内参基因选择相关软件剖析

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利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行内参基因稳定性分析的方法

摘要实时荧光定量ＰＣＲ（ＲＴ — ｑＰＣＲ）由于具备灵敏度高、重复性好、特异性强及高通量等优点，已经成为研究基因表达分析的常用方法，但其结果的准确性取决于内参基因。在任何试验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在，科研工作者为பைடு நூலகம்了获得精准的试验结果，首先必须从众多的内参基因中筛选出稳定的内参基因。ｇｅＮｏｒｍ、ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ和ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ等是专门用于筛选稳定性内参基因的软件，但这
农村经济学
现代农业科技
２０１７年第５期
利用ｇｅＮｏｒｍ、ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ和ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ软件进行内参基因稳定性分析的方法
吴建阳何冰・杜玉洁・李伟才魏永赞
（－岭南师范学院基础教育学院，广东湛江５２４０３７；农业部热带果树生物学重点实验室，中国热带农业科学院南亚热带作物研究所）
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ），ＳｏｕｔｈＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｌａＳｃｉｅｎｃｅｓ）ＡｂｓｔｒａｃｔＲｅｌ— ａｔｉｍｅｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＲＴ — ｑＰＣＲ）ｉｓｕｓｅｄｆｏｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｌｙａｓｉｓｗｉｔｈｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｇｏｏｄｒｅｐｅａ —

花椰菜实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价

花椰菜实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价花椰菜实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价引言：实时荧光定量PCR（qPCR）是一种准确、高效、灵敏且快速的分子生物学技术，目前已广泛应用于基因表达的定量研究。

在qPCR中，选择合适的内参基因是保证实验结果准确可靠的重要环节。

本文旨在对花椰菜实时荧光定量PCR内参基因进行筛选与评价。

材料与方法：1. 花椰菜不同组织样本的收集：分别收集花椰菜的根、茎、叶和花序等不同组织样本；2. RNA提取与反转录：使用相关试剂盒提取样本总RNA，并通过反转录反应合成cDNA；3. 候选内参基因的筛选：根据文献报道和先前的实验经验，选择约10个常用内参基因作为候选，并设计引物；4. 实时荧光定量PCR：使用合适的qPCR试剂盒，按照说明书所示条件进行PCR反应；5. 数据处理：计算候选内参基因的CT值和PCR扩增效率，采用特定的软件对数据进行统计分析。

结果与讨论：1. 候选内参基因的CT值与PCR扩增效率分析：利用qPCR结果，计算候选内参基因在不同组织样本中的CT值和PCR扩增效率，并进行相关性分析；2. 稳定性分析：根据CT值和PCR扩增效率，使用不同的算法（如ΔCt、NormFinder、BestKeeper和RefFinder等）对候选内参基因进行稳定性评价，筛选出最稳定的内参基因；3. 内参基因的基因表达稳定性验证：选择1-2个最稳定的内参基因，通过双内参基因法计算花椰菜目标基因的表达水平，并与单一内参基因法进行对比；4. 外源胁迫下内参基因的稳定性分析：收集花椰菜受外源胁迫后的不同组织样本，使用最稳定的内参基因进行表达分析，并验证其稳定性。

结论：通过本研究的实时荧光定量PCR内参基因筛选与评价实验，我们得出了以下结论：1. 已初步筛选出适用于花椰菜实时荧光定量PCR的内参基因候选列表；2. 从候选内参基因中进一步筛选出最稳定的内参基因，并验证了其在花椰菜不同组织中的稳定性；3. 双内参基因法相较于单一内参基因法，在花椰菜目标基因表达水平的测定中具有更高的准确性和可靠性；4. 在外源胁迫下，最稳定的内参基因在花椰菜不同组织中的表达水平相对稳定。

qPCR 内参基因选择

4. Yang J, Mani S A, Donaher J L, et al. Twist, a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis.[J]. Cell, 2015, 117(7):927-939.
7.Haas M J, Plazarte M, Chamseddin A, et al. Inhibition of hepatic apolipoprotein AI gene expression by histamine[J]. European journal of pharmacology, 2018, 823: 49-57.
乳腺癌转BPI基因研究中，qPCR选择了18S rRNA作内参，而Western blot选择了GAPDH为内参
➢内参基因使用示例文献3
材料： 1. 人结肠癌组织 2. 人正常结肠粘膜组织 3. EGFR敲除和野生小鼠
小鼠结肠癌表皮生长因子下调miRNA的研究中，qPCR和weatern都选择β-actin作为内参基因
5. Xu H, Bionaz M, Sloboda D M, et al. The dilution effect and the importance of selecting the right internal control genes for RT-qPCR: a paradigmatic approach in fetal sheep[J]. Bmc Research Notes, 2015, 8(1):1-15.
1rtpcr和qpcr实验内参基因选择内参基因概念和作用内参基因的选择参考示例目录加入标题入标题加入标题内参即为内部参照内参基因则是在检测目的基因从dna到mrna表达过程中可用来当作参照的基因

球茎甘蓝qRT-PCR内参基因的筛选及稳定性验证

球茎甘蓝qRT-PCR内参基因的筛选及稳定性验证
郭怡婷;孙世英;赵文菊;王鑫淼;李晓娟;马一栋;任延靖
【期刊名称】《甘肃农业大学学报》
【年(卷),期】2024(59)1
【摘要】【目的】通过对已知内参基因进行筛选,确定球茎甘蓝最合适的内参基因,确保实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的准确表达。

【方法】本试验选择了11种参考基因,利用GeNorm、Normalfinder和Bestkeep软件对紫色球茎甘蓝和绿色球茎甘蓝不同部位的内部参考基因进行了分析。

【结果】3个分析结果显示,内参基因Tip41在球茎甘蓝不同组织部位表达最稳定。

【结论】Tip41是作为内参基因的最佳选择,为球茎甘蓝后续的分子生物学相关研究提供基础。

【总页数】9页(P144-152)
【作者】郭怡婷;孙世英;赵文菊;王鑫淼;李晓娟;马一栋;任延靖
【作者单位】青海大学;青海大学农林科学院;青海大学
【正文语种】中文
【中图分类】Q943.2
【相关文献】
1.葡萄不同摘心处理下qRT-PCR内参基因的筛选与验证
2.‘麦缘锦楸’叶色表型qRT-PCR内参基因筛选及验证
3.小胸鳖甲qRT-PCR内参基因筛选和表达稳定性分析
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5.梭梭qRT-PCR内参基因的筛选及稳定性分析
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胡椒实时荧光定量PCR内参基因的筛选

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全基因组选择GS软件：MiXBLUP2.1介绍

全基因组选择GS软件：MiXBLUP2.1介绍软件介绍MiXBLUP是一款遗传评估软件, 适合所有的育种机构. 它可以利用系谱和基因组信息估计育种值, 给出方差组分. MiXBLUP可以加快育种进程, 加大遗传进展, 使用简单, 非常适合数据量大, 模型复杂的运算.它还支持各种亲缘关系矩阵, 比如系谱构成的A矩阵, SNP构成的G矩阵, H矩阵, SNP回归分析等.怎么使用软件MiXBLUP可以从这里下载, 它是一款商业软件, 可以在这里预定.MiXBLUP可以提供30天的免费试用, 仅供测试使用, 试用版软件可以无限制的使用, 但是只给出1000个育种值.商业版的软件可以购买, 没有限制.MiXBLUP的优势MiXBLUP是速度非常快的软件, 特别是针对模型复杂, 数据量大的运算比较有优势, 可以运行随机回归模型, 全基因组选择, 一步法, SNP 回归等等.软件来源MiXBLUP是由荷兰瓦格宁根大学, 动物育种与基因组中心实验室开发, MiXBLUP的核心是MiX99.MiXBLUP软件应用在奶牛育种, 肉牛育种, 猪育种, 家禽育种, 山羊育种, 绵羊育种等领域.MiXBLUP is developed by scientists of LUKE National Resources Institute Finland and the Animal技术支持商业版授权软件, 技术支持包括: 软件安装相关问题, 模型书写及运行相关问题. 网站提供相关的学习使用文档.MiXBLUP的特色速度快支持复杂模型适合所有动物育种可以处理大群体可以支持63个性状同时运行支持基因型和表型数据联合分析界面友好和其它软件链接友好可以运行在Windows和Linux平台提供专业化的技术支持MiXBLUP的结果文件估计育种值(BLUP, GBLUP)给出估算的标准误给出估算的准确性给出所有的效应值MiXBLUP可以处理数据和系谱中支持字符串基因组相关的文件格式都支持支持大数据性状数没有限制固定因子和随机因子数没有限制支持位置亲本或者遗传组其它遗传效应: 母体效应, 永久环境效应等随机回归模型基因与环境互作QTL效应可以包括到模型中, 支持IBD矩阵～～end～～。

基因数据分析的主流软件

基因数据分析的主流软件在过去的几年中，许多生物的基因组完成了测序工作，如何对如此庞大的原始序列信息进行分析和应用，正是现在最为棘手的问题。

大量的基因预测软件和在线工具应运而生。

如何广泛而深入地了解并能有的放矢地利用这些工具，已经成为21世纪分子生物学家的必修课。

随着大规模EST和cDNA序列信息的获取，那些基于表达序列同源范围的程序，在基因组注释中的作用日益显著。

即使在稀少基因或组织特异性表达的基因中，基因组序列的相关性信息也颇具参考价值。

所以利用基因组序列的比对来扩充基因的信息是不可获缺的。

特别是在对人类基因组做注释时，与那些相对完整的脊椎动物基因组，如小鼠和鱼类的基因组比较是必不可少的步骤。

许多基因组测序计划正在进行之中，尽管仍存在急需解决的问题，比较基因组学方法（comparative genome approach）被认为是最有应用前景的方法。

该方法不仅在基因预测中举足轻重，而且在鉴定调控基因、探索垃圾基因（junk gene）等方面的作用也不容忽视。

基因预测软件的用户应该认识到，软件预测结果的可靠性和置信水平都有较大程度的提升。

但这些毕竟是预测的结果，分子生物学家，总是试图证明真实存在的蛋白质，及其功能和在组织中的表达状态。

当前，已有超过60种真核基因组测序计划在进程之中。

然而生物学方面的相关注释还远不能匹配如此汹涌而至的原始序列数据。

当务之急是，研发出更多的准确而快速的分析工具，特别在寻找基因、确定其准确功能等应用方面。

许多基因预测程序都可以免费共享。

当前，几乎没有一个完美的程序可以解决用户们的所有问题。

这就需要用户最大程度地利用主流程序的整合优势。

基因数目预测的主流软件10年前，研究人员开始预测人类基因的数目，这个数目在很长时间没有明显改变。

几年前，最多的预测是100,000；当人类基因组完成测序时，这个数目降至30,000。

现在有降至20,000左右。

研究人员相信：充分考虑人类的基因组序列和其它生物的基因组序列，可以做出近似的估计。

分子生物学实验中的分析软件使用方法介绍

分子生物学实验中的分析软件使用方法介绍随着科技的发展和进步，分子生物学实验的数据量不断增加，对于这些大量的数据进行分析成为了科研工作者不可或缺的一部分。

为了更好地处理和解读这些数据，科研人员们使用各种分析软件来辅助他们的研究工作。

本文将介绍一些常用的分析软件及其使用方法。

一、基因序列分析软件基因序列分析软件是分子生物学实验中最常用的软件之一，它们用于分析DNA或RNA序列以及蛋白质序列。

其中，NCBI Blast是一种非常常用的基因序列比对软件，它可以通过将待比对的序列与已知的序列数据库进行比对，从而确定序列的相关性和相似性。

使用NCBI Blast，我们可以快速找到与我们研究对象相关的序列信息。

二、基因表达分析软件基因表达分析软件用于分析基因在不同组织或条件下的表达水平，以及基因调控网络等。

在这方面，R语言是一种非常强大的工具。

通过使用R语言中的各种包和函数，我们可以对基因表达数据进行聚类分析、差异表达分析、通路富集分析等。

同时，R语言还提供了丰富的数据可视化功能，可以帮助我们更好地展示和解读实验结果。

三、蛋白质结构分析软件蛋白质结构分析软件主要用于预测蛋白质的三维结构以及模拟蛋白质的动力学行为。

其中，Swiss-PdbViewer是一种常用的蛋白质结构可视化软件，它可以帮助我们观察和分析蛋白质的结构特征。

而GROMACS则是一种常用的分子动力学模拟软件，它可以模拟蛋白质在不同环境下的运动轨迹，帮助我们理解蛋白质的功能和机制。

四、基因组学分析软件基因组学分析软件主要用于处理和分析整个基因组的数据，包括基因组序列、基因组注释以及基因组变异等。

在这方面，Ensembl是一种非常常用的基因组分析软件。

它提供了大量的基因组数据和工具，可以帮助我们进行基因组注释、基因组比对以及基因组变异的分析。

五、细胞图像分析软件细胞图像分析软件用于分析和处理细胞图像数据，帮助我们了解细胞的形态和功能。

其中，ImageJ是一种非常流行的细胞图像分析软件，它提供了丰富的图像处理和分析工具，可以帮助我们进行细胞计数、细胞形态分析以及细胞追踪等。

基于高通量测序的基因序列分析软件

基于高通量测序的基因序列分析软件基因序列分析软件是基于高通量测序（high-throughput sequencing）技术的生物信息学工具。

这些软件能够帮助研究人员分析和解释基因组中的DNA序列信息，从而帮助他们理解基因的结构和功能，以及基因与疾病之间的关系。

以下是一些常用的基因序列分析软件：1. BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）BLAST是生物信息学领域最常用的工具之一、它能够在数据库中相似的DNA或蛋白质序列，从而进行序列比对和注释。

研究人员可以使用BLAST来识别已知序列的同源性，以帮助理解基因的功能。

2. GeneiousGeneious是一款强大的基因序列分析软件，具有丰富的功能和用户友好的界面。

它可以帮助研究人员进行DNA和蛋白质序列的比对、组装和注释，以及基因启动子和开放阅读框的预测。

除此之外，Geneious还提供了诸如基因家族和物种多样性分析等高级功能。

3. CLC Genomics WorkbenchCLC Genomics Workbench是一款全面的基因组学分析软件，适用于从原始测序数据开始的所有分析阶段。

它提供了一整套工具，包括测序质量控制、组装、变异检测、基因表达分析等。

CLC Genomics Workbench还具有可视化和报告功能，可以帮助用户更好地理解和解释分析结果。

4. TrinityTrinity是一款专门用于转录组分析的软件。

转录组分析是指通过测序和比对RNA序列，对特定组织或时间点的基因表达进行定量分析。

Trinity可以帮助研究人员对RNA测序数据进行预处理、组装和注释，以获得转录本及其转录水平的信息。

5. IGV（Integrative Genomics Viewer）IGV是一款基因组可视化工具，可以帮助研究人员在线浏览和分析基因组数据。

它支持多种数据类型，包括基因组、转录组、甲基化和染色体互作数据等。

基因测序分析软件的选择与使用教程

基因测序分析软件的选择与使用教程基因测序分析软件在生物信息学研究中扮演着至关重要的角色。

随着测序技术的快速发展，越来越多的数据被产生出来，需要强大而高效的分析软件来处理和解读这些数据。

本文将介绍基因测序分析软件的选择与使用教程，帮助读者更好地了解与应用这些工具。

一、基因测序分析软件的选择选择适合自己的基因测序分析软件是非常重要的，不同软件具有不同的功能和适用范围。

以下是一些常用的基因测序分析软件及其特点：1. BLAST：BLAST（基本局限序列比对搜索工具）是一种用于序列比对的基本工具。

它可以比较两个或多个序列，并通过计算相似性来评估它们之间的关系。

BLAST非常适合于寻找相关基因序列、片段或蛋白质序列。

2. Bowtie：Bowtie是一款用于序列比对的高效软件。

它能够在基因组数据中查找与给定序列片段相匹配的位置，并生成对应的比对结果。

Bowtie在处理大规模测序数据方面表现出色。

3. TopHat：TopHat是一款用于分析RNA测序数据的软件。

它能够从原始测序数据中鉴定基因表达模式，并帮助研究者理解基因调控机制。

TopHat对于RNA测序数据的分析和重组定位特别有用。

4. Cufflinks：Cufflinks是一个用于RNA测序数据分析的流行软件包。

它可以将测序数据定量转化为基因表达水平，并帮助识别新转录本和剪接变异。

Cufflinks在基因组学研究中具有广泛应用。

根据具体研究需求和测序数据类型选择适合的软件是至关重要的。

在选择之前，建议研究者先对自己的数据类型、分析目标和软件特点进行充分了解。

此外，网络上有许多生物信息学研究者的博客和论坛，可以从中获得宝贵的经验和指导。

二、基因测序分析软件的使用教程选择好适合的基因测序分析软件后，正确使用软件以获取准确的结果是至关重要的。

以下是一些基本的使用教程，供参考：1. 学习软件命令：大部分基因测序分析软件都是通过命令行界面运行的。

研究者需要先学习软件的命令语法和参数设置，以正确使用软件。

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比较。其优点是不但可以分析内参基因的稳
定性，而且可以比较目标基因的表达水平。

参考文献：Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper–Excel-based tool using pair-wise correlations， 2004， Biotechnology Letters
内参基因选择相关软件
相关软件
GeNorm程序
NormFinder 程序
获得最稳定的内参基因
BestKeeper 程序
GeNorm程序是Jo Vandesompele于 2002年编写的专门用qPCR方法选择内参基因的程序。geNorm程序核心原理是：不同实验条件或不同组织细胞中，2个理想看家基因表达水平的比值在所有样本中应当一致，表达水平比值变异度的增加意味着看家基因表达稳定性的下降。该程序将某一看家基因与其他看家基因表达水平的两两比值经对数变换后，计算其平均标准差作为基因表达稳定度的平均值M。对所有候选看家基因的表达稳定度进行排序，看家基因的M值越小，表示该看家基因的表达越稳定。GeNorm程序可以用于筛选任何组细胞的任意数量内参基因，选择出2个以上，而不是传统地使用单一内参基因，有利于系统偏差的校正，得到更可靠的相对定量结果。另外geNorm程序可以利用对标准化因子进行差异分析确定所需看家基因的最适数目。
GeNorm计算公式
BestKeeper是Michael等(2004)编写的针对内参基因和目标基因进行选择的程序。 BestKeeper软件可以比较100个样品中10个内参基因和10个目标基因的表达水平。具体操作是把原始数据输入BestKeeper 软件的Excel 表格中，内参基因和目标基因进行单独分析。 BestKeeper程序在每个基因之间产生配对的相关系数和BestKeeper指数（每个候选基因 Ct值的几何平均数），根据其值的大小进行
NormFinder 程序是用于选择合适内参基因的工具，由 Claus 等 2004 年编写其运行原理与 geNorm 程序类似，产生基因表达稳定值,然后根据稳定值排序，最终将表达稳定值最小的基因作为最稳定的基因。其缺点是只能选择一适的内参基因作标准。而 geNorm 程序通过基因配对的形式,筛选出最不稳定基因，然后将剩下基因重新排序重新
参考文献： Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes， 2002， Genome Biology
例如：
配对进行筛选，最终选出适当数目的合适基
因。
参考文献：Normalization of Real-Time Quantitative Reverse TranscriptionPCR Data: A Model-Based Variance Estimation Approach to Identify Genes Suited for Normalization, Applied to Bladder and Colon Cancer Data Sets， 2004， cancer research