Nature Methods：一种全新的邻近蛋白质生物素化标记方法—可直接用于原代组织

Nature Methods：一种全新的邻近蛋白质生物素化标记方法—可直接用于原代组织

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研究意义

在生物学研究中，获取某一细胞系的蛋白质相互作用图谱或许并不难，但是直接从原代组织中检测蛋白质组图谱甚至它们之间的相互作用是一个重大的挑战。近日，来自美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)的研究团队设计了一种新的生物素标记方法，用抗体代替传统的酶融合，标记靶蛋白邻近的蛋白。即使用针对靶蛋白的抗体来引导生物素沉积到与其相邻的蛋白质上，通过链霉亲和素磁珠捕获这些蛋白质并用质谱鉴定，样本可以是细胞或原代组织。该团队使用这种方法检测了多种细胞和组织类型中靶蛋白即核纤层蛋白A的邻近蛋白组成。

有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分都是与分子伴侣或者其它蛋白质组装在一起发挥作用。蛋白质组装（Protein assemblies）对于所有活细胞的功能都至关重要。细胞或组织中完整的蛋白质-蛋白质相互作用网络称为蛋白质相互作用组（protein interactome），是动态的，会随着时间、发展阶段、细胞周期进程或组织类型而改变。因此，表征蛋白质之间的相互作用可以获得靶蛋白质的位置和功能等重要信息。然而，特定突变对组织特异性蛋白质相互作用组的影响很少被详细研究。

我们都知道单个基因的不同突变可能会导致不同的疾病。如核纤层蛋白 A / C （LMNA）基因有400多个不同的突变，会产生超过14种不同的表型，这些表型引起不同病症包括脂肪营养不良、肌营养不良和早衰综合症。然而这些单基因突变与其高度可变表型之间的机制联系尚不清楚。尤其是组织特异性核纤层蛋白（lamin）的相互作用组也有待阐明。

通过标准的免疫共沉淀（CoIP）分析核纤层蛋白的相互作用组是不切实际的，因为由核纤层蛋白长丝产生的不溶性高阶结构导致无关蛋白的过量沉淀。已经用各种遗传和生物化学方法来鉴定核纤层蛋白A的相互作用蛋白，如利用生物素化的邻近标记方法、表达高亲和力的OneSTrEP-标签和免疫共沉淀、蛋白芯片等。虽

然这些方法鉴定了多个已知和新型的相互作用蛋白，但它们的应用仅限于单细胞系。而且之前基于生物素化的邻近标记方法还需要在细胞系或种系中预先插入融合基因，因此它们不能用于原代人组织样本。为了克服这些限制，作者开发了一种抗体引导的，基于邻近的标记方法，称为抗体识别生物素化（BAR，Biotinylation by antibody-recognition），可以标记和分离靶蛋白附近的蛋白。

什么是抗体识别生物素化（BAR）方法？

图1 抗体识别生物素化（BAR）方法。细胞或原代组织样品被固定并透化。一抗结合感兴趣的靶蛋白，带有HRP的二抗结合一抗。在生物素-酪胺偶联物（biotin-tyramide）和过氧化氢的孵育下，HRP催化生物素偶联物产生自由基，附着在与靶蛋白相邻的蛋白质上并使其生物素化。通过与生物素具有高亲和力的链霉亲和素磁珠分离蛋白质，用western印迹和质谱进行分析。

BAR法用于鉴定靶抗原附近的蛋白质（图1）。在固定的和透化的组织样品中，使用一抗来靶向感兴趣的蛋白质。在过氧化氢和生物素-酪胺（biotin-tyramide）的存在下，HRP（辣根过氧化物酶）缀合的二抗产生自由基，其导致靶蛋白质的

相邻蛋白质发生生物素化。使用链霉亲和素（Streptavidin）包被的磁珠来沉淀生物素化的蛋白质，然后通过串联质谱法检测。

作者将该方法应用于线粒体验证了灵敏度和特异性，并成功地利用此方法表征多种细胞系和组织中的核膜（nuclear envelope，NE）组成。

核纤层蛋白是核膜（NE）的重要结构元件。如（图2）所示，作者应用BAR鉴定了Hela细胞中核纤层蛋白A / C附近的蛋白质。从超分辨率显微镜可见，生物素成功沉积在核膜（NE）上。

图2 超分辨率显微镜显示NE上的生物素沉积（核纤层蛋白A / C抗体;左）（FITC-抗生物素蛋白;右）。

细胞培养虽然可以模仿整个生物体内发生的相关过程，但在许多情况下并非是有效的。为了克服这些局限性，作者试图在与核纤层蛋白病相关的原发性人体组织中鉴定核纤层蛋白A / C的相互作用蛋白。作者成功地在死后组织标本中标记了NE。如（图3a），肌肉肌原纤维在细胞核中形成凹槽，这不仅与核纤层蛋白A / C 的分布相关，而且与DNA相关。脂肪样品中的一些细胞核具有甜甜圈形状（图3b），这是以前在细胞培养中但未在原代人组织中报道的表型。总体而言，骨骼肌组织显示与平滑肌组织的相似程度高于脂肪组织。这些结果提供了进一步的证据，NE 组成在不同组织之间变化。

图3a，原代人骨骼和平滑肌组织的成像。用核纤层蛋白A / C抗体（红色;左图）对NE进行成像，用FITC-抗生物素蛋白（绿色;第二幅图像）对生物素进行成像，并用DAPI（蓝色;第三幅）对DNA进行成

像。b，来自原代人脂肪组织的甜甜圈形状的核。

通过用抗体代替酶融合，这种方法具有以下几个特点。（1）BAR不需要为每种感兴趣的蛋白质生成单独的细胞系或动物模型。使用抗体可以防止任何与蛋白质融合有关的假象。但是标记不区分直接相互作用与近端蛋白质。（2）可以用于组织特异性蛋白。BAR在疾病相关的原发性组织中鉴定出某些临床相关的蛋白质，这些蛋白质在先前的研究中未被鉴定，也没有在HeLa细胞中被BAR鉴定为核纤层蛋白A / C相互作用蛋白。例如，抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物中的突变可导致各种肌肉营养不良，类似于由核纤层蛋白A / C突变引起的肌肉营养不良，作者发现该复合物的多个成员在骨骼肌NE附近被发现（图4）。鉴于其在核周边的富集，推测该复合物可能在调节肌肉组织的NE形态和核位置方面具有结构性作用。该复合物的多个成员是跨膜蛋白，复合物甚至有可能渗透到核周间隙中，从而促进与内核膜的蛋白质的相互作用。（3）可以比较不同条件下靶蛋白的相互作用组。在表达progerin的HeLa细胞或HGPS成纤维细胞中，BAR可以鉴定新的疾病相关蛋白，如PTRF，之前并不知晓与progerin有关。之前有报道lamin A调节PTRF转录，PTRF和CAV1抑制NRF2并促进早衰。本文发现虽然在HeLa细胞中几乎看不到PTRF和CAV1肽，但是这些蛋白质在成纤维细胞以及原代肌肉组织中给出强烈

的信号。此外，仅在肌肉样品中观察到CAV1的清晰的核膜定位（图5），强调需要探索相关组织中NE组成的变化。

图4 免疫荧光显示在小鼠骨骼肌中定位于核周围（蓝色为DAPI染色的DNA）的肌聚糖（SGCA;绿色）

图5 CAV1在原代人肌肉组织中的免疫荧光图像。用CAV1抗体显现的CAV1（左）与用DAPI显现的DNA

合并（右）。

总之，在未来的研究中，可以利用这种抗体识别生物素化（BAR）方法直接从患者和对照的临床样本中表征各种蛋白质的相互作用组，从而阐明遗传和非遗传因素（如患者的生活史）对蛋白质相互作用组的影响。

图6 Biotin-tyramide的结构式

原始论文：

Biotinylation by antibody recognition—a method for proximity labeling. Nature Methods.

Published Online 18 December 2017.