叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定精编WORD版

叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定精编W O R D版 IBM system office room 【A0816H-A0912AAAHH-GX8Q8-GNTHHJ8】

实验报告

课程名称： 植物生理学及实验（甲） 实验类型：

实验名称： 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定

姓名： 专业： 学号：

同组学生姓名： 指导老师：

实验地点： 实验日期：

一、实验目的和要求 二、实验内容和原理

三、主要仪器设备 四、操作方法与实验步骤

五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析

七、讨论、心得

一、实验目的和要求

1、掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。

2、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a 和b 的方法及其计算。

二、实验内容和原理

以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。

原理如下：

装 订

线

1、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。

2、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。

COOCH

3

COO-

C

32H

30

ON

4

Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH +C20H39OH

COOC

20

H

39

COO-

3、取代反应。在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取

代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+ )

褐色绿色

4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。

5、定量分析。叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。

根据朗伯-比尔定律，最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光

值之间有如下的关系： OD

1=Ca*k

a1

+C

b

*k

b1

OD

2

=Ca*k

a2

+C

b

*k

b2

查阅文献得，叶绿素a和b的80％丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下。

波长/nm比吸收系数k

叶绿素a叶绿素b

66382.049.27

64516.7545.60将数值代入式子得：OD663=82.04*Ca+9.27*Cb OD645=16.75*Ca+45.60*Cb

经整理后，得到式子：Ca=0.0127 OD663 - 0.00269 OD645 Cb=0.0229 OD645 -

0.00468 OD663

三、主要仪器设备

天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机、研具、各种容（量）器、洒精灯等

四、操作方法与实验步骤

1、定性分析：

鲜叶5g+95%30ml（逐步加入），磨成匀浆，过滤入三角瓶中，观察荧光现象。

皂化反应(3ml) ：加KOH数片剧烈摇均，加石油醚5ml和H2O 1ml分层后观察

取代反应（1）：加醋酸约2ml，取1/2加醋酸铜粉加热。观察颜色变化。

取代反应（2）：鲜叶2-3cm2，加Ac-AcCu 20ml加热。

2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：

皂化反应的上层黄色石油醚溶液→稀释（470nm OD 0.5-1）

反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)→稀释（663nm OD 0.5-1）

两者在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰

3、叶绿素定量分析：

鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，各取0.2ml加80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb 和Chl总量的值。

五、实验数据记录和处理

1、定性分析：

观察荧光现象，透射光为绿色，反射光为红褐色光。

皂化反应(3ml) ：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光。下层呈绿色，为叶绿素，吸收红光和蓝紫光。

取代反应（1）：加醋酸约2ml，变褐（去镁叶绿素），取1/2加醋酸铜粉加热变绿色，为铜代叶绿素。

2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：

图 1 图 2图一在420nm左右及690nm左右波长处吸收光谱出现峰值，两者分别位于蓝紫光和红光的波长范围内，根据叶绿素吸收蓝紫光和红光的特性，可以推测图一是叶绿素的吸收光谱。

图二在450nm以及475nm波长处吸收光谱出现峰值，都位于蓝紫光的波长范围内，根据类胡萝卜素吸收蓝紫光的特性，可以推测图二是类胡萝卜素的吸收光谱。

3、叶绿素定量分析：

将数值代入式子，计算得：

波长/nm

645652663

OD第一组0.0660.0940.175

第二组0.0680.0930.172

平均0.0670.09350.1735

Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69 OD645=12.7*0.1735-2.69*0.067=2.02 mg/L

Cb (mg/L) =22.9OD645-4.68 OD663=22.9*0.067-4.68*0.1735=0.722 mg/L

CT (mg/L) = Ca+ Cb =2.74 mg/L

Chla含量(mg/g.FW)= （Ca(mg/L)/1000）*2/ 0.1 *5/ 0.2=1.01 mg/g.FW Chlb含量(mg/g.FW) = （Cb(mg/L)/1000）*2/ 0.1 *5/ 0.2=0.361 mg/g.FW Chl总含量(mg/g.FW) = （CT(mg/L)/1000）*2/ 0.1 *5/ 0.2=1.37mg/g.FW

六、实验结果与分析

1、定性实验中，各组实验观测是颜色变化基本相同，区别只是颜色的深浅，与研磨

时加入的叶片量、研磨的程度等因素有关。