SDS-PAGE电泳分离蛋白质与蛋白质免疫印迹
蛋白免疫印迹的原理
蛋白免疫印迹的原理
蛋白免疫印迹（western blotting）是一种常用的生物化学实验
技术，用于检测和分析特定蛋白质在复杂混合物中的表达水平和特异性。
其原理基于蛋白质的电泳分离、膜转移和特异性抗体结合。
首先，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将待测蛋白样
品按照分子量大小进行分离。
然后，将分离出的蛋白质在电泳胶上通过膜转移（blotting）的方式转移到固相材料（通常是
聚乙烯二醇涂层的聚丙烯酰胺膜或硝酸纤维素膜）上。
转移完成后，膜上的蛋白质被非特异性蛋白质结合，为了防止进一步非特异性结合，可以使用一种无效蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或非脂母细胞肿瘤中抗原（NFSA）来封闭非特
异结合位点。
紧接着，膜上的蛋白质与针对特定蛋白的抗体发生特异性结合。
这些抗体可以是直接标记的（如荧光染料或酶联物质），或者是需要进一步与辅助抗体结合才能被检测到。
特异性抗体与膜上蛋白质结合后，通过洗涤步骤去除非特异性抗体。
最后，通过添加染色剂（如酶底物）或者使用荧光扫描仪，可以可视化结合在膜上的抗体。
蛋白免疫印迹的结果可以用于定量分析蛋白质的表达水平、鉴定特定蛋白的存在以及研究蛋白质的功能和相互作用。
蛋白质的SDS-PAGE检测
百泰派克生物科技
蛋白质的SDS-PAGE检测
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）十
二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离纯化技术，它利用十二烷基硫酸钠消除蛋白质结构和电泳的影响，使蛋白质仅根据分子质量差异进行分离，广泛用于蛋白质的分离、纯度鉴定、分子量鉴定以及表达分析等。
蛋白质SDS-PAGE检测包括蛋白质SDS-PAGE电泳和电泳后凝胶图像分析两个部分。
在蛋白质SDS-PAGE电泳过程中，不同分子质量的蛋白质迁移速率不同，相对分子
质量较大的蛋白质在电场的作用下迁移较慢，电泳结束后仍然靠近点样孔；而低分子质量的蛋白质迁移速率较快，电泳结束后处于离点样孔较远的位置。
经银染或考马斯亮蓝等方法染色后，便可以观察到凝胶上蛋白质条带的大小、数量和分布情况。
百泰派克生物科技采用Bio-Rad Mini-PROTEAN® Tetra凝胶系统，提供快速高效的蛋白质SDS-PAGE检测服务技术包裹，用于多种蛋白质组学分析，包括蛋白质分子
量测定、蛋白质鉴定、样品纯度分析、二硫键鉴定以及蛋白质定量等，欢迎免费咨询。
SDS-PAGE
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
3、蛋白质-SDS复合物的特点：
形状像一个长椭圆棒。 短轴对不同的蛋白质-SDS胶束基本上是相同的。
长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。
所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有电荷，消除了蛋 白质分子间原有电荷的差异。 在SDS-PAGE电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电 荷的影响，主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或 亚基分子量的大小。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
四、SDS-PAGE的应用
1、蛋白质纯度分析 2、蛋白质分子量、浓度的测定
3、免疫印迹的第一步
4、蛋白质修饰的鉴定 5、分离放射性标记的蛋白质 6、分离和浓缩用于产生抗体的抗原 7、显示小分子多肽
蛋白质分子量大小而定）； ② 恒定电压电泳一定时间； ③ 电泳结束后取下凝胶，至染色液中染色，过夜； ④ 用脱色液脱色至结果可见，经扫描保存。 结果分析参照蛋白质标准对照进行，或进一步进行 western blotting，分析不同蛋白质分子的组成。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
Western blotting多种蛋白的检测
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
二、SDS-PAGE样品检测
SDS-PAGE一般采用不连续缓冲系统，由Tris/甘氨 酸电极缓冲液、浓缩胶和分离胶构成，采用垂直电泳的 方式对待检测样品进行分析。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
二、SDS-PAGE样品检测
SDS-PAGE操作步骤如下：
① 采用一定浓度的浓缩胶和分离胶对样品进行检测（视
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
蛋白质检验方法
蛋白质检验方法蛋白质是生命体内重要的组成部分，对于生物体的生长、发育、代谢等方面起着重要作用。
因此，对蛋白质进行检验具有非常重要的意义。
本文将介绍几种常见的蛋白质检验方法，希望对您有所帮助。
首先，最常见的蛋白质检验方法之一是SDS-PAGE凝胶电泳。
这是一种常用的蛋白质分离技术，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以将蛋白质按照其分子量大小进行分离。
这种方法操作简单，结果准确，广泛应用于蛋白质的检验和分析。
其次，免疫印迹（Western blot）技术也是一种常用的蛋白质检验方法。
该方法通过将待测蛋白质转移到膜上，然后使用特异性抗体结合蛋白质进行检测。
这种方法对蛋白质的特异性检测非常有效，可以用于检验蛋白质的表达水平以及亚细胞定位等。
另外，酶联免疫吸附试验（ELISA）也是一种常见的蛋白质检验方法。
该方法通过将待测蛋白质与特异性抗体结合，然后用酶标记的二抗结合蛋白质进行检测。
ELISA方法操作简便，对微量蛋白质的检测非常敏感，广泛应用于生物医学领域。
最后，质谱技术也是一种重要的蛋白质检验方法。
通过质谱技术，可以对蛋白质的氨基酸序列、翻译后修饰等进行精确的分析。
质谱技术对于蛋白质的鉴定和定量具有非常高的灵敏度和分辨率，是当前蛋白质分析领域的重要手段之一。
综上所述，蛋白质检验方法包括SDS-PAGE凝胶电泳、免疫印迹技术、酶联免疫吸附试验以及质谱技术等多种方法。
这些方法各具特点，可以根据实际需要选择合适的方法进行蛋白质的检验和分析。
希望本文介绍的蛋白质检验方法对您有所帮助。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
Western blot实验步骤
1.9/ 4× 分 离 胶 缓 冲 液 3.61 （mL） 10% 过硫酸氨（ L ） 112/
168
TEMED（L） 分离范围（kDa）
5.0/7.5 36-150
3.7/5.5 5 1.9/ 3.61 112/ 168 5.0/7.5
SDS-PAGE 蛋白电泳试剂
1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液（Acr和Bis)：
丙烯酰胺30g ，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水100ml ，滤 纸过滤后储存于棕色瓶中，4℃避光保存，pH不得超过 7.0。（光催化或碱催化其发生脱氨基反应）
• 2. 4x分离胶缓冲液 ：Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, HCl调pH至8.8, 定容到100ml。
• 7.染色液：称取考马斯亮蓝R-250 2.5g，加入
甲醇450ml，冰乙酸100ml、水650ml。
• 8.脱色液 ：甲醇100ml，冰乙酸700ml，加水 830ml。 • 9.十二烷基硫酸钠（SDS）溶液:10%(w/v) 1g SDS，10ml去离子水配制，室温保存。
SDS-PAGE 电泳采用 Tris- 甘氨酸系统，即按分子克隆 中Sambrook等的方法（Sambrook, 1989）进行
• PVDF膜（ 聚偏二氟乙烯，polyvinylidene fluoride)的预处理 ： 在甲醇浸泡10秒湿润膜，转移缓冲液浸泡10－15 分钟，除去甲醇。PVDF是疏水性的，在转膜缓冲 液里很难浸透，甲醇处理后使更容易浸润，且甲 醇处理活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易 跟带负电的蛋白质结合； • PVDF膜是一种高强度、耐腐蚀的物质，PVDF膜 可以结合蛋白质，而且可以结合小片段的蛋白质， 最初是将它用于蛋白质的序列测定，虽然PDVF膜 结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它 的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品；
生物蛋白质的检测实验报告
生物蛋白质的检测实验报告生物蛋白质的检测实验报告引言：蛋白质是生物体中最基本的分子之一，其在细胞结构、代谢调控、信号传导等方面扮演着重要角色。
因此，准确地检测生物蛋白质的存在和量级对于研究生物学过程具有重要意义。
本实验旨在通过一系列方法，对蛋白质进行检测并分析。
材料与方法：1. 样本制备：选取不同类型的生物组织，如肌肉、肝脏和心脏，分别进行细胞裂解并制备蛋白质提取液。
2. 蛋白质定量：利用BCA法对蛋白质提取液进行定量，根据标准曲线计算样本中的蛋白质浓度。
3. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品与Laemmli缓冲液混合后，经过电泳分离，然后进行染色和成像。
4. 免疫印迹：将电泳分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上，然后进行抗体探针的孵育和检测。
5. 质谱分析：将蛋白质样品经过酶解后，利用质谱仪进行分析，得到蛋白质的质量和序列信息。
结果与讨论：1. 蛋白质定量结果显示，不同组织中蛋白质的浓度存在差异。
肌肉组织中蛋白质浓度最高，而心脏组织中蛋白质浓度最低。
这可能与组织功能和代谢需求有关。
2. SDS-PAGE电泳结果显示，不同组织中蛋白质的分子量也存在差异。
肌肉组织中蛋白质的分子量较大，而心脏组织中蛋白质的分子量较小。
这与组织的功能和结构有关。
3. 免疫印迹结果显示，不同组织中蛋白质的表达模式也存在差异。
肌肉组织中特定蛋白质的表达量较高，而心脏组织中特定蛋白质的表达量较低。
这可能与组织的功能和代谢调控有关。
4. 质谱分析结果显示，蛋白质样品中存在多个肽段，通过对质谱峰的分析，可以推测蛋白质的氨基酸序列和质量。
结论：通过本实验的一系列方法，我们成功地检测了生物蛋白质的存在和量级，并对其进行了分析。
结果显示，不同组织中蛋白质的浓度、分子量和表达模式存在差异，这与组织的功能和代谢调控密切相关。
质谱分析进一步揭示了蛋白质的氨基酸序列和质量信息。
这些结果对于深入理解生物学过程以及研究相关疾病具有重要意义。
展望：虽然本实验对生物蛋白质的检测和分析取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。
蛋白质免疫印迹实验
蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验原理蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的一种蛋白质检测方法。
对已知的表达蛋白，可以用相应的抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可以融合部分的已知片段进行检测，如HA-tag，Flag-tag，c-myc-tag等。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，被检测的是蛋白质，其中检测探针是相应的抗体，显色是使用的标记后的二抗。
经过PAGE凝胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，如醋酸纤维素膜，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质。
然后以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，然后再与标记后的二抗起反应，经过底物显色以检测目的蛋白。
蛋白质免疫印迹（Western Blot）原理蛋白免疫印迹法主要分为三个阶段进行第一阶段是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在这个阶段，经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动,且分子量越小,泳动速度就越快。
所以在此阶段，根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离，此阶段分离效果肉眼不可见。
如果想观察蛋白的电泳情况，可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察；第二阶段为电转移，又称为转膜。
即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上, 一般选用恒流300 mA，通电90 min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。
转移到载体上的蛋白条带也是肉眼不可见的，如果想观察转移的效果，可以在转移后对载体进行丽春红染液染色。
第三阶段为酶联免疫显色检测将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使目的条带蛋白显色。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验⽅法原理步骤及注意事项实验⽅法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋⽩质转移到膜上，然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。
对已知表达蛋⽩，可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交⽅法类似，但Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质，“探针”是抗体，“显⾊”⽤标记的⼆抗。
经过PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
实验材料蛋⽩质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基⼄醇ddH2O⽢氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰⼄酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离⼼机离⼼管硝酸纤维素膜匀浆器剪⼑移液枪刮棒实验步骤⼀、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基⼄醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：⽢氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容⾄1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O⾄1000 ml。
5. 膜染⾊液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；⼄酸2 ml；ddH2O118 ml。
SDS-PAGE(蛋白印迹)
2. RT，1-2hours 或 4℃过夜
一抗
1
2 3 4 5
把膜从冰箱中取出，RT ，30min。 注： 封闭 液可回收 四个角蘸点水铺好保鲜膜后，加1：100的一抗 500ul（抗体稀释液495ul+5ul mouse p65抗体） 于保鲜膜上 蛋白面朝下，使尼龙膜和一抗充分接触。注避免 产生气泡，如有气泡，可用镊子将膜的四角轻轻 提起，排出气泡 盖上玻璃平皿，RT下孵育2hours TBST 10min×2 ； TBS 10min×1
当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样 品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =－b m
R
+
K
其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移 率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均 为常数
因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较， 就可以得出未知蛋白的分子量
4.05ml
3.3ml
1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5ml
100µ l 50µ l 10µ l
100µ l 100µ l 10µ l
3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入 （或直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右, 之后加少许蒸馏水（或异丙醇除泡）,静臵
至胶凝
* 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要
2 放好胶后，放尼龙膜。注：尼龙膜一旦放到胶上就 不可再作移动，因为这时已有蛋白结合到膜上。然后， 在膜上加一点缓冲液，用玻璃棒尽量使之铺平 3 在膜上依次放好三张滤纸和海绵后，即可夹好转膜模 具。注：每层间都要注意赶气泡 4 黑对黑，白对红在电泳槽中放好模具。并加一块冰在 电泳槽中，以防转膜过程中温度过高，影响转膜效率。 5 在用转移缓冲液注满电泳槽后。红对红，黑对黑接好 转 膜 装 臵 （ 及 电 泳 装 臵 ） 。 设 臵 电 泳 参 数 ： 60v ， 2.5hours