用于基因治疗的慢病毒载体(一)
分子生物学--慢病毒载体PPT
• 基因转移效率高，整合率也明显高于其他 基因转移方法，对于大型动物的转基因有 很大的诱惑力，可大幅度的节省制备费用， 且易操作。 • 克服了肿瘤性逆转录病毒载体易形成嵌合 体，表达沉默等不利因素。
存在问题
• 随机插入是否干扰插入位点基因表达，甚 至引起突变，整合的拷贝过多 • 安全方面，由于在转基因治疗方面的需要 和考虑，现已有自身灭活的载体可利用。
•就到这里啦！
• 理想的病毒载体能同时提供投向了以Ⅰ型为 人免疫缺损病毒(HIV-1)为代表的慢病毒。
慢病毒特性
• 区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂 细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可 永久性表达。 • 可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌 细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多 种类型的细胞，效果非常理想，因此具有 广阔的应用前景。
• 研究表明，以HIV-1为基础构建的这类慢病 毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因 整合至靶细胞基因组长期表达、转移基因 片段容量较大、免疫反应小等优点，适于 体内基因治疗，因此有望成为理想的基因 转移载体。
慢病毒与疾病治疗
• Lesch-Nyhan综合征是一种遗传性的代谢性 脑病，由编码次黄嘌呤核糖转移酶(HPRT) 的基因缺陷所引起 • 帕金森氏病是一种退行性脑病 • Alzheimer氏病也是一种多因素引起的退行 性脑病 • 由于HIV-1载体能够体内转导神经元并建立 长期稳定的表达，因此对于以上疾病的基 因治疗非常具有吸引力。
慢病毒与转基因动物制备
• 慢病毒载体与其他转 基因技术方法相结合， 应用于转基因动物的 构建，从而大大提高 了产生转基因动物的 成功率。
• 由于慢病毒载体经改构后，不在宿主细胞 内繁殖，被他感染的或转化的动物细胞不 会死亡，可以连续传代(2~4) 。因此可以用 慢病毒作为载体，改变动物细胞的基因型， 病遗传到子代。
慢病毒载体
逆转录病毒载体、腺病毒载体：
1.逆转录病毒(retrovirus vectors ,RV)载体
逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分:一部 分是用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载 体;另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转 录病毒结构基因
将水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿 主细胞对其进行膜融合和内吞,具有广泛的宿主范围和更高的转染效率,可 高效的转染静止细胞,并能抵抗血清补体灭活的作用。
• 在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌 细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞和一些较难转染的细 胞， 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒 载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，而 且大大增加目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组 的几率，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA 的长期、稳定表达。 • 在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒 己经成为表达外 源基因或外源shRNA的常用载体形式之一。 • P.s shRNA是short hairpin RNA 的缩写。翻译为“短发夹RNA。
辅助成分
• 辅助成分包括： 慢病毒包装质粒和可产生 病毒颗粒的细胞系。 • 慢病毒包装质粒可提供所有的转录、包装、 重组的假病毒颗粒所需要的所有辅助蛋白。
• 为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染 细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外 的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目 的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水 平的表达效应分子。
4.单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)载体
单纯疱疹病毒是一种双链DNA病毒,作为基因治疗载体， HSV载体非常 适用于需要基因长时间表达的基因治疗,但在介导肿瘤基因治疗等要求基 因短暂高水平表达的基因转移是不合适。
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。
经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。
基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。
近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。
关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。
其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。
理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。
由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。
1 慢病毒及其载体的简介慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。
慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。
慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。
病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。
目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。
慢病毒载体,稳定表达
慢病毒载体，稳定表达一、慢病毒逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。
主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。
慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。
最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。
慢病毒结构：2个调节基因：（1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。
（2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。
4个辅助蛋白（附属）基因：（1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生；（2）vpr和nef参与疾病的表现。
慢病毒的优势：1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因；2.可感染分裂和非分裂细胞；3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验；4.可以更换特异性启动子；5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；二、慢病毒载体慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。
可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
慢病毒包装过程：慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
基因治疗中的基因传递载体比较与选择建议
基因治疗中的基因传递载体比较与选择建议基因治疗是一种新兴的治疗方式，可以通过将特定的基因传递到患者体内，以修复或替代缺陷基因，从而治疗遗传性疾病。
在进行基因治疗时，选择合适的基因传递载体非常重要，因为它可以影响基因的有效性、安全性和稳定性。
在本文中，我们将比较常用的基因传递载体，并给出选择建议。
一、病毒载体病毒载体是最常用的基因传递工具之一。
它们具有高度传染性和高效的基因传递能力。
目前，常用的病毒载体主要包括腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒。
1. 腺病毒（Adenovirus）腺病毒被广泛用于基因治疗研究中。
它们能够传递大分子量的基因，并能够感染广泛的细胞类型。
腺病毒具有较高的转染效率和较短的表达时间，但由于免疫反应等问题，其基因传递效果较为有限。
2. 逆转录病毒（Retrovirus）逆转录病毒是一种RNA病毒，它能够将其RNA转录成DNA，并将其整合到靶细胞的基因组中。
逆转录病毒能够传递长期稳定的基因，并且可以针对特定细胞类型进行修饰，但其转染效率较低，并且由于整合位点的随机性，可能会导致不可预测的安全性问题。
3. 腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）腺相关病毒是一种非致病的病毒，其在人体中广泛分布。
AAV具有良好的基因传递能力和安全性。
它能够传递较短的基因序列，并能够长期稳定地表达基因。
然而，由于AAV的包装能力有限，其传递能力受到一定的局限。
二、非病毒载体相比病毒载体，非病毒载体在基因传递中具有更好的安全性和更低的免疫反应。
然而，非病毒载体传递效率较低，需要优化。
1. 基因枪（Gene gun）基因枪是一种通过加速金属微粒来传递DNA或RNA的方法。
它能够有效传递基因到细胞中，并且不受基因大小的限制。
尽管基因枪具有卓越的穿透性和稳定性，但它的应用仍然受到技术要求和操作复杂性的限制。
2. 转染剂（Transfection reagents）转染剂是基因治疗中常用的非病毒载体。
基因治疗时代到来：常用基因治疗载体的介绍与选择
其中γ-逆转录病毒载体最早被改造的且广
例如使用逆转录病毒载体治疗的10
X连锁重度复合型免疫缺陷病(X-SCID)患者中，有4例因
LMO2等的附近，激活下游基因的表达
JEB后，研究团队通过全基因测序确定了插入位
发现有27000多个插入位点，但基本都集中在非编码序
LV）：以HIV-1（人
I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。属
AdV）：无包
DNA病毒，腺病毒载体宿主细胞范围广泛，
。不足之处：①
18岁少年Jesse Gelsinger在接受Jim
教授主导的腺病毒（AdV）的临床治疗中，因强烈的
4），此后Wilson教授找到了更适合更安
AAV）。腺相
AAV）：目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺
痘病毒载体、单纯性疱疹病毒载体等，由于使用较少，
4--Jesse Gelsinger（图左），Jim Wilson
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
最简单的非病毒载体是裸DNA，可直接注入特
DNA有着较为广泛的应用。以及近期异军
BioWorld专门做过解读，详情
CAR-T新策略：纳米颗粒携带CAR载体在体内
CAR-T细胞。非病毒载体虽然有着诸多优点，但也存
。2017年，
1）。图1
年11月2日，NEJM发表论文：Single-Dose
，
9型（AAV9）为载体的基因疗法成功延长了
位1型脊髓性肌萎缩症（SAM1）患儿的生命（图2）。图
年8月30日，诺华公司治疗B细胞急性淋巴细胞白
CAR-T疗法Kymriah获FDA批准
FDA批准的第一款基因疗法（图3）。图3以上
RV）、腺相关病毒（AAV）、慢病毒
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。
经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。
基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。
近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。
关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。
其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。
理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。
由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。
1 慢病毒及其载体的简介慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。
慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。
慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。
病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。
目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。
慢病毒载体构建 Protocol
慢病毒载体构建是一种用于基因治疗和基因转导的重要工具，其用于将外源基因或shRNA等插入到慢病毒载体中，从而实现对特定基因的表达调控。
下面是慢病毒载体构建所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、所需试剂和耗材1.慢病毒载体：用于包装目的基因的包装细胞系，如HepG2.2.15等。
2.目的基因或shRNA：需要插入慢病毒载体的DNA或RNA片段。
3.质粒DNA：用于构建慢病毒载体，包括表达盒质粒和包装质粒等。
4.DNA聚合酶：用于DNA扩增和连接。
5.限制性内切酶：用于DNA切割。
6.DNA连接酶：用于DNA连接。
7.缓冲液：维持反应液的pH值和其他辅助因子的浓度。
8.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
9.细胞培养基：用于细胞培养。
10.胎牛血清：提供细胞生长所需的营养物质。
11.抗生素：用于防止细胞污染。
12.其他细胞生物学试剂：如胰蛋白酶、无血清培养基等。
二、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合和振荡反应液。
2.离心机：用于离心管和细胞培养瓶等。
3.水浴锅：用于保温反应液。
4.移液器：用于精确添加试剂和溶液。
5.细胞培养箱：用于细胞培养。
6.倒置显微镜：观察细胞生长状态和感染情况。
7.紫外线分光光度计：用于测量DNA浓度。
8.电泳仪和电泳槽：用于分析DNA样品。
9.定量PCR仪：用于定量分析目的基因的转导效率。
三、准备工作1.了解慢病毒载体构建的基本原理和步骤。
2.设计并合成目的基因或shRNA序列，并确认其正确性。
3.准备所有所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
4.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
5.准备好实验服、口罩、手套等个人防护用品。
6.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
7.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。
8.设置细胞培养箱的温度和湿度等参数。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
用于基因治疗的慢病毒载体(一)
基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、病毒感染及其它难治性疾病的有效手段，但目前基因转移方法的局限性成为实现这一希望的最大障碍。
非病毒学的基因转移方法效率较低；已用于人体试验的基因治疗方案绝大多数是以病毒学方法进行基因转移的，其中以逆转录病毒载体和腺病毒载体最为成熟。
常用的逆转录病毒载体从小鼠白血病病毒(MLV)改造而来，虽可使目的基因整合至靶细胞基因组、实现稳定表达，但只能转导分裂细胞，目前主要用于基因治疗的离体方案；腺病毒载体既能转导分裂细胞，亦可转导静止细胞，转导效率也较高，但目的基因不整合至靶细胞基因组，仅能短暂表达，而且腺病毒本身某些抗原的表达可引起人体免疫反应，阻止其重复转导；其它一些病毒载体如腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体亦因各种原因不能令人满意。
理想的病毒载体能同时提供高效的基因转移、长期稳定的基因表达及生物安全性。
近来，一些研究者把目光投向了以Ⅰ型为人免疫缺损病毒(HIV-1)为代表的慢病毒。
研究表明〔1-5〕，以HIV-1为基础构建的这类慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点，适于体内基因治疗，因此有望成为理想的基因转移载体。
本文即对该类载体的研究进展做一简介。
1HIV-1基因组的基本结构〔6〕
HIV-1DNA前病毒的主要结构基因及其排列形式与其它逆转录病毒相同，均为5＇LTR-gag-pro-pol-env-3＇LTR。
其中gag基因编码病毒的核心蛋白，pol基因编码病毒复制所需的酶类，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。
与其它逆转录病毒不同的是，HIV-1基因组尚有较多调节基因，其中属于HIV-1基因复制所必需的tat基因和rev基因，分别编码两个反式激活因子Tat蛋白和Rev蛋白，前者在HIV-1基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用，后者则可促使HIV-1基因的表达由早期向晚期转化。
非HIV-1复制所必需的调节基因有nef、vif、vpr和vpu。
这些基因的编码产物都有各自的功能，有些尚未完全阐明，在此不一一赘述。
2构建HIV-1载体系统的基本原理〔7〕
HIV-1载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5＇LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3＇LTR换成SV40polyA等。
包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。
图1所示为Trono等建立的HIV-1载体系统中的一种〔1〕。
将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。
3HIV-1载体系统的改进
近年来，已有多个实验室建立了复制缺陷的HIV-1载体系统，用于不同目的的研究，如分析病毒的感染力〔8〕、筛选抗病毒药物〔9〕、评价Env糖蛋白的不同区域在介导病毒进入细胞中的作用〔10〕等。
而目前对于以基因治疗为目的的HIV-1载体系统，研究的焦点集中在如何扩大其嗜性范围、确保其安全性及提供其滴度和转导能力上。
1996年以来，Trono领导的课题组发表了一系列令人鼓舞的研究结果〔1～3〕，主要包括以下几方面的改进。
3.1包膜蛋白
最初的HIV-1载体颗粒，均由其本身的包膜蛋白Env所包裹，仅对CD4+的细胞具有亲嗜性。
1996年，Trono课题组的Naldini等〔1〕设计的HIV-1载体系统(见图1)采用表达水疱性口炎
病毒(VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒，分别取代表达HIV本身包膜蛋白Env的质粒，使HIV-1载体颗粒包上了VSV或双嗜性MLV的包膜。
这样做的结果至少具有三个方面的积极意义：①包膜的更换进一步降低了HIV-1载体恢复成野生型病毒的可能；②使HIV载体感染宿主的范围不再仅限于CD4+细胞，而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞；③VSV的包膜赋予HIV载体颗粒高度的稳定性，使其能够通过超速离心而浓缩，达到高滴度。
Naldini等已使HIV-1载体滴度由105转录单位(TU)/ml达到108TU/ml。
这样的改进无疑是HIV载体系统走向应用而迈出的一大步。
3.2包装成分
包装成分的构建应在不影响重组病毒的装配和感染力的前提下，尽可能地减少无关的HIV-1蛋白的表达，为野生型病毒的恢复设置障碍。
Naldini等〔1，2〕在构建包装质粒pCMVΔR9和pCMVΔR8.2时，分别在env基因阅读框架前插入了多个终止密码子或删除了env基因中1.4kp的序列，代之以终止密码子，以阻止env基因的表达。
在此基础上，Zufferey等〔3〕将包装包装质粒上表达调节蛋白Nef、Vif、Vpr和Vpu的4个基因分别删除或联合删除，结果发现它们对于产生HIV-1载体颗粒是非必需的，即使完全删除，得到的载体颗粒仍具备转导非分裂细胞的能力。
这4个调节蛋白或已被证实、或被高度怀疑是构成HIV毒性的因素〔11，12〕，将其删除、加上包膜蛋白的替换，可使制备HIV载体过程中产生野生型病毒的可能必微乎其微。
3.3载体质粒
载体质粒上HIV-1的顺式序列通常包括两端的LTR、剪切位点及包装信号Ψ等。
此外，研究表明〔7〕，gag基因5＇端的序列可提高载体RNA的包装效率；Rev蛋白需要与Rev反应元件(RRE)相作用，将未剪切的载体转录产物从细胞核转运到胞浆。
因此，Naldini等〔1～3〕在载体上保留了gag基因5＇端350bp的序列及位于env序列中的RRE，提高了产生载体颗粒的能力。
对于载体上需含有多少顺式作用序列为最佳，目前尚不完全靖楚。
4HIV-1载体介导基因转移的体内外实验
迄今，Trono课题组构建的HIV-1载体系统已在体外转导过人子宫颈癌细胞(HeLa)、鼠成纤维细胞(208F)、原代培养的人巨噬细胞、人呼吸道上皮细胞等，结果表明〔1-5〕，HIV-1载体无论对分裂细胞还是非分裂细胞均能转导，但对非分裂细胞的转导效率与细胞所停止的周期有关。
HIV-1载体对G0期细胞的转导效率不如对静止于G1/S或G2期的效率高，停止于G0期的时间越长，这种差别越大。
这可能是由于某些G0期细胞内脱氧核苷酸浓度低、影响了反转录步骤，造成报告基因未表达所致的表观现象。
实际上，HIV-1载体有的已进入到G0期的靶细胞内，建立了转录中间体。
一旦这类细胞进入细胞周期，载体所携带的基因就会表达。
在动物体内实验中，Naldini等〔1〕将HIV载体注射成年大鼠脑组织，30天后取脑组织，未观察到病理变化，免疫组化显示报告基因能够在终末分化的神经元中表达，证明HIV载体对体内基因转移是有效的。
此后，他们将重组病毒在转导前用dNTP和多胺处理，以增加病毒内逆转录反应，可使对大鼠神经元的转录数率提高2倍，报告基因可表达3个月以上〔2〕。
Miyoshi等〔4〕将携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的HIV载体注射大鼠眼球，GFP能在感光细胞和视网膜色素细胞中表达，如果以视紫质启动子控制GFP，则可在感光细胞中特异地高表达。
对于HIV-1载体进入非分裂细胞后的表达是否全部由整合形式产生，目前尚有不同意见。
Naldini等〔2〕将包装质粒中的整合酶基因突变，如此而产生的HIV载体不能在非分裂细胞中表达，因此认为HIV载体的表达全部由整合形式产生；而Goldman等〔5〕却在转导细胞中测到了HIV载体前病毒的非整合形式，认为不能排除两种形式同时存在的可能。
在用HIV-1载体已经进行的所有体内外实验中〔1～5〕，未出现过有复制力的HIV，说明其安全性是有保证的。