温度与条锈病菌双胁迫下小麦内参基因的选择
三个小麦种质抗条锈病基因的遗传分析和HTAP抗病性基因Yr62的分子作图
三个小麦种质抗条锈病基因的遗传分析和HTAP抗病性基因Yr62的分子作图由小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. Tritici）引起的小麦条锈病是世界范围小麦生产中的毁灭性病害。
种植抗病品种是控制该病害的最好措施。
实践证明，高温成株抗病性（High-temperature adult-plant, HTAP）具有持久抗病性的特点，但一些具有低强度HTAP抗病性的品种受到植物生长阶段、温度、湿度，接种体数量等因素的影响，抗病强度常表现为不完全抗性，不足以抵抗病害的危害。
因此，急需发掘更多高水平高温成株抗条锈病基因培育抗病品种，以应对条锈病的危害。
研究证明，将HTAP抗病性与全生育期抗病性结合会获得更高水平的持久抗病性。
三个春小麦品种PI192252、PI185285、PI195097在美国华盛顿地区连续八年的小麦种质抗病性评估试验中一直保持良好抗条锈性，其中PI192252具有高水平的HTAP抗病性，PI185285具有高水平的全生育期抗病性，PI195097具有中度抗病性。
为了明确这些品种抗病性的遗传特性，分别将三个品种与感病品种AvS杂交。
利用单粒遗传法获得F5代重组自交系群体用于遗传分析和分子作图。
对AvS/PI192252群体的抗条锈病鉴定包括温室HTAP抗病鉴定和4个环境下的田间抗病鉴定（Pullman，2011年；MountVernon，2011年；Pullman，2012年；Mount Vernon，2012年），对AvS/PI185285和AvS/PI195097群体的抗条锈病鉴定包括温室苗期抗病鉴定和2011年Pullman及MountVernon两个地点的田间抗病鉴定。
田间抗病鉴定为自然发病，在条锈病发病期间，对亲本及RILs家系的反应型（infection type，IT）和病害严重度（disease severity，DS）进行三次调查，DS值用于计算病程曲线下相对面积（relative area under the disease progresscurve, rAUDPC）。
小麦抗条锈病基因来源及染色体定位的研究进展
小麦抗条锈病基因来源及染色体定位的研究进展
李欣;畅志坚;詹海仙;郭慧娟;张晓军;乔麟轶
【期刊名称】《中国农学通报》
【年(卷),期】2015(31)5
【摘要】条锈病是小麦生产的重要病害之一,选育抗病品种是防治该病最为经济、安全和有效的途径。
由于小麦条锈菌具有高度变异性且抗源的单一化,抗病品种抗性很容易丧失。
因此,不断发掘新的抗条锈病基因资源,扩大抗源选择利用范围,对中国小麦抗病育种工作极为重要。
对已命名的57个条锈病基因进行了总结分析,着重介绍了源于小麦一级、二级和三级基因源的各个抗条锈病基因的来源及其在染色体上的分布,并对条锈病抗源利用方面进行了分析及展望。
【总页数】4页(P92-95)
【关键词】小麦;条锈病;基因;来源;染色体分布
【作者】李欣;畅志坚;詹海仙;郭慧娟;张晓军;乔麟轶
【作者单位】山西省农业科学院作物科学研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S512.1
【相关文献】
1.小麦抗条锈病基因分子标记及定位研究进展 [J], 王海;华秋东;陈维多
2.小麦抗条锈病基因定位及分子标记研究进展 [J], 马渐新;周荣华;董玉琛;贾继增
3.冬小麦“阿芙乐尔”抗条锈病基因的染色体定位研究 [J], 孙荣锦;庞家智;杨之刚
4.冬小麦阿芙乐尔抗条锈病基因的染色体定位 [J], 孙荣锦;庞家智;等
5.小麦新种质YW243抗条锈病基因的染色体定位 [J], 刘朝辉;林志珊;陈孝;马有志;徐世昌;张增艳;辛志勇;王辉
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西北条锈菌源区冬小麦育种抗条锈病基因的利用现状与策略
西北条锈菌源区冬小麦育种抗条锈病基因的利用现状与策略白斌;张怀志;杜久元;张晓洋;何瑞;伍玲;张哲;张耀辉;曹世勤;刘志勇【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2024(57)1【摘要】【目的】了解中国小麦条锈病西北重要越夏菌源区甘肃陇东和陇南近20年育成小麦品种(系)中抗条锈病基因的利用情况,为陇南小麦条锈病遗传多样性控制,持久抗病品种的培育和可持续绿色健康生态农业奠定基础。
【方法】于2019—2020年和2020—2021年种植季对117份冬小麦品种(系)甘肃清水县和四川郫都区进行成株期抗条锈病鉴定,2021年分别用条锈菌CYR33和CYR34对117份品种(系)进行苗期抗条锈病鉴定,并利用分子标记对15个抗条锈病基因进行检测。
【结果】田间成株期对条锈菌主要流行致病性混合小种抗病的品种(系)占29.1%,其中,25.6%为陇南区域品种(系),3.4%为陇东区域品种(系),另有25.6%陇南区域感病品种(系)表现慢病性(严重度<20%)。
有70.1%品种(系)苗期对CYR33表现抗病,其中,57.3%为陇南区域品种(系),12.8%为陇东区域品种(系);仅6.0%品种(系)苗期对CYR34具有抗病性,为陇南区域的兰天131等7个品种(系)。
苗期和成株期抗病品种(系)以2010年后育成的兰天、中梁、天选、兰航选系列品种为主。
分子标记检测结合系谱分析,发现抗条锈病基因Yr9、Yr10、Yr17、Yr18、Yr26、Yr28、Yr29、Yr30、Yr41、Yr46、YrZH22和YrZH84在所有检测品种(系)中的频率分别为49.6%、1.7%、12.8%、7.7%、12.8%、20.5%、10.3%、34.2%、2.6%、16.2%、15.4%和27.4%,且多以基因聚合体形式存在于品种(系)中,62.4%品种(系)中聚合了2—5个抗条锈病基因,YrZH84、YrZH22和Yr17中的一个或多个基因与其他抗条锈病基因聚合后,品种(系)的条锈病抗性明显高于其他基因组合。
温度与条锈病菌双胁迫下小麦内参基因的选择
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植物病理学报
４４ 卷
结果产生偏差[１] ꎮ 为了得到更准确的数据ꎬ需用 内参基因对实时定量 ＰＣＲ 数据进行均一化处理ꎮ 常 用 的 内 参 基 因 为 持 家 基 因 ( ｈｏｕｓｅ￣ｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ) ꎬ如 １８Ｓ 核糖体 ＲＮＡ(１８Ｓ ｒＲＮＡ) 、肌动蛋白 基因( ＡＣＴＩＮ) 、微管蛋白基因( ＴＵＢＬＩＮ) 、３￣磷酸甘 油醛脱氢酶基因( ＧＡＰＤＨ) 等ꎮ 但一些持家基因在 不同的试验 条 件 下 表 达 不 稳 定ꎬ 不 是 通 用 内 参 基 因[２] ꎮ 因此ꎬ筛选特定实验体系下的内参基因对 于准确分析目的基因的表达非常重要ꎮ 筛选内参 基因 的 研 究 已 有 诸 多 报 道ꎬ 如 马 铃 薯[３] 、 拟 南 芥[４] 、水稻[５] 、大豆[６] 、杨树[７] 、番茄[８] 、鳉鱼[９] 和 人[１０] 等ꎮ 小麦在不同发育阶段、不同组织[１１] 以及 受不同生物[１２ꎬ１３] 和非生物胁迫[１１] 过程中ꎬ表达最 稳定的内参基因各不相同ꎮ 关于小麦在条锈病菌 ( 生物) 和温度( 非生物) 双胁迫下内参基因的筛选 尚未见报道ꎮ 本研究以 ＣＤＣ( Ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ) 、 ＲＬＩ ( ＲＮａｓｅ Ｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ) 、 ＡＣＴＩＮ 和 ２６Ｓ ( ＡＴＰ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ２６Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｕｂｕｎｉｔ) 基因作为小麦候选内参基因ꎬ通 过实时荧光定量 ＰＣＲ 技术ꎬ对小麦受高温和条锈 病菌双胁迫不同阶段候选内参基因的转录水平进 行检测ꎬ 采用 ｇｅＮｏｒｍ [１] 和 ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ[１４] 软 件 对 检测结果进行分析ꎬ以期筛选出小麦在温度及条锈 病菌双重胁迫下的最佳内参基因ꎮ 小麦品种常因条锈病菌生理小种毒性变异而 丧失抗病性ꎬ沦为感病品种ꎬ给小麦生产造成重大 损失[１５] ꎮ 因此ꎬ选育非小种专化的持久抗病性品 种已成 为 解 决 小 种 专 化 抗 性 丧 失 问 题 的 重 要 途 径[１６ꎬ１７] ꎮ 科学研究和生产实践证明ꎬ 小偃 ６ 号是 一种典型的高温诱导且无小种专化性的持久性抗 条锈病品种[１６] ꎬ研究其高温诱导抗条锈病的分子 机制对于抗病品种培育具有重要的意义ꎮ 本研究 确定的温度及条锈病菌双重胁迫下基因表达量研 究用的内参基因ꎬ将为高温抗病性分子机制研究奠 定基础ꎮ
小麦条锈菌hsp70基因的克隆及热胁迫下的表达特征分析
小麦条锈菌hsp70基因的克隆及热胁迫下的表达特征分析曹华宁;刘博;刘太国;高利;陈万权【摘要】为明确热激蛋白70在小麦条锈菌对高温适应性中的作用,采用RACE和PCR技术扩增得到小麦条锈菌hsp70的基因全长,并利用实时荧光定量PCR技术对热胁迫下不同温度敏感类型小麦奈锈菌中hsp70的表达特征进行分析.克隆得到的小麦条锈菌hsp70基因组序列全长为2 817 bp,包含7个内含子,cDNA序列全长为2 267 bp,其中开放阅读框为1 917 bp,编码639个氨基酸,分子量为66.7 ku,等电点为5.15.编码蛋白含3个保守的HSP70氨基酸序列.qRT-PCR试验结果表明,28℃热激后,hsp70的转录水平随热激时间的延长而略有增加,2h达到最高值.不同温度敏感类型菌株在热激2h后hsp70的相对表达量具有显著差异.低敏感类型菌株hsp70平均表达量为未经处理对照的7.12倍,而高敏感类型菌株hsp70平均表达量仅为对照的1.63倍.【期刊名称】《植物保护》【年(卷),期】2015(041)003【总页数】6页(P19-24)【关键词】小麦条锈菌;温度敏感类型;热激蛋白70;克隆;荧光定量PCR【作者】曹华宁;刘博;刘太国;高利;陈万权【作者单位】中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京100193;中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京100193;中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京100193;中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京100193;中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京100193【正文语种】中文【中图分类】S435.121.42小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis Westend. f.sp. tritici Eriks.,Pst)引起的世界范围内小麦生产上危害最为严重的一种病害,已成为影响小麦生产可持续发展的限制因素[1-2]。
小麦条锈病抗性基因定位及分子标记技术研究进展
小麦条锈病抗性基因定位及分子标记技术研究进展作者：杨芳萍曹世勤郭莹杜久元鲁清林吕迎春白斌周刚张文涛马瑞何瑞来源：《寒旱农业科学》2024年第01期摘要：条锈病流行对小麦生产造成巨大损失，选育和种植持久抗性品种是防治小麦条锈病最经济有效的策略。
为达到多基因聚合培育持久抗病品种的目标，必须不断发掘抗病种质、解析其抗病遗传机制并开发分子标记。
基于文献，对条锈病抗性基因发掘涉及的抗病性、分子标记、基因定位方法和定位进展及其在育种中的应用进行了综述，明确了小麦条锈病基因定位涉及技术的现状、局限性及优势，从而为后续的条锈病抗性基因发掘、多基因聚合和持久抗性小麦品种的选育与生产布局提供技术指导，以降低西北麦区和小麦主产区条锈病流行的频率，进一步促进国家粮食安全。
关键词：小麦；抗条锈基因；分子标记；连锁和关联分析；测序技术；育种应用中图分类号：S512.1 文献标志码：A 文章编号：2097-2172（2024）01-0001-10doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.01.001Research Progresses on Mapping of Wheat Stripe RustResistance Genesand Molecular MarkersYANG Fangping 1， 2， CAO Shiqin 2， GUO Ying 2， DU Jiuyuan 2， LU Qinglin 2， LV Yingchun 3， BAI Bin 2，ZHOU Gang 2， ZHANG Wentao 2， MA Rui 2， HE Rui 2（1. Institute of Agricultural Economics and Information， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China;2. Wheat Research Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China;3. Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu730070， China）Abstract： The epidemics of stripe rust cause significant yield losses in wheat production. Breeding and cultivation of durably resistant varieties are the most cost-effective strategy forcontrolling wheat stripe rust. To achieve the goal of breeding durably resistant varieties through multi-gene pyramiding， it is necessary to continuously explore disease-resistant germplasms， decipher their resistant genetic mechanisms and develop molecular markers. This paper summarized the research progresses of stripe rust resistance， molecular markers， gene mapping methods， and their application in breeding related to the identification of stripe rust resistant genes to further clarify the status， limitations， and advantages of association mapping technologies for mapping of stripe rust resistance genes. This paper aims to provide technical guidance for the subsequent discovery of stripe rust resistance genes， multi-gene pyramiding， and the breeding and production arrangement of durably resistant wheat varieties to reduce the frequency of stripe rust epidemics in the northwestern wheat region and major wheat producing areas to further guarantee national food security.Key words： Wheat; Resistance gene to stripe rust; Molecular marker; Linkage and association analysis; Sequencing technique; Breeding application小麦是世界上分布最广、种植面积最大、总贸易额最多的粮食作物，为人类提供了20%的热量和25%的蛋白质。
小麦—黑麦易位系抗条锈病基因初定位
摘要小麦条锈病是由小麦条锈菌（Puccinia stiiformis f. sp. tritici）引发的一种气传真菌性病害，是小麦危害程度最严重的病害之一。
这类病害具有流行频率高、爆发性强、流行地区广和危害性大等特点。
我国是世界上最大的小麦条锈病流行区，主要在我国西北、西南、黄淮海等冬小麦地区和西北春小麦区大面积流行。
实践证明，培育和推广抗病品种是防治小麦条锈病最经济、有效、安全、环保的重要手段。
目前，我国已挖掘许多抗条锈病基因，但可利用的条锈病抗性基因数量较少。
因此，挖掘新的抗条锈病基因并将其转育到现有品种中是我国小麦抗病育种的重中之重。
表型鉴定表明，本课题组创制的小麦-黑麦1BL/1RS易位系K13-868对我国当前小麦生产上流行的强毒性条锈菌（或菌系）均表现出良好的条锈病抗性，但其抗性机制未知。
本研究通过构建F2和F2:3遗传分析群体，利用SSR分子标记、660K SNP芯片对K13-868的抗条锈病遗传特性进行分析，挖掘新的优良抗条锈病基因，为持久抗条锈病小麦品种的培育提供遗传资源，并为分子标记辅助选择育种（MAS）奠定基础，从而改变我国目前主栽品种抗性遗传基础狭窄、抗源单一等现状。
主要研究结果如下：1、利用条锈菌流行混合小种（CYR32、CYR33、CYR34、Gui22-14等）在温室和温江地里分别对K13-868进行苗期和成株期抗性鉴定。
K13-868苗期表现为中感条锈病，成株期田间鉴定表现为高抗条锈病，说明K13-868具有典型的条锈病成株期抗性（APR）。
2、2017年和2018年分别在温江对274个F2单株和F2：3家系进行成株期抗条锈病鉴定，侵染型（IT）、最大严重度（MDS）、相对病程曲线下面积（rAUDPC）频数分布图显示连续分布，IT和MDS广义遗传力分别为0.9404、0.9997，表明K13-868的条锈病抗性属于数量性状遗传，能够稳定遗传。
3、1RS易位片段对条锈病抗性遗传效应检测发现：274个单株中122个单株为1BL/1RS易位系，结合田间抗病性状结果，274个单株抗感性与1RS易位相关系数为0.056，表明K13-868的1RS易位片段可能不存在抗条锈病主效基因。
《2024年藜麦在霜霉病菌胁迫下内参基因的筛选及其稳定性验证》范文
《藜麦在霜霉病菌胁迫下内参基因的筛选及其稳定性验证》篇一一、引言藜麦（Quinoa）作为一种重要的粮食作物，具有极高的营养价值和生态适应性。
然而，在藜麦种植过程中，霜霉病菌（Peronospora farinosa）的侵害往往成为影响其产量的重要因素。
近年来，随着分子生物学技术的发展，利用基因工程手段提高藜麦抗病性已成为研究热点。
内参基因作为基因表达分析的关键组成部分，在各种逆境胁迫下的稳定性对于实验结果的准确性至关重要。
因此，本篇论文旨在研究霜霉病菌胁迫下藜麦内参基因的筛选及其稳定性验证。
二、材料与方法2.1 实验材料本实验选取了不同品种的藜麦作为实验材料，并采用霜霉病菌进行胁迫处理。
2.2 实验方法（1）基因组DNA提取及cDNA合成（2）内参基因的筛选：通过生物信息学手段，对藜麦基因组进行深度分析，筛选出在不同条件下表达稳定的内参基因。
（3）荧光定量PCR分析：对筛选出的内参基因进行荧光定量PCR分析，以验证其在霜霉病菌胁迫下的表达稳定性。
（4）统计分析：采用生物统计学方法对实验数据进行处理和分析。
三、结果与分析3.1 内参基因的筛选结果通过生物信息学分析，我们成功筛选出若干个在不同条件下表达稳定的内参基因。
这些基因在不同藜麦品种及霜霉病菌胁迫下的表达量较为稳定，具有较高的可信度。
3.2 荧光定量PCR分析结果荧光定量PCR分析结果显示，筛选出的内参基因在霜霉病菌胁迫下的表达量较为稳定，与预期结果一致。
同时，我们还发现某些内参基因在特定藜麦品种中的表达量存在差异，这可能与其遗传背景及抗病性有关。
3.3 统计分析结果通过生物统计学方法对实验数据进行处理和分析，我们发现筛选出的内参基因在霜霉病菌胁迫下的表达稳定性具有显著性差异。
其中，某些内参基因的表达量在不同处理组间差异较小，具有较高的稳定性。
四、讨论本实验成功筛选出在霜霉病菌胁迫下表达稳定的内参基因，为藜麦抗病性研究提供了重要的分子生物学工具。
新疆小麦品种(系)条锈病抗性与抗病基因分析
新疆小麦品种(系)条锈病抗性与抗病基因分析第一篇范文新疆小麦品种(系)条锈病抗性与抗病基因分析新疆是我国重要的小麦生产区之一,小麦是新疆重要的粮食作物之一。
然而,条锈病是小麦生产中的主要病害之一,严重影响小麦产量和品质。
本研究旨在分析新疆小麦品种(系)的条锈病抗性和抗病基因,为新疆小麦生产中品种选育和抗病育种提供科学依据。
一、材料与方法本研究选取了来自新疆不同地区的小麦品种(系)共45个,包括新疆本地品种和引进品种。
采用人工接种方法,将45个小麦品种(系)分别接种条锈菌生理小种人工菌株,检测其抗病性。
同时,利用分子标记技术,对45个小麦品种(系)的DNA进行扩增和测序,分析其抗病基因。
二、结果与分析1.抗病性分析经过人工接种实验,45个小麦品种(系)对条锈病的抗性表现不同。
其中,11个品种(系)表现为高抗,16个品种(系)表现为中抗,12个品种(系)表现为低抗,6个品种(系)表现为易感。
这说明新疆小麦品种(系)中存在一定程度的抗条锈病差异,具有较好的遗传多样性。
2.抗病基因分析三、讨论与结论本研究对新疆小麦品种(系)的条锈病抗性和抗病基因进行了分析,结果表明新疆小麦品种(系)存在一定程度的抗条锈病差异,具有较好的遗传多样性。
同时,存在多个抗病基因,为新疆小麦生产中品种选育和抗病育种提供了科学依据。
第二篇范文探索新疆小麦品种（系）条锈病抗性：解锁抗病基因的奥秘新疆，这片广袤的土地是我国重要的小麦生产区之一。
然而，条锈病这个“隐形杀手”一直潜伏在小麦生产中，严重影响产量和品质。
今天，让我们一起走进这个领域，探索新疆小麦品种（系）条锈病抗性背后的抗病基因奥秘。
一、网络资料收集与整理首先，我们通过网络收集了大量的相关资料。
从国内外的研究论文到农业技术推广文章，从条锈病的生物学特性到小麦抗病基因的研究进展，我们力求获取最新、最全的信息。
同时，我们对这些资料进行了整理和归纳，以便于后续的分析。
二、新疆小麦品种（系）条锈病抗性分析根据收集到的资料，我们了解到新疆小麦品种（系）在条锈病抗性方面表现各异。
小麦品种温度互作中抗条锈微效基因的表达
小麦品种温度互作中抗条锈微效基因的表达
赵文生;徐世昌;张敬原
【期刊名称】《植物保护》
【年(卷),期】2000(026)004
【摘要】初步研究了不同温度下小麦品种锈性的表达机制，结果分析表明：品种间、温度间及品种×温度间差异均达到了极显著水平，试验进一步证明京核1号小麦温度微效基因的存在，在高温潜育发病条件下有利于微效基因抗性的表达。
接种前高温处理1－2d，在常温下潜育发病，对温敏基因抗性的表达没有显著影响，
接种后高温处理1－2d，在常温下发病，对温敏基因抗性的表达有一定的诱导作用，而接种后在常温下处理1－2d，再于高温下潜育发病，更有利于微效基因抗
性表达。
【总页数】1页(P4)
【作者】赵文生;徐世昌;张敬原
【作者单位】中国农业科学院植物保护研究所，北京，100094;北京市农林科学院，北京100081
【正文语种】中文
【中图分类】S512.103
【相关文献】
1.小麦抗条锈基因聚合及抗条中32号基因分子标记筛选 [J], 朱晓娜;陈耀锋;曹婷;李春莲;任慧莉;于玲;白延红
2.不同小麦抗条锈基因及小麦品种在四川的有效性 [J], 章振羽;沈丽;刘泰国;唐俊华;姬红丽;彭云良
3.小麦抗病性遗传:Ⅳ.抗条锈小麦品系绿7蚰和抗叶锈小麦品种yantar的抗病基因定位研究 [J], 舒文华;沈克全
4.春小麦品种抗条锈基因的染色体位置及其相互作用 [J], Chen,XM;何家泌
5.89份河北、山西小麦品种抗条锈性评价及抗条锈病基因检测 [J], 庞云星;崔宏梅;蔺瑞明;杨慧;冯晶;马东方;徐世昌;王凤涛
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ＲＮＡ 的质量和数量、ｃＤＮＡ 合成效率以及 ＰＣＲ 的 扩增效率ꎬ在不同处理样品间存在的差异可能导致
收稿日期: ２０１４￣０１￣０６ꎻ 修回日期: ２０１４￣０６￣１５ 基金项目: 国家重点基础研究发展计划 ( ２０１３ＣＢ１２７７００) ꎻ 国家自然 科学基金资助项目 ( ３１２７１９８５) ꎻ 高等学校学科 创新引智计划资助
１.６ 引物设计与合成
根据 ＮＣＢＩ 上的小麦特异性数据库( Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ＵｎｉＧｅｎｅ) 公布的 ｃＤＮＡ 序列ꎬ利用 Ｐｒｉｍｅｒ ５.０ 分别设计了 ＣＤＣ(细胞分裂控制蛋白)、ＲＬＩ( 类 ＲＮＡ 酶抑制蛋白)、ＡＣＴＩＮ( 肌动蛋白) 及 ２６Ｓ( 依赖 ＡＴＰ２６ｓ 蛋白酶体调节亚基)特异性引物(表 １)ꎮ 引 物由上海生工生物工程有限公司合成ꎮ 用超纯水溶 解引物至 １０ μｍｏｌ / Ｌꎬ置于－２０℃保存备用ꎮ
１.３ 温度￣单因素胁迫试验
幼苗一直在常温下培养ꎬ涂抹蒸馏水ꎬ不接种 条锈病菌ꎮ 从接种植株转入高温(２０℃ ±１℃ ) 开始 计时ꎬ分别在 ２、２４ 和 １２０ ｈ 剪取各处理的第一叶ꎬ 每个时间点每个处理随机剪取 ３ 张叶片ꎬ液氮速冻 后ꎬ于－８０ ℃ 冰箱保存备用ꎮ
１.４ 温度￣条锈病菌双因素胁迫试验
( Ｂ０７０４９) 通讯作者: 胡小平ꎬ教授ꎬ主要从事植物病理学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｘｐｈｕ＠ ｎｗｓｕａｆ.ｅｄｕ.ｃｎ 第一作者: 王军娟ꎬ女ꎬ陕西太白人ꎬ博士研究生ꎬ主要从事植物病理学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｚｉｘｕ学报
４４ 卷
结果产生偏差[１] ꎮ 为了得到更准确的数据ꎬ需用 内参基因对实时定量 ＰＣＲ 数据进行均一化处理ꎮ 常 用 的 内 参 基 因 为 持 家 基 因 ( ｈｏｕｓｅ￣ｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ) ꎬ如 １８Ｓ 核糖体 ＲＮＡ(１８Ｓ ｒＲＮＡ) 、肌动蛋白 基因( ＡＣＴＩＮ) 、微管蛋白基因( ＴＵＢＬＩＮ) 、３￣磷酸甘 油醛脱氢酶基因( ＧＡＰＤＨ) 等ꎮ 但一些持家基因在 不同的试验 条 件 下 表 达 不 稳 定ꎬ 不 是 通 用 内 参 基 因[２] ꎮ 因此ꎬ筛选特定实验体系下的内参基因对 于准确分析目的基因的表达非常重要ꎮ 筛选内参 基因 的 研 究 已 有 诸 多 报 道ꎬ 如 马 铃 薯[３] 、 拟 南 芥[４] 、水稻[５] 、大豆[６] 、杨树[７] 、番茄[８] 、鳉鱼[９] 和 人[１０] 等ꎮ 小麦在不同发育阶段、不同组织[１１] 以及 受不同生物[１２ꎬ１３] 和非生物胁迫[１１] 过程中ꎬ表达最 稳定的内参基因各不相同ꎮ 关于小麦在条锈病菌 ( 生物) 和温度( 非生物) 双胁迫下内参基因的筛选 尚未见报道ꎮ 本研究以 ＣＤＣ( Ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ) 、 ＲＬＩ ( ＲＮａｓｅ Ｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ) 、 ＡＣＴＩＮ 和 ２６Ｓ ( ＡＴＰ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ２６Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｕｂｕｎｉｔ) 基因作为小麦候选内参基因ꎬ通 过实时荧光定量 ＰＣＲ 技术ꎬ对小麦受高温和条锈 病菌双胁迫不同阶段候选内参基因的转录水平进 行检测ꎬ 采用 ｇｅＮｏｒｍ [１] 和 ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ[１４] 软 件 对 检测结果进行分析ꎬ以期筛选出小麦在温度及条锈 病菌双重胁迫下的最佳内参基因ꎮ 小麦品种常因条锈病菌生理小种毒性变异而 丧失抗病性ꎬ沦为感病品种ꎬ给小麦生产造成重大 损失[１５] ꎮ 因此ꎬ选育非小种专化的持久抗病性品 种已成 为 解 决 小 种 专 化 抗 性 丧 失 问 题 的 重 要 途 径[１６ꎬ１７] ꎮ 科学研究和生产实践证明ꎬ 小偃 ６ 号是 一种典型的高温诱导且无小种专化性的持久性抗 条锈病品种[１６] ꎬ研究其高温诱导抗条锈病的分子 机制对于抗病品种培育具有重要的意义ꎮ 本研究 确定的温度及条锈病菌双重胁迫下基因表达量研 究用的内参基因ꎬ将为高温抗病性分子机制研究奠 定基础ꎮ
待条锈病菌侵染进入潜育后期( 即花斑期)ꎬ 对接种植株开始进行不同温度处理ꎬ即将接种幼苗 先转入高温(２０℃ ±１℃ ) 培养 ２４ ｈꎬ再转常温(１５℃ ±１℃ )培养ꎮ
１.５ 总 ＲＮＡ 提取及 ｃＤＮＡ 合成
按照试剂盒 ＰｕｒｅＬｉｎｋ® Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ( Ｉｎ￣ ｖｉｔｒｏｇｅｎꎬ ＵＳ) 的步骤提取小麦叶片总 ＲＮＡꎬ１％ 琼 脂糖凝胶电泳检测总 ＲＮＡ 的完整性ꎬ 测定 ＲＮＡ 的浓 度 和 纯 度 ( ＮａｎｏＤｒｏｐ ＲＮＤ￣２０００ꎬ ＵＳ ) ꎮ 用 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ® ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ( ＴａＫａＲａꎬ Ｊａｐａｎ) 试剂 盒提供的方法将总 ＲＮＡ 反转录成 ｃＤＮＡꎮ
植物病理学报 ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(５): ４９７￣５０３(２０１４)
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０５.００７
温度与条锈病菌双胁迫下小麦内参基因的选择
王军娟ꎬ 陶 飞ꎬ 安 菲ꎬ 徐向明ꎬ 胡小平∗
( 旱区作物逆境生物学国家重点实验室 / 西北农林科技大学植物保护学院ꎬ杨凌 ７１２１００)
Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｓｔｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒ￣ ｍｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ ＷＡＮＧ Ｊｕｎ￣ｊｕａｎꎬ ＴＡＯ Ｆｅｉꎬ ＡＮ Ｆｅｉꎬ ＸＵ Ｘｉａｎｇ￣ｍｉｎｇꎬ ＨＵ Ｘｉａｏ￣ｐｉｎｇ (Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｓｔｒｅｓｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ａｒｉｄ Ａｒｅａꎬ Ｙａｎｇｌｉｎｇ ７１２１００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｔ ｉｓ ｔｈｅ ｋｅｙ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｐｒｏｐｅｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｇｅｔｔｉｎｇ ｖａｌｉｄ ｄａｔａ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ (ｑＲＴ￣ＰＣＲ). Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｏｔｅｉｎ (ＣＤＣ)ꎬ ＲＮａｓｅ Ｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ (ＲＬＩ)ꎬ ＡＴＰ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ２６Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｕｂｕｎｉｔ (２６Ｓ) ａｎｄ ａｃｔｉｎ (ＡＣＴＩＮ) ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｄｕｒｉｎｇ ｗｈｅａｔ ｗａｓ ｓｔｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｒ / ａｎｄ Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉ￣ ｃｉ (ＰＳＴ) ｔｈｒｏｕｇｈ ｑＲＴ￣ＰＣＲ. Ｔｈｅ ｄａｔａ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｗｉｔｈ ｇｅＮｏｒｍ ａｎｄ ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＲＬＩ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｕｎｓｔｅａｄｉｌｙ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｘｉａｏｙａｎ６ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ (１５℃ ±１℃)ꎬ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ｗｈｅａｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰＳＴ ｔｒｅａｔｅｄ ａｔ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ (２０℃ ±１℃) ａｎｄ ｖａｒｉａｂｌｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ (ｆｒｏｍ ２０℃ ｔｏ １５℃) ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｙｍｐｔｏｍ￣ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔａｇｅ. Ｇｅｎｅ ＡＣＴＩＮ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ａ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ａｔ ｎｏｒ￣ ｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔꎬ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ＰＳＴ ｔｒｅａｔｍｅｎｔꎬ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ. Ｔｈｅ ２６Ｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｕｎｄｅｒ ａｌｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓꎬ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ＣＤＣ ｇｅｎｅ. Ｂｏｔｈ ｏｆ ｔｈｅｍ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｓｅｒｖｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｑＲＴ￣ＰＣＲ ｄａｔａ ｉｎ Ｘｉａｏｙａｎ６￣ＰＳＴ￣ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ. Ｔｈｅｙ ｃｏｕｌｄ ａｌｓｏ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｇｅｎｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ. Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅꎻ ｗｈｅａｔꎻ Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉꎻ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅꎻ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ
１.７ 实时荧光定量 ＰＣＲ
利用 ＵｌｔｒａＳＹＢＲ Ｍｉｘｔｕｒｅ ( 康为世纪ꎬ北京) 试 剂 盒进行实时荧光定量ＰＣＲꎮＰＣＲ反应体系总体
５期
王军娟ꎬ等:温度与条锈病菌双胁迫下小麦内参基因的选择
４９９
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ
Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
中图分类号: Ｓ４３５.１２１.４２ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０５￣０４９７￣０７
实时定量 ＰＣＲ( ｑＲＴ￣ＰＣＲ) 是研究基因表达广 泛应用 的 方 法 之 一ꎮ 在 相 对 定 量 中ꎬ 由 于 起 始
摘要:选择合适的内参基因是采用实时定量 ＰＣＲ 研究基因表达获得可信数据的关键ꎮ 以小麦在条锈病菌及温度双因素胁 迫为研究对象ꎬ采用实时荧光定量 ＰＣＲ 评价了 ＣＤＣ、ＲＬＩ、ＡＣＴＩＮ 和 ２６Ｓ 基因的表达情况ꎬ采用 ｇｅＮｏｒｍ 和 ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ 软件 进行了比较分析ꎮ 结果表明ꎬ小偃 ６ 号小麦在常温(１５℃ ±１℃ ) 未接种条锈病菌ꎬ以及接种条锈病菌并培育至花斑期分别在 高温(２０℃ ±１℃ ) 、变温(２０℃ 到 １５℃ ) 条件处理中ꎬ基因 ＲＬＩ 表达不稳定ꎬ基因 ＡＣＴＩＮ 在常温条件下以及在条锈病菌及高温 处理条件下的表达量相对稳定ꎬ但在变温条件下波动较大ꎮ 表达最稳定的基因是 ２６Ｓꎬ其次是 ＣＤＣ 基因ꎬ它们可以作为小 偃 ６ 号￣ＣＹＲ３２￣温度互作体系中基因表达实时荧光定量 ＰＣＲ 研究的内参基因ꎬ２６Ｓ 和 ＣＤＣ 是最佳内参基因组合ꎮ 关键词:内参基因ꎻ 小麦ꎻ 条锈病菌ꎻ 温度ꎻ 实时荧光定量 ＰＣＲ