利用PCRDGGE技术分析桑天牛成虫肠道细菌菌群
PCR-DGGE技术分析蛋鸡MHC基因对肠道细菌种群结构的影响
PCR-DGGE技术分析蛋鸡MHC基因对肠道细菌种群结构的影响倪学勤;Joshua Gong;Hai Yu;Shayan Sharif;曾东【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2009(042)007【摘要】[目的]研究蛋鸡MHC(Ma jor Histocompatibility CompIex,主要组织相容性复合物)基因对不同周龄和不同部位肠道细菌种群结构的影响.[方法]使用基于16S rDNA的PCR-DGGE技术,结合特异性和共性条带割胶回收DNA进行克隆和测序,对2,4,6和8周龄商品蛋鸡和15I5系蛋鸡嗉囊、十二指肠、空肠、回肠和盲肠内含物细菌群落的结构和多样性进行比较,鉴定8周龄蛋鸡部分特异性和共性群落成员.[结果]商品蛋鸡和15I5系蛋鸡盲肠细菌的多样性最高,其次是回肠和空肠,嗉囊和十二指肠的细菌多样性比较低,且随着蛋鸡周龄增加,各肠段细菌多样性呈上升趋势,MHC基因对细菌多样性无显著影响.DGGE图谱聚类分析表明,蛋鸡MHC基因对4,6周龄肠道细菌的影响最大,对2周龄影响最小;而且MHC基因对消化道前段细菌的影响小于对后段影响.序列分析发现,8周龄商品蛋鸡和15I5系蛋鸡均有大量的三得利乳杆菌(Lactobacillus suntoryeus),是蛋鸡消化道前段的优势细菌;商品蛋鸡空肠、回肠和盲肠中的特异性条带主要是Ochrobactrum spp,索氏梭菌(Clostridium sordellii),超巨巨单胞菌(Megamonas hypermegale)和大量不可培养的细菌;15I5系蛋鸡的特异性条带主要是不可培养的细菌.[结论]蛋鸡MHC基因可影响不同周龄、不同肠段细菌群落的结构.【总页数】8页(P2564-2571)【作者】倪学勤;Joshua Gong;Hai Yu;Shayan Sharif;曾东【作者单位】四川农业大学动物医学院,四川雅安,625014,中国;Food Research Program,Agriculture and Agri-Food Canada,Guelph,Ontario,加拿大rn;Food Research Program,Agriculture and Agri-Food Canada,Guelph,Ontario,加拿大rn;Department of Animal and Poultry Science,University ofGuelph,Guelph,Ontario,加拿大;四川农业大学动物医学院,四川雅安,625014,中国【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.方斑东风螺地膜覆沙池和潮线下养殖系统细菌种群结构的PCR-DGGE分析 [J], 李淑芳;邱德全;张继东;杨世平;邱明生2.海绵共附生细菌种群组成的PCR-DGGE基因指纹分析 [J], 李志勇;何丽明;蒋群3.16S rRNA基因的PCR-DGGE技术分析茶尺蠖幼虫肠道细菌种群结构及多样性[J], 靳亮;王金昌;王洪秀;张贱根;杨罡;靳海燕4.采用 PCR-DGGE 技术分析白蚁肠道内细菌种类 [J], 江涛;葛明伟;李周勉;易锦辉;俞辉;和小明5.采用PCR-DGGE技术分析蛋鸡肠道细菌种群结构及多样性 [J], 倪学勤;Joshua Gong;Hai Yu;曾东;Shayan Sharif;周小秋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
利用ERIC_PCR和PCR_DGGE技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样
动物营养学报2010,22(4):9852991Chinese J ournal of Animal Nutritiondoi :10.3969/j.issn.10062267x.2010.04.026利用ERIC 2PCR 和PCR 2D GGE 技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样性潘康成 陈正礼 崔恒敏3 冯 兴 盛 琴 赵 爽(四川农业大学动物医学院,动物疫病与人类健康四川省重点实验室,雅安625014)摘 要:本文旨在采用ERIC 2PC R 和PC R 2D G G E 方法研究肉鸡喂服枯草芽孢杆菌后肠道菌群的多样性。
选用15羽28日龄肉鸡,按2mL /kg B W 喂服枯草芽孢杆菌悬液(109C FU/mL ),每天2次,连续3d ,34日龄时,利用ER IC 2PC R 和PC R 2D G G E 方法分析肠道菌群的多样性,并对D G G E 条带进行回收、测序。
结果表明,肉鸡口服枯草芽孢杆菌后各肠段的条带数显著多于对照组(P <0105或P <0101),2种方法检测结果相似,2组之间肠道总菌群相似性为5312%;电泳指纹图谱和统计条带数量分析,PC R 2D G G E 明显优于ERIC 2PC R ;回收条带以乳杆菌属细菌为主。
结果提示,34日龄肉鸡肠道菌群具有一定的稳定性,以乳杆菌为主要菌群,饲喂芽孢杆菌后能提高肉鸡肠道菌群的丰度和种群密度;PC R 2D G G E 检测方法明显优于ERIC 2PC R 。
关键词:枯草芽孢杆菌;肉鸡;肠道菌群;多样性;ERIC 2PC R ;PC R 2D G G E中图分类号:S831 文献标识码:A 文章编号:10062267X (2010)0420985207收稿日期:2010-01-14基金项目:“教育部长江学者和创新团队发展计划”创新团队资助项目(I R T0848)作者简介:潘康成(1971-),男,苗族,贵州榕江人,副教授,博士,主要从事动物微生态学和发酵工程研究。
应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析
。应用 “ G1 夹板” 技术可使检出率
应用 !""# 研究微生物群落时的常见问题分析
邢德峰， 任南琪"
（哈尔滨工业大学市政环境工程学院 哈尔滨 &($$.$）
摘
要： 变性梯度凝胶电泳 （G008） 是通过核酸片段对微生物群落进行研究， 可以监测未培养细菌及其功能基因，
被广泛地应用于微生物群落多样性和动态分析， 并成为微生物分子生态学研究中的重要手段之一。文中论述了 并提出了相应的解决方法。全面分析了样品预处理过程和 HIJ 扩增效果对 G008 操作过程中遇到的常见问题， 探讨了 G008 图谱的优化过程和图谱分析方法， 并对 G008 的应用前景进行了综述。 G008 分析的影响， 关键词：G008；微生物群落；微生物分子生态学；图谱分析；排序 中图分类号：K.%1L& 文献标识码： ) 文章编号： $$$&4"#$.（#$$"）$#4$%%&4$( 的操作过程， 对一些常见问题进行了整理和分析， 并提出了 相关的解决办法。
" 通讯作者。 23-： 1"4!(&41"#1#&&$； 567： 1"4!(&41"#1#$$1； 8496,-：+:;< =,> ? 3@A ? B:，,7@C< D6=EE? BE9? B:
作者简介： 邢德峰 （&.// F ） ， 男， 黑龙江人， 博士研究生， 研究方向为环境生物技术。 8496,-：,7@C< D6=EE? BE9? B: 收稿日期： 接受日期： 修回日期： #$$(4&$4#(； #$$(4$(； #$$(4&%
应用PCR-DGGE技术对不同日龄仔猪肠道菌群分布规律的研究的开题报告
应用PCR-DGGE技术对不同日龄仔猪肠道菌群分布规律的研究的开题报告一、研究背景和意义肠道是动物体内最重要的微生态环境之一，肠道菌群对于宿主的生长发育、消化吸收、免疫调节等方面都有着重要的影响。
仔猪的肠道菌群在出生后的短时间内会有显著的变化，在不同的生理阶段，肠道菌群的种类和总量也会发生变化。
因此，研究不同日龄仔猪肠道菌群分布规律，对于优化饲养管理、提高养殖效益具有重要的参考价值。
传统的细菌培养方法由于只能培养一小部分细菌，无法全面反映肠道微生态状态。
PCR-DGGE（聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳）技术能够通过PCR扩增16S rRNA基因的特异序列，并利用变性梯度凝胶电泳将PCR产物分离和检测，从而全面分析肠道微生态菌群的组成和分布规律。
二、研究内容和方法（1）研究内容本研究将应用PCR-DGGE技术研究不同日龄仔猪肠道菌群分布规律，具体内容如下：1. 收集不同日龄仔猪的肠道样品，包括出生后第1日、第7日、第14日、第28日、第42日等不同日龄段的仔猪。
2. 提取肠道样品中的总DNA，利用PCR扩增16S rRNA基因的特异序列。
3. 将PCR产物进行变性梯度凝胶电泳，对电泳图谱进行分析和比较。
4. 根据DGGE图谱中的带谱，结合16S rRNA序列信息，分析不同日龄仔猪肠道菌群的组成和分布规律。
（2）研究方法1. 采集样品：收集不同日龄仔猪约50只，体重相近，选取肠道内容物样品。
2. 提取DNA：使用DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书提取肠道样品中的总DNA。
3. PCR扩增：采用通用引物对16S rRNA基因的V1-V3区域进行PCR扩增，PCR 反应体系约50ul，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，共30个循环，最终72℃延伸10min。
4. DGGE分析：DGGE电泳采用DCode系统，在8%聚丙烯酰胺凝胶上进行，电泳条件为60℃，电压200V，电泳时间8h，Gelred染色。
PCR_DGGE的原理及在动物肠道菌群分析中的应用
PCR-DGGE的原理及在动物肠道菌群分析中的应用吴高锋1,李文刚2,高卫科1,魏娟1,杨慧敏1,王鑫1(1.河南农业大学,郑州450002; 2.郑州牧专,郑州450011)摘要:肠道菌群是机体常在菌群的重要组成部分,机体的健康和疾病的发生和发展与其多样性及种群的变化有着密切关系。
因此,对肠道菌群进行研究具有重要意义。
变性梯度凝胶电泳(DG GE)主要是基于突变型和野生型核酸序列的不同而导致其变性浓度的差异,利用变性梯度胶进行分离。
它是一种分析微生物群落的有效工具,可以用于研究肠道菌群结构多样性和种群结构的变化。
作者对PCR-D GGE的原理、优缺点及在动物肠道菌群分析中的应用和前景作一简要综述。
关键词:P CR-DGG E;肠道菌群;原理;应用中图分类号:Q503文献标识码:A文章编号:1671-7236(2008)06-0037-03动物肠道中寄生着种类繁多和数量巨大的微生物,它可以促进营养的消化吸收,诱导黏膜免疫保护,甚至调节宿主脂肪的储存等功能,要了解这些过程均需要解析相关的微生物学信息,并且这些微生物主要是由大量细菌组成的。
因此,对肠道菌群结构多样性及种群动态变化进行研究具有至关重要的意义。
在DNA分子技术出现之前,人们对肠道微生物的认识大多数是靠纯培养或靠直接形态观察来获得部分信息。
但是由于微生物形态过于简单,并不能提供太多的信息,而且肠道内微生物很多都是厌氧菌,目前只有少部分微生物能够被分离培养,若以这部分的微生物来代表肠道中复杂的微生物菌群将导致极大的偏差。
Pace等(1986)首先用核酸测序技术研究微生物生态和进化,将分子生物学技术应用于微生态学的研究,开辟了认识微生物的新途径。
分子生物学技术的应用克服了传统方法的限制,使得微生物学者可以从基因水平上估计种的丰度、均度,查明种的变异情况等,从而可以客观上认识微生物的天然的生态状况。
目前用于肠道菌群研究的分子技术有rRNA/rDNA序列分析、RAPD(随机扩增多态性分析)、ERIC-PCR、TGGE(温度梯度凝胶电泳)、PCR-DGGE(denaturing gradient g el e-lectr ophoresis,变性梯度凝胶电泳)等。
PCR-DGGE法分析中华按蚊肠道菌群种类
PCR-DGGE法分析中华按蚊肠道菌群种类摘要：采用PCR-DGGE技术对中华按蚊成虫肠道细菌多样性进行研究，共检测到12条16S rRNA基因序列。
在系统发育地位上主要归入3个细菌纲：丙型变形菌纲、黄杆菌纲和放线菌纲，其中有59.8%的细菌属于丙型变形菌纲，占绝对优势，成为中肠主要细菌群落。
从而显示出中华按蚊成虫肠道细菌的复杂性和多样性关键词：中华按蚊，PCR-DGGE，肠道菌群，多样性中华按蚊是我国传播疟疾的主要媒介，是重要的医学昆虫之一。
长期大量使用化学杀虫剂，导致蚊虫抗药性的出现和扩散、并严重污染环境[1]。
因此，采用生物防制方法灭蚊引起了医学昆虫界及世界卫生组织专家的广泛关注。
Micks 等(1961)曾报道按蚊肠道细菌密度减少与疟原虫密度增加的关系；抗生素试验也表明减少按蚊中肠细菌将增加按蚊感染疟原虫的几率，按蚊肠道细菌群落结构变异影响疟原虫在按蚊肠道中的发育(Beier et al.，1994)。
传统研究肠道菌群的方法存在极大的局限性，纯培养只能研究比较容易培养的微生物[2]。
目前肠道中能培养的细菌仅占肠道内总细菌数的10%-50%，随着分子生物学技术的发展和相关研究的累计，逐步建立起来以微生物基因组DNA序列信息为依据，通过分析样品中DNA分子的种类和数量来反映微生物之间、区系组成、群落结构以及微生物与其周围环境条件相互作用关系的体系[4]。
本文通过将PCR-DGGE法用于中华按蚊肠道细菌多样性的分析，鉴定其共生细菌种类，分析其分子多态性。
1、主要材料与仪器QI Aamp DNA Stool Mini Kit（德国Qiagen公司）；细菌通用引物（Zhang & Jackson，2004）（上海捷瑞生物工程有限公司）；PCR扩增试剂（北京鼎国生物技术公司）；40%丙烯酰胺；10%过硫酸铵（APS）；0％变性储备液（总体积100 ml）：40％丙烯酰胺 15ml，50×TAE 缓冲液 2ml，ddH2O 83ml；100％变性储备液（总体积100 ml）：40％丙烯酰胺 15ml， 50×TAE 缓冲液 2ml，去离子甲酰胺40ml，尿素 42g，ddH2O加到100ml。
PCR-DGGE分子技术及其在畜牧业中的应用
PCR-DGGE分子技术及其在畜牧业中的应用
何涛;张海军;武书庚;齐广海
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2008(035)007
【摘要】传统的以微生物培养为手段的研究方法极大地限制了对微生物的研究.作者综述了以16S rRNA为主要研究对象的DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)技术的原理及优缺点,以DGGE为主要手段结合PCR扩增分析对微生物的群落结构和多样性研究的最新动态.
【总页数】4页(P36-39)
【作者】何涛;张海军;武书庚;齐广海
【作者单位】中国农业科学院饲料研究所,北京,100081;中国农业科学院饲料研究所,北京,100081;中国农业科学院饲料研究所,北京,100081;中国农业科学院饲料研究所,北京,100081
【正文语种】中文
【中图分类】S818.9
【相关文献】
1.分子技术在微生物修复中的应用 [J], 欧阳紫邦
2.分子技术在临床微生物检验中的应用 [J], 李美丽
3.单分子技术在G蛋白偶联受体二聚体中的应用 [J], 蔡欣; 王春勇; 王德秀; 苏文霞; 鲁洪; 王凤斌
4.分子技术在食源性致病微生物检测中的应用 [J], 邵炳[1]
5.分子技术在食品微生物检测中的应用 [J], 郑波
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人肠道菌群PCR-DGGE方法的建立及脾虚患者的研究的开题报告
人肠道菌群PCR-DGGE方法的建立及脾虚患者的研究的开题报告一、研究背景人肠道菌群是指在人体肠道中生长的各种微生物群落，包括细菌、真菌和病毒等。
肠道菌群在人体消化、吸收和免疫等多个方面起着至关重要的作用。
目前，越来越多的研究表明肠道菌群与人体健康密切相关，它们的改变与多种疾病的发生、发展和治疗效果密切相关。
因此，研究肠道菌群的结构、功能及其对人体健康的影响，对于促进人类健康具有重要的意义。
PCR-DGGE是一种常用的肠道菌群研究方法，通过PCR扩增目标基因序列，将不同样品的PCR产物经过DGGE（变性梯度凝胶电泳）检测出差异，从而确定菌群的组成结构和多样性。
然而，PCR-DGGE方法在样品处理和操作环节中容易出现一系列问题，如样品预处理不当、恒温原则和DGGE带解析等，这些问题影响了PCR-DGGE法的特异性、重复性和准确性。
因此，建立PCR-DGGE方法并进行优化是非常必要的。
脾虚是中医学上的一种证候，表现为肌肉松软无力、易疲乏乏力、面色黯淡、食欲不振等症状。
脾主土，主管运化水谷，为人体生命活动所必需。
由于现代饮食结构的改变和生活方式的差异，脾虚已成为常见的调节性疾病。
然而，脾虚的病因及其与肠道菌群的关系尚不明确。
因此，研究脾虚患者的肠道菌群结构与多样性，评估肠道菌群与脾虚间的关系，对于揭示脾虚的病因及推进相关疾病的预防与治疗具有重要的意义。
二、研究目的与内容1. 建立PCR-DGGE方法进行肠道菌群的研究，并对该方法进行优化。
2. 收集脾虚患者的粪便样本进行肠道菌群研究，探讨脾虚患者肠道菌群结构与多样性的变化规律。
3. 利用多元统计学方法对肠道菌群与脾虚间的关系进行分析，评估脾虚患者的肠道菌群与健康人群的差异。
三、研究方法与技术路线1. 采集脾虚患者的粪便样本，提取微生物DNA并进行PCR扩增。
选择16S DNA V3区作为基因靶标，用DGGE进行DNA基因图谱分析，统计并分析不同样品之间菌群结构的相似性与差异性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
０７１０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ａｃｑｕｉｒｅ ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉｎ Ａｐｒｉｏｎａ ｇｅｒｍａｒｉ ａｄｕｌｔ，ＰＣＲ—ＤＧＧＥ
（由上海生Ｔ生物工程技术服务有限公司合成）用 于扩增。引物序列分别为：２７ｆ（５’一ＧＡＧＡＧＴＩＴ－
ＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’），１４９５ｒ（５ ７・ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴ－
ＴＧ，１１’ＡＣＧＡ．３ ＣＡＧ－３
虫的健康状况就会受到严重的威胁。因此，对昆虫
肠道微生物多样性的研究受到关注。
７）；２７ｆ（５
４３
后将胶碾碎，加３０肛Ｌ水于沸水中煮沸１５ ｒａｉｎ，冷却 后离心，吸上清液一２０℃保存。以回收的ＤＮＡ为
模板，用不带ＧＣ环的引物２７ｆｆ５１９ｒ进行扩增。反
应体系（２５灿）：１０
ｘ
Ｂｕｆｆｅｒ ２．５斗Ｌ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｇＣｌ２ ２．０仙Ｌ，１０ ｍｍｏＬ／Ｌ ｄＮＴＰ
０．５止，８斗ｍｏＶＬ
Ｖ电泳７ ｈ，参照文献［１６］的方法用硝酸银染
色，观察并照相。 １．５优势条带的回收及克隆与测序
将ＤＧＧＥ图谱上每个样品共有的主要条带分
别割胶回收，加５０斗Ｌ灭菌双蒸水清洗２～３次，然
参照文献［１５］的方法提取肠道细菌基因组ＤＮＡ，并
万方数据
第１期
李会平等：利用ＰＣＲ—ＤＧＧＥ技术分析桑天牛成虫肠道细菌苗群
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，翮ｉｇｅｌｌａ．Ｐａｎｔｏｅａ，Ｓｅｒｒａｔｉａ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｍｏｎｇ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｓｔｒａｉｎ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｗａｓ ｔｈｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ．ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ
１．５ ２．５ ＩｘＬ，２５ ｍｍｏＬ／Ｌ
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）技术利用序列不同的ＤＮＡ 片段在聚丙烯酰胺凝胶中解链温度不同的原理， 通过梯度变性胶将不同细菌的ＤＮＡ分开心Ｊ，具有 直观、快速和不依赖于细菌培养的优点，已广泛应 用于微生物群落的多样性分析和种群的动态 监测‘３－１３］。
中图分类号￥８８８．７２＋９；Ｑ９３９．１２１
Ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ
ｏｎ
Ａｐｒｉｏｎａ ｇｅｒｍａｒｉ
Ａｄｕｌｔ Ｂａｓｅｄ
ＰＣＲ－ＤＧＧＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ＬＩ Ｈｕｉ—Ｐｉｎｇ １・孙ＹＵＡＮ Ｘｉｕ—Ｊｉｅ’ＳＵ Ｘｉａｏ—Ｙｕｌ・２ （１ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ，Ｂａｏｄｉｎｇ Ｈｅｂｅｉ ０７１０００，Ｃｈｉｎａ；２ Ｔｈｅ Ｔｒｅｅ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｒｏｔｅｃ—
ｚ如酶，５０ ｎｇ／ＩｒＬ模 板ＤＮＡ ２．０ ｗＬ。反应程序：９４℃预变性５ ｍｉｎ； ９４℃变性２ ｒａｉｎ，５３ ｏＣ退火３０ ｓ，７２℃延伸ｌ ｍｉｎ，
ｂａｃｔｅｒｉａ；１６Ｓ
收稿日期：２０１１—０８—１５接受日期：２０１１一０９一１６ 资助项目：河北省教育厅科研项目（Ｎｏ．２００９１２９），河北省强势特色 学科资助项目（Ｎｏ．２００８０１３）。 第一作者信息：李会平（１９７４一）．女，博士．副教授。硕士生导师。
Ｅ・ｍａｉｌ：ｈｕｉｐｉｎｇｌｉ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｎ ’Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａＵｔｈｏｒ．Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｕｉｐｉｎｇｌｉ＠ｓｏｈｕ．ｏｏｍ
度后，用水平电泳分析样品。采用１０％聚丙烯酰胺
凝胶（变性梯度为２７％一３８％），上样量７止，重复３
次点样。在６０℃、１×ＴＡＥ电泳缓冲液的条件下，
１３０
室内饲养１周后，选择生长健康的成虫饥饿过夜，待 其排空体内食物残渣后供试。
１．２桑天牛成虫肠道细菌基因组ＤＮＡ提取 取供试桑天牛成虫肠道１条，液氮充分研磨后，
ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ２７Ｆ／１ ４９５Ｒ ａｎｄ ２７Ｆ／５１ ９ｒ＋ＧＣ ｕｎ ＪｖｅｒｓａＩ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ
ａｒｏｕｎｄ ５００ ｂｐ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＧＧＥ）．Ａｆｔｅｒ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｂａｎｄ ａ— ｎａｌｙｓｉｓ，ＤＮＡ ｒｅｃｏｖｅｒｙ，ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，８ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅｙ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｏｆ
Ａ．ｇｅｒｍａｒｉ ａｄｕｌｔ．Ａｆｔｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｏｆ Ａ．ｇｅｒｍａｒｉ ａｄｕｌｔ，ｗｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ １ ６Ｓ ｒＤＮＡ Ｖ３
来达到害虫防治的目的。本课题组已采用传统方
ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ０．５¨Ｌ，８ ｐＬ，０．１５ Ｕ
ｌ上ｍｏＬ／Ｌ上、下游引物各１．５
２．０
Ｔａｑ酶，５０ ｎｇ／斗Ｌ模板ＤＮＡ
ｗＬ。反
法对几株桑天牛成虫肠道优势细菌进行了分离与
鉴定【ｌ ４｜，为弥补传统研究方法对不可培养细菌分离 和鉴定存在的缺陷，本研究应用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术对 桑天牛成虫肠道细菌的１６Ｓ ｒＤＮＡ基因Ｖ３片段的
Ｍ薛１２
２．０
“Ｌ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ０．５¨Ｌ，８ ｖ，Ｌ，０．１５ Ｕ
ｖ，ｍｏｌ／Ｌ上、下游弓Ｉ ｏｃ变性
Ｔａｑ酶，５０ ｎｇ／ｖ，Ｌ模板ＤＮＡ
ｍｉｎ；９４
ｖ，Ｌ。反应程序：９５℃预变性２
ｍｉｎ。
３０ ｓ，６０
ｏＣ退火ｌ ｍｉｎ，７２℃延伸４ ｍｉｎ，共３０个循
桑天牛（Ａｐ而№ｇｅｒｍａｒｉ）是包括桑树在内的多 种林木、果树、花卉的主要蛀干害虫，也是近年来我
ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＰＣＲ—ＤＧＧＥ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
昆虫肠道中存在大量微生物，一般认为这些微
生物是寄主昆虫正常生长发育所不可缺少的。它
们不仅在宿主体内的维生素合成、脂肪和碳水化合
万方数据
４２
蚕业科学ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
２０１２；粥（１）
物的吸收与利用中起着重要作用，而且在宿主抵御 外来菌的侵入与定植，以及促进宿主免疫系统的过
摘要利用ＰＣＲ—ＤＧＧＥ技术分析桑天牛成虫肠道茵群结构及优势茵群，获取桑天牛肠道微生物的多样性信息。从桑天牛 成虫肠道中提取细茵基因组ＤＮＡ。以细菌１６Ｓ ｒＤＮＡ基因通用引物２７Ｆ／１４９５Ｒ和２７Ｆ／５１９ｒ＋Ｇｃ进行Ｖ３可变区ＰＣＲ扩增，将
长约５００ ｂｐ的扩增产物经变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）分离后，进行优势条带分析、ＤＮＡ回收、克隆、测序等，初步得到分别属
Ｓｅｒｒａ妇．Ｂｌａｓｔ
ｓｅａｒｃｈ
ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａＩ １ ６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ６ ｂａｃｔｅｒｉａＩ ｓｔｒａｉｎｓ ｓｈｏｗ— ｉｎｇ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｖｅｒ ９７％，ａｍｏｎｇ ｗｈｉｃｈ ５ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ．
ｍｉｎ。
ＰＣＲ产物进行ＤＧＧＥ电泳及优势条带的测序分析， 获取桑天牛成虫肠道菌群多样性及优势菌群的初
步信息，为开辟桑天牛生物防治的新途径提供基础
ｒＤＮＡ Ｖ３区
依据。
１材料与方法
１．１材料 ２００９年８月自河北农业大学西校区标本园内 采集刚羽化的桑天牛成虫，寄主植物为桑树（Ｍｏｒｕｓ Ｌ．）。野外采集的桑天牛成虫以桑树的幼嫩枝条在
Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＰＣＲ－ＤＧＧＥ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉ－－ ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉｎ Ａ．ｇｅｒｍａｒｉ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ａｐｒｉｏｎａ ｇｅｒｍａｒｉ；Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ
于肠杆茵属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、不动杆茵属（Ａｃｉｎｅｗｂａｃｔｅｒ）、埃希氏茵属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、志贺茵属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、克雷伯氏茵属（Ｋｌｅｂ— ｓｉｅｌｌａ）、柠檬酸茵属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、泛茵属（Ｐａｎｔｏｅａ）和沙雷氏茵属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）的８个细菌菌株，其中优势细菌为克雷伯氏茵属的细 菌菌株，其次是沙雷氏茵属的细茵菌株。将获取的细菌１６Ｓ ｒＤＮＡ序列在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中进行ＢＬＡＳＴ比对分析，相似度在 ９７％以上的有６个菌株，其中有５个茵株与传统方法分离菌株的鉴定结果一致，表明基于１６Ｓ ｒＤＮＡ的ＰＣＲ．ＤＧＧＥ技术可用于 桑天牛肠道茵群多样性研究。 关键词 桑天牛；肠道细菌；１６Ｓ ｒＤＮＡ序列；ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术 文献标识码Ａ 文章编号０２５７—４７９９（２０１２）０１—００４１—０５
应程序：９４℃预变性５ ｍｉｎ；９４℃变性１０ Ｓ，６３℃退 火３０ ｓ，６８℃延伸３ ｍｉｎ，共１０个循环，每２次循环 退火温度下降２℃；９４℃变性２ ｍｉｎ，５３℃退火３０ Ｓ，６８℃延伸３ ｍｉｎ，共２５个循环；６８℃延伸１０ １．４桑天牛成虫肠道细菌基因组１６Ｓ 扩增片段的变性梯度凝胶电泳 １．４．１最佳变性剂浓度梯度的确定采用Ｂｉｏ．Ｒａｄ Ｄｃｏｄｅ通用突变检测系统（美国，Ｂｉｏ－Ｒａｄ）进行 ＤＧＧＥ电泳。凝胶的变性梯度方向与电泳方向垂 直，以确定平行胶变性剂浓度的范围。 １．４．２样品的ＤＧＧＥ电泳在确定最佳的变性梯