生物素-亲合素系统
化学发光标记生物素
化学发光标记生物素引言：化学发光技术是一种常用的生物分析技术，在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域发挥着重要作用。
其中，化学发光标记生物素技术是一种常见的应用，通过将生物素与特定的化学发光物质结合，可以实现对生物分子的高灵敏度、高特异性的检测。
本文将介绍化学发光标记生物素的原理、应用和优势。
一、化学发光标记生物素的原理化学发光标记生物素是基于生物素-亲和素系统的原理进行设计与制备的。
生物素是一种维生素B7，具有与亲和素（如蛋白质A、蛋白质G等）结合的特性。
在化学发光标记生物素中，生物素首先与化学发光物质（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）结合，形成生物素-化学发光物质复合物。
然后，生物素-化学发光物质复合物与待检测的目标分子（如蛋白质、核酸等）结合，形成生物素-目标分子-化学发光物质复合物。
最后，在适当的条件下，化学发光物质发生催化反应，产生可见光或荧光信号，从而实现对目标分子的检测。
二、化学发光标记生物素的应用化学发光标记生物素在生物医学研究和临床诊断中得到广泛应用。
以下是几个常见的应用领域：1. 免疫分析：化学发光标记生物素技术可以用于检测抗体和抗原的相互作用，从而实现对疾病标志物的检测。
例如，在HIV感染的诊断中，可以使用化学发光标记生物素技术检测HIV抗体的存在。
2. 基因检测：化学发光标记生物素技术可以用于检测基因的存在和表达水平。
例如，在PCR扩增反应中，可以使用化学发光标记生物素技术检测扩增产物的存在与否，从而实现基因的定性和定量分析。
3. 药物筛选：化学发光标记生物素技术可以用于评估药物与靶标的相互作用强度。
通过将药物与生物素结合，然后与靶标结合，可以利用化学发光技术检测药物-靶标复合物的形成情况，从而评估药物的亲和力和选择性。
三、化学发光标记生物素的优势化学发光标记生物素技术相比传统的染色标记技术具有以下优势：1. 高灵敏度：化学发光标记生物素技术可以实现对目标分子的高灵敏度检测，因为化学发光信号产生的过程具有高放大倍数。
9章生物素亲和素
生物素活化
标记蛋白质醛基的活化生物素
标记蛋白质巯基的活化生物素
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
标记蛋白质氨基的活化生物素
标记核酸的活化生物素
三、生物素标记蛋白质
1. 标记方式 生物素化蛋白质衍生物有二类： 一种是生物素化的大分子生物活性物 质（如生物素化抗原、抗体） 另一种是标记材料（如酶）结合生物 素后制成的标记物（如生物素 化酶）。
亲和素与链霉亲和素不同点
特点 等电点 分子量(KD) 是否有糖基 非特异吸附
AV 10.5 67 有 多
SAV 6 .0 65 无 少
三、SA和SAV的标记物 几乎所有用于标记的物质均可以同AV和 SAV结合， 125I、胶体金、荧光素、化学发光物 等 小分子物质 酶、抗原、抗体等大分子物质
BAS技术基本类型
1.BAB法（biotin--avidin bind，BAB ）， 也称为桥联亲和素－标记生物素法 （BRAB） 2.标记亲和素-生物素法（BA） （labeledavidin-biotin，LAB）
BAS技术基本类型
BAB法
（biotin--avidin bind，BAB）
及既可偶联生物大分子，又可连接荧光
素、酶等标记材料的特性，使该系统在
标记免疫分析技术领域中的应用具有很
强的稳定性和适用性。
第二节
生物素的理化性质及其标记物
一、生物素的特性 生物素（biotin，B）又称维生素H，辅酶R 分子量-----244.31 广泛分布于动、植物组织中，常从含 量较高的卵黄和肝组织中提取。生物素分 子有两个环状结构
主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第十一章 生物素-亲和素放大技术
第十一章生物素-亲和素放大技术第一节生物素的理化性质与标记生物素（biotin）、亲和素（avidin）是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。
生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。
生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取。
一、活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。
生物素活化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。
（一）标记蛋白质氨基的活化生物素此种活化生物素的制备方法是将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺醣（BLAHS）。
BLAHS分子酯键中的—C-=0基团可与蛋白质分子中赖氨酸的氨基形成肽键。
从而使蛋白质标记上生物素。
（二）标记蛋白质醛基的活化生物素用于此类标记的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。
BHZ是水合肼与生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记。
（三）标记蛋白质巯基的活化生物素3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。
（四）标记核酸的活化生物素活化生物素可通过缺口移位法、化学偶联法、光化学法及末端标记法等技术使生物素的戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。
二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：1.生物素化的大分子活性物质，如抗原、抗体。
2.标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。
（二）标记方法1.标记抗体、抗原选用第二抗体进行生物素标记，制备的标志物具有通用性。
2.标记酶生物素标记辣根过氧化物酶第二节亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素和链霉亲和素是生物亲和素的天然特异性结合物。
ABC法亲和素与生物素系统的操作流程
ABC法亲和素与生物素系统的操作流程
亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法是许世明于1981年在BAB法和LAB法的基础上改良的，其特点是利用亲和素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。
ABC法与LAB法、BAB法不同的是第一抗体不为生物素所标记，生物素标记的第二抗体与ABC复合物相连接，最后进行显色反应定位。
复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素—过氧化物酶连接物与过量的亲和素反应而制备的。
ABC法与LAB法、BAB法相比较具有敏感性高、特异性强、背景染色淡等优点。
ABC法染色流程如下。
(1)4um石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3X3min。
(2)IHC的前处理视特异性一抗不同，可采用蛋白酶消化或热诱导的微波抗原修复(AR)，PBS洗3X3min。
(3)3％过氧化氢孵育10min(可省略)，以阻断内源性过氧化物酶活性。
(4)PBS洗3X3min。
(5)10％非免疫性动物血清孵育10min(可省略)，以减少非特异性背景，无需冲洗只需吸去多余血清。
(6)滴加适当稀释的第一抗体，37℃孵育60min或4℃过夜。
(7)PBS洗3X3min。
(8)滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30～60min。
(9)PBS洗3X3min。
(10)滴加ABC复合物(提前30min，A液与B液等量混合)，37℃孵育30～60min。
(11)PBS洗3X3min。
(12)0．04％DAB(含0．03％H：02)显色5～10min。
(13)复染，脱水，常规树胶封固和结果观察。
生物素亲和素
分子式：C10H16O3N2S 分子量：244.31 等电点：PH=3.5 溶解特性：难溶于水，易 溶于二甲基甲酰胺(DMF) 两个环状结构： I环（咪唑酮环）为与亲 和素结合的主要部位； II环（噻吩环）为结合抗 体和其它生物大分子的部 位，C2上戊酸侧链的未端 羧基是结合生物大分子的 唯一结构
分子量：68 000
比活性：A≥12u/mgP
亲和常数：1015/mol
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接后， 再与无水肼反应而成。 除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记特点：BHZ与蛋白质中的 醛基结合而标记
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)：
能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素
活化生物素可克服以上缺点，既减少空间位阻 效应，又可扩大其结合的对象。
生物素侧链的末
端羧基经化学修
饰后制成带各种 活性基团的衍生
物－活化生物素
(生物素化衍生 物)
标记蛋白质氨基的活化生物素
N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS） 长臂活化生物素（BCNHS）
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
注意事项：
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基 团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；
控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度 0.5~5μg/ml；生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab； 使用交联臂减少空间阻力
概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖 蛋白，可由蛋清中提取。 主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素 等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已 深入研究并得到广泛应用。 结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它 是与生物素结合的基团。
临床检验免疫学重点名词解释
一、名词解释1.ANA（抗核抗体）：是一组将自身各种细胞核成分作为靶细胞的自身抗体总称。
2.BAS（生物素–亲合素系统）:基于生物素和亲合素既能偶联抗原（或抗体）分子，又能偶联酶、荧光素等示踪物质，可桥联抗原抗体系统和示踪物质指示系统。
3.包被:将抗体或抗原结合在固体载相上的过程。
4.CH50试验:绵羊红细胞与溶血素结合形成的免疫复合物激活血清中的补体，引起红细胞溶血，以50%溶血为判断终点来测定血清总补体活性。
5.CD分子（簇分化抗原）:有核细胞在不同发育阶段其在细胞膜表面均可表达不同的分化抗原，形成不同的细胞类群。
6.沉淀反应:是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现可见的沉淀现象。
7.多克隆抗体:在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体。
8.单克隆抗体:单个B细胞参与融合形成的单个杂交瘤细胞经分离克隆化，产生针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，具有性质纯、效价高、特异性强、少或无血清交叉反应等优点。
9.等价带：当抗体过量时，IC（免疫复合物）的形成随着抗原递增至抗原、抗体比例最适处达最高峰。
前带：高峰区域左侧，抗体浓度过高，沉淀反应不明显后带：高峰区域右侧，抗原浓度过高，沉淀反应不明显10.封闭:加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质部分地非特异性吸附于固相载体表面，加入1%~5%牛血清白蛋白或5%~20%小牛血清再包被一次，消除此干扰的过程。
11.HLA:是引起同种异体移植排斥反应最强的抗原，与HVGR或GVHR有关。
12.化学发光剂:在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物。
13.胶体金:是金盐被还原成金原子后形成的金颗粒悬液。
14.间接凝集反应:可溶性抗原/抗体先吸附于颗粒性载体表面，与相应抗体/抗原作用，在适宜的电解质存在条件下出现特异性凝集现象。
15.抗原抗体结合的可逆性：抗原与相应抗体结合形成复合物后，在一定条件下又可解离为游离的抗原与抗体的特性。
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验 复习习题 第十一章 生物素-亲和素放大技术(附答案解析)
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第十一章生物素-亲和素放大技术（附答案解析）一、A1型题1、每个亲和素能结合生物素分子的数目是（）A、4B、2C、1D、3E、82、以下关于生物素-亲和素系统（BAS）的说法错误的是（）A、1个亲和素分子可结合4个生物素分子B、1个生物素分子可以结合多个亲和素分子C、生物素易与抗体、酶、多聚核苷酸结合D、亲和素易与酶、铁蛋白、荧光素、核素结合E、亲和素和生物素.有极强的亲和力3、免疫组化技术的优点不包括（）A、高特异性B、高敏感性C、形态学的直观性D、精确定量分析E、能对抗原表达情况进行分析4、BAS在ELISA技术中应用最广泛的反应模式是（）A、ABAB、ABCC、BRABD、BAE、LAB5、免疫组化染色前，对标本进行固定的目的是（）A、保存组织细胞的抗原性B、防止细胞脱落C、防止细胞自溶D、终止胞内酶的活性E、使细胞内蛋白质凝固6、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原7、关于亲和素-生物素系统的错误描述是（）A、用于间接包被B、用于终反应放大C、用于酶免疫测定D、用于胶体金测定E、不用于荧光免疫测定8、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原9、关于生物素标记蛋白质的注意事项，下列说法错误的是（）A、根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件B、活化生物素与待标记抗原或抗体可以为任意比例C、在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构可减少空间位阻影响D、生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性E、生物素标记酶时会影响其免疫活性10、亲和素和生物素结合的特点是（）A、免疫反应B、不属于免疫反应C、特异性弱D、亲和力小E、不够稳定二、B型题1、 A.ABCBC.BABD.直接法BASE.间接法BAS<1> 、标记亲和素-生物素的方法为（）；<2> 、亲和素-生物素化酶复合物技术为（）；<3> 、生物素化第二抗体为（）；<4> 、生物素化第一抗体为（）。
生物素-亲和素系统elisa法
生物素-亲和素系统ELISA法是一种基于生物素和亲和素之间高度特异性和高亲和力的免疫检测方法。
这种方法利用生物素和亲和素之间的结合反应，将抗原或抗体与生物素结合，再通过亲和素与生物素之间的结合反应，将抗原或抗体固定在固相载体上。
在ELISA中，生物素-亲和素系统可以用于提高检测的灵敏度和特异性。
首先，亲和素与生物素之间的结合反应非常稳定，可以减少非特异性结合，提高检测的特异性。
其次，每个亲和素可以结合4个生物素，使得反应信号放大，提高检测的灵敏度。
生物素-亲和素系统在ELISA中的应用有多种形式，包括用于固相化抗体或抗原的制备、用于ELISA终反应的放大等。
在固相化抗体或抗原的制备中，先将亲和素（或链霉亲和素）包被于固相载体，抗体或抗原也先与生物素结合，然后通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化。
在ELISA终反应的放大中，用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗体，然后连接亲和素-酶结合物（BA-ELISA）、或亲和素及酶标生物京（BAB-ELISA）或ABC试剂（ABC-ELISA），从而使反应信号放大，提高检测灵敏度。
总之，生物素-亲和素系统ELISA法是一种灵敏度高、特异性好的免疫检测方法，可以用于各种抗原或抗体的检测。
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生物素-亲合素系统
生物素－亲合素系统（Biotin-Avidin—System，BAS）是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。
随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。
生物素亲合素系统
1979年Guesdon利用生物素和亲合素间具有高度亲合力的特点，建立了标记亲合素和生物素法（LAB／BA）与桥联亲合素—生物素技术（BRAB）。
1981年Hsu首次报告了改进的亲合素—生物素—过氧化酶复合物法（ABC法）。
近年大量研究证实，生物素—亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合，如酶、荧光素、同位素、凝集素、铁蛋白、S PA等。
生物素—亲合素与标记试剂高亲合力的牢固结合及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。
BAS已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。
BAS用于检测的基本方法可分为三大类。
第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。
第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分
子反应体系和标记生物素，称为BAB法，或桥联亲和素-生物素法(BRAB)。
第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。
尽管方法很多，但在目前国内主要还是BAS-ELISA法。
特别是其中的BA法和ABC法用得较多。
至于其它标记材料(如荧光素、铁蛋白和血蓝蛋白等) 的BAS检测系统，只要制备或得到了相应标记物，再根据B AS的基本原理及基本方法即可自行探索建立实验程序。
BAELISA原理
BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。
亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kD a，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。
生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。
这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。
链霉亲和素及其活性
链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。
链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基；链霉亲和素是一种稍偏酸性（pH6.0）的蛋白质，并且不带任何糖基。
1 t. \3 I* d, V4 B5 F: s 链霉亲和素分子中每条肽链都能结合一个生物素，因此与亲和素一样，一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数（K）亦为1015L ／mol。
在蛋白水解酶作用下，链霉亲和素可在N端10～12和Ｃ端19-21间断裂，形成的
核心链霉亲和素仍然保持完整的结合生物素的能力。
链霉亲和素的活性单位也是以结合1μg生物素所需的量来表示，１mg链霉亲和素的最高活性可达18U。
生物素亲和素系统的特点
（biontin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244．31kD．生物素分子有两个环状结构（图11-1），其中Ⅰ环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要郎部位；II环为噻吩环，Ｃ２上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的惟一结构，经化学修饰后，生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素（图1）。
亲和素（avidin，AV）亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kD，等电点pＩ=１０.５；耐热井耐受多种蛋白水解酶的作用．尤其是与生物素结合后，稳定性更好。
每个亲和素能结合4个分子的生物素，二者之间的亲和力极强，亲和素常数（K）为1015Ｌ／mol，比抗原与抗体间的亲和力（K＝10.5～11L／mol）至少高1万倍，因此二者的结合特异性高和稳定性好。
亲和索以结合１μg生物素所需的量作为其活性单位，1mg纯的亲和素的活性约为13—15U。
因此，BAS即可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。
BAS在实际应用中所具有的巨大优越性，主要表现在以下几个方面。
1.灵敏度
生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比恬度高，具多价性。
此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。
因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
2.特异性
亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。
因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。
而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。
3.稳定性
亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。
因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。
4.适用性
生物素和亲和素均可制成多种衍生物，不仅可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合，用于检测体液、组织或细胞中的抗原-抗体、激素—受体和核酸系统以及其他多种
生物学反应体系，而且也可制成亲和介质，用于分离提纯上述各反应体系中的反应物。
此外，多种BAS的商品化试剂，为临床检测和科研工作提供了有利条件。
5.其他
BAS可依据具体实验方法要求制成多种通用性试剂（如生物素化第二抗体等）适用于不同的反应体系，而且都可高度稀释，用量很少，实验成本低；尤其是BAS与成本高昂的抗原特异性第一抗体偶联使用，可使后者的用量大幅度减少，节约实验费用．此外，由于生物素与亲和素的结合具高速、高效的特性，尽管BAS的反应层次较多，但所需的温育时间不长，实验往往只需数小时即可完成。