抑制剂，5毫摩尔每升尼古丁，在番茄红素生产的第2天时加入。

保持5天的培养（条件不变），然后称干重，对番茄红素和β-胡萝卜素的含量进行测定。

所有的实验和估算进行了三组平行实验。

徐芳等。

过程生物化学42（2007）289-293
表1
在第0天，三孢布拉氏霉菌的细胞干重，番茄红素的产量和添加不同浓度的氧气载体后
其溶解的氧气的相对浓度
第5天收获细胞，并在第2天添加5 mmol/L尼古丁。

值是三组平行实验的标准差。

2.3 分析方法
细胞团通过细布过滤，用蒸馏水洗涤彻底，在0.08兆帕压强，45℃放置于真空干燥器中。

干燥细胞进行称量，以确定细胞的生长。

相对溶解的培养基中的氧气浓度测定使用溶解氧仪（DO - 28模型，中国）。

要提取番茄红素或β-胡萝卜素，干燥好的细胞切成小块，并在石油醚匀浆和动摇，直到他们成为无色。

一个高性能的液相色谱仪，配用Diamonsil C18柱（250毫米4.6毫米）28℃和乙腈（色谱）：二氯甲烷（75:25，V/V）作为流动分析石油醚相含有番茄红素或β-胡萝卜素在1.5毫升每分钟。

类胡萝卜素的吸收在450 nm处测定。

通过与标准样品的保留时间比较，番茄红素或β-胡萝卜素被认定使用外部标准（95％番茄红素，或96％β-胡萝卜素）的单点校准方法进行定量分析。

3、结论和分析
3.1 氧载体浓度对番茄红素和B -胡萝卜素生产的影响
使用氧载体在发酵的优点是，它可以增加从气相到微生物的氧气传输速率而不需要额外的能源供应的。

氧载体的浓度对氧的溶解度有一定的影响。

先是1％（V/V）正己烷或正十二烷在介质的溶解氧浓度达到最高值，然后与氧载体进一步提高后缓慢的减少（表1和2）。

结果与此前报道的，关于乳状液流变行为实验一致，其原因可能是，在破碎的斜坡区，存在一个明显的表观粘度增加现象，这可能会影响氧的输送速率。

正己烷或正十二烷的量取中等的量，这是通过初步的实验才确定的，并且发现，在发酵过程中，他们实质上并没有什么改变。

同时，发酵液中的泡沫在带或不带正己烷或正十二烷条件下几乎都没有变化。

因此，正己烷或正十二烷无抗泡沫效果，在发酵过程中也不起营养作用。

番茄红素是的β-胡萝卜素在三孢布拉氏霉菌合成的中间体之一。

番茄红素的积累，可以通过菌种改良和突变或在介质中引入抑制剂或合成环化酶（叔胺或含氮杂环化合物，如尼古丁，吡啶和咪唑）。

通过添加抑制剂，该微生物的β-胡萝卜素的积累在番茄红素环化酶作用下受到了抑制而番茄红素可以成功的积累。

尼古丁，一种番茄红素环化酶抑制剂，在表现浓度为5 mmol/L时引起了番茄红素在β-胡萝卜素产生菌中的积累。

在本文中，使用三孢布拉氏霉菌β-胡萝卜素产生菌与不同浓度的氧气载体番茄红素和β-胡萝卜素的含量进行了调查。

番茄红素和β-胡萝卜素在三孢布拉氏霉菌通常是由乙酰CoA通过联动和饱和度反应合成。

高溶解氧浓度可以促进饱和度反应和番茄红素和β-胡萝卜素在三孢布拉氏霉菌中的合成。

如表1和表2所示，当氧载体浓度达到1％（V/V）引起溶解氧浓度增加，番茄红素
和β-胡萝卜素的含量也会增加。

但是，如果正己烷或正十二烷的浓度过高，可能会影响一些相关酶的活性，对番茄红素和β-胡萝卜素产生消极的影响。

培养基中添加1％（V/V）正己烷或正十二烷，番茄红素生产的产量分别比对照的高51％或78％，而β-胡萝卜素分别比对照的高44％或65％以上。

表2
在第o天，细胞干重，β-胡萝卜素的生产和添加不同浓度的氧气载体后三孢布拉霉溶解的氧气相对浓度
第5天收获细胞。

值取三个平行组的标准差。

表3
加入氧载体具有不同时间的三孢布拉氏霉菌的干重和番茄红素的产量
第5天收获细胞，并在第2天增加为5 mmol/ L尼古丁。

值取三个平行组的标准差。

3.2 氧载体的加入时间对番茄红素和β-胡萝卜素产量的影响
氧载体，N-己烷或正十二烷，在第0，1，2，3和4天以最终浓度为1％（V/V）添加到肉汤，生物量，番茄红素和经过5天的生产β-胡萝卜素的三孢布拉氏霉菌如表3和表4所示。

最佳添加时间为0天。

尽管番茄红素和β-胡萝卜素是次生代谢产物，但在细胞的生长速度开始降低后，呈急剧增加，在最初的成长阶段丰富的氧气，有利于番茄红素和β——胡
萝卜素的合成。

随着十二烷在0天加入，通过三孢布拉氏霉菌生产的番茄红素和β-胡萝卜素达到1升435毫克和549毫克/L，分别比对照高出70%和64％。

3.3 氧载体和表面活性剂对番茄红素和β-胡萝卜素生产的影响
表面活性剂，例如Span 20能削弱三孢布拉氏霉菌的聚集和增加细胞壁的通透性，从而提高底物的吸收和β-胡萝卜素的形成。

如表5和表6所示，分别加入正己烷，正十二烷和Span 20后，番茄红素和β-胡萝卜素含量提高。

加入N-己烷或正十二烷，番茄红素和β-胡萝卜素产量稍微比仅加Span 20高点。

同时加入1％（V/V）N-己烷和0.1％（W/V）Span 20，获得最高的番茄红素为533毫克/升和β-胡萝卜素的产量为596毫克/升，分别为对照组的2.1倍和1.8倍。

表5
氧载体和Span 20对三孢布拉氏霉菌细胞的生长和番茄红素产量的影响
在第0天添加1％（V/V）氧载体和0.1％（W/V）Span 20。

第5天收获细胞，并在第2天增加为5 mmol/L尼古丁。

值是三个平行组的标准差。

表6
氧载体和Span 20对三孢布拉氏霉菌细胞的生长和β-胡萝卜素产量的影响
在第0天添加1％（V/V）氧载体和0.1％（W/V）Span 20。

第5天收获细胞。

值是三个平行组的标准差。

目前，番茄红素是商业上获得通过化学合成[19]或[20,21]从西红柿提取。

然而，番茄红素的生产利用三孢布拉氏霉菌发酵比夏尔马报道的从西红柿中提取高得多，这是很有工业生产前景的。

并且应用三孢布拉氏霉菌来生产β-胡萝卜素已被用于工业规模。

氧载体和Span 20价格便宜，无毒，可以提高番茄红素和β-胡萝卜素的产量，这是有益于大众文化的。