质粒DNA的微量制备及电泳检测
质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物
质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
实验八质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复 pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两 条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准 确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此 已完全分开，复性就不会那么迅速而准确， 它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体 DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复 合物等一起沉淀下来而被除去。
2.简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成 因?
3.沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条 件下进行？
质粒3种构型
1.超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalelltly closed circular DNA，简称cccDNA); 2.开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA的一条链 断裂，(open circular DNA，简称ocDNA); 3.线形质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 两条链发 生断裂(linear DNA，简称LDNA)。
2. 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一、实验目的
通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测 DNA的方法和技术。
二、实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子 筛效应。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负 电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在 结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有 等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方 向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速 度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构 型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度 不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对 分子质量的对数值成反比关系。
２．取1.4 ml培养液至Eppendorf管中，12000rpm离心30 秒，弃上清，取沉淀。
３．将细菌沉淀悬浮于100µl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀。 ４．加入200µl溶液Ⅱ，缓慢颠倒离心管，混匀（勿剧烈
质粒dna提取及电泳检测实验报告
质粒dna提取及电泳检测实验报告质粒DNA提取及电泳检测实验报告引言质粒DNA提取及电泳检测是生物学实验中常用的技术手段，用于分离和检测质粒DNA样本中的目标序列。
本实验旨在通过提取质粒DNA并进行电泳检测，验证提取的质粒DNA的纯度和完整性。
材料与方法1. 材料：- 质粒DNA样本- 细菌培养液- 细菌裂解液- 氯仿- 异丙醇- TE缓冲液- 琼脂糖- TAE缓冲液- DNA分子量标记物2. 方法：1. 质粒DNA提取：a. 将细菌培养液中含有质粒DNA的细菌进行离心，收集细菌沉淀。
b. 加入适量的细菌裂解液，裂解细菌细胞，释放质粒DNA。
c. 加入氯仿，离心分离上清液和有机相。
d. 收集上清液，加入异丙醇，使DNA沉淀。
e. 用TE缓冲液溶解DNA，得到质粒DNA提取物。
2. 质粒DNA电泳检测：a. 准备琼脂糖凝胶，加入TAE缓冲液，制备电泳槽。
b. 加载质粒DNA提取物和DNA分子量标记物于琼脂糖凝胶孔中。
c. 连接电源，进行电泳分离。
d. 观察电泳结果，记录质粒DNA的迁移情况和分子量。
结果与讨论通过质粒DNA提取及电泳检测实验，我们成功地提取到质粒DNA，并进行了电泳分离和检测。
在电泳结果中，我们观察到质粒DNA 片段在凝胶中呈现出带状分布，且迁移距离与分子量呈正相关关系。
根据电泳结果，我们可以初步判断质粒DNA的纯度和完整性。
如果质粒DNA在电泳过程中呈现单一的清晰带状分布，且没有明显的附加杂带，说明质粒DNA的纯度较高，没有明显的污染物。
而如果质粒DNA呈现模糊或多条不清晰的带状分布，可能存在其他DNA片段或杂质的污染。
通过电泳结果中质粒DNA片段的迁移距离，我们可以估算出质粒DNA的大致分子量。
通过与DNA分子量标记物的比对，我们可以初步判断质粒DNA的大小和可能的构造。
这对于进一步的研究和应用具有重要意义。
结论通过质粒DNA提取及电泳检测实验，我们成功地提取到质粒DNA，并验证了其纯度和完整性。
实验一质粒DNA提取纯化、DNA电泳检测
实验⼀质粒DNA提取纯化、DNA电泳检测实验⼀质粒DNA提取纯化、DNA电泳检测⼀、实验⽬的1．掌握质粒DNA的制备的原理和⽅法2．了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离⼆、实验原理1．质粒DNA的制备⽅法质粒(Plasmid)是独⽴存在于染⾊体外、能⾃主复制并能稳定遗传的⼀种环状双链DNA 分⼦，分布于细菌、放线菌、真菌以及⼀些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。
细菌质粒⼤⼩介于1～200Kb之间，是应⽤最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利⽤宿主细胞的复制机构合成质粒⾃⾝的DNA。
质粒DNA的制备包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA⼤量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。
主要⽅法包括：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS；煮沸裂解法：沸⽔煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS，⼀般⽤于质粒⼤量提取。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分⼦⼤⼩、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的⽤途进⾏选择。
本实验选择碱裂解法提取质粒DNA。
2．碱裂解法质粒DNA具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件⼜可以使DNA复性。
碱裂解法根据共价闭合环状质粒DNA和线性染⾊体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。
SDS是⼀种阴离⼦表⾯活性剂，它既能裂解细菌细胞，⼜能使细菌蛋⽩质变性。
SDS 处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从⽽使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。
细菌环状基因组DNA在操作过程中会断裂成线状DNA分⼦，在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开⽽被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕结合在⼀起。
当加⼊pH4.8⼄酸钾缓冲液时，pH恢复⾄中性，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在⼀起，因此复性迅速⽽准确，⽽线性的染⾊体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速⽽准确，它们相互缠绕形成不溶性⽹状结构，⽽复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。
质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告
一、实验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳二、实验原理：1.质粒DNA的提取：质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。
除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。
分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。
（1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA，达到分离提纯质粒DNA的目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分离。
当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中；而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。
与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。
进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。
SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。
（2）四种溶液作用及原理：①Solution I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。
质粒dna提取及电泳检测实验报告(一)
质粒dna提取及电泳检测实验报告(一)质粒DNA提取及电泳检测实验报告实验目的•提取质粒DNA并检测其纯度和浓度•进行电泳检测，分析质粒DNA的大小和完整性实验材料•培养基含有质粒DNA的细菌培养物•高纯度DNA提取试剂盒•离心管、移液器、显微镜等常规实验仪器设备实验步骤1.收取 mL培养基含有细菌的培养物样品，放入离心管中。
2.将离心管置于高速离心机中，以12000 rpm离心5分钟，使细菌沉淀于离心管底部。
3.弃掉上清液，轻轻地加入合适的缓冲溶液悬浮沉淀的细菌细胞。
4.加入适量的裂解液使细菌细胞裂解，使质粒DNA释放到溶液中。
5.加入蛋白酶K进行蛋白质降解，使DNA更易提取。
6.加入冷乙醇混合液，沉淀DNA。
7.使用离心机离心，将沉淀的DNA分离出来。
8.用缓冲液洗涤提取的DNA，去除杂质。
9.使用专门的仪器或试剂盒检测提取的质粒DNA的浓度和纯度。
10.备取质粒DNA样品，进行电泳检测。
结果与分析•通过电泳检测，可以观察到质粒DNA的带状图案。
•根据带状图案的迁移距离，可以初步判断质粒DNA的大小。
•如果带状图案清晰且没有模糊的杂带，说明质粒DNA的完整性良好。
•通过测量提取的质粒DNA的浓度和纯度，可以进一步评估实验结果的可靠性。
结论•本实验成功提取并检测了质粒DNA，并通过电泳检测初步分析了其大小和完整性。
•经测量，质粒DNA的浓度和纯度符合实验要求。
•本实验结果可应用于后续实验或研究中，为进一步分析质粒DNA 的功能提供了基础。
实验注意事项•操作过程需严格遵守实验室安全规范，避免接触有毒或有害物质。
•仪器设备使用前需检查并确保正常工作。
•实验室内要保持清洁，避免污染样品。
•测量和记录数据时，要仔细操作，确保准确性和可重复性。
参考文献（如果有的话，请列出相关参考资料）。
质粒DNA的提取纯化与电泳检测
法、羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放
法、酸酚法等。
1 .碱裂解法提取质粒DNA
1.1原理
共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓
扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线
性的DNA双螺旋结构解开而被变性，共价闭合
接种含pUC-mT质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60μg/ml Amp抗生素
的LB 液体培养基
37℃摇培过夜（10~12h）12000rpm,
3min
弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。
加100μl Ⅰ液，涡旋震荡，充分混匀
配制适量的Ⅱ液
加200μl Ⅱ液，迅速轻轻混匀（以颠倒EP管5-10次为宜），
电泳介质相同（电泳液和凝胶）：
• 分子在电场中迁移的速度主要取决于
分子本身的大小和形状。
• 形状相似的分子的迁移速度主要与分
子量相关: 分子量越大，移动越慢。
凝胶板
（二）琼脂糖凝胶电泳介绍
琼脂糖:
是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物
琼脂中提取而来。
琼脂糖凝胶:
琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点
电泳缓冲液的组成。
5.溴化乙锭染料
Biblioteka EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐
Ethidium Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基
对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫
外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的
射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。
离子交换层析法
质粒dna的提取及电泳检测实验报告
质粒dna的提取及电泳检测实验报告一、实验目的本实验的主要目的是学习质粒DNA的提取方法和电泳检测技术，并通过实验观察质粒DNA的提取情况和电泳检测结果。
二、实验原理质粒DNA的提取方法主要采用碱裂解法，通过将细胞裂解后，用酸性物质中和碱性物质，使DNA分离出来，最后用酒精沉淀纯化。
电泳检测是通过将DNA 样品置于琼脂糖凝胶上，加上电场后，DNA在凝胶中移动，通过电泳带电的原理，将DNA分离出来，从而观察DNA的大小和形状。
三、实验步骤1.准备样品：将含有目标DNA的菌落挑出放入EP管中，加入100μl TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl,1.0mmol/L EDTA,pH8.0），用微量移液器均匀混合。
2.制备裂解液：取10μl 0.25mol/L NaOH加入菌液中，轻轻摇匀，并立即加入200μl 1%SDS（十二烷基硫酸钠）液，翻转混匀。
3.裂解DNA：加入150μl NaOH-SDS溶液，翻转10次，置于80℃水浴中裂解细胞壁和细胞膜，20min后取出，加入150μl冷KAc/EDTA溶液（3mol/L KAc，pH5.2，0.5mol/L EDTA），翻转混匀，冰上静置5min。
4.离心沉淀：10000r/min离心10min，将上清液移至新的96孔板中，加入0.6倍体积的冰凉乙醇，反复翻转，置于-20℃上进行冷却，离心12000r/min 10min，去掉上清液，用95%乙醇洗涤沉淀物，最后用300μl TE缓冲液溶解沉淀DNA。
5.电泳检测：取相同浓度的DNA样品，加入琼脂糖，混合后加入电泳槽中，通电检测10min。
四、实验结果经过实验操作后，取出DNA样品，通过电泳检测，观察到有一条长度合适的条带，证明质粒DNA已经成功提取，并且检测结果与对照组差异不大，说明实验操作规范，结果可信。
五、实验结论本次实验通过碱裂解法成功提取了质粒DNA，并通过电泳检测技术检测到了DNA条带，证明提取质粒DNA的方法可行，同时也说明电泳检测是一种可靠的分子生物学技术，对于DNA分离和检测有着重要的应用价值。
质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳鉴定
实验题目质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳鉴定实验目的掌握质粒提取的原理与各种试剂的作用和琼脂糖凝胶电泳原理和操作实验原理质粒存在于细菌，线粒体等，独立于染色体之外，能够稳定遗传并自我复制，是一个双链环装DNA。
对数期大肠埃希菌含有质粒。
溶液一可使细菌充分重悬，溶液二使细菌裂解，释放质粒和基因组DNA.溶液三起到中和作用，使得质粒DNA迅速复性，而基因组DNA因为分子巨大，复性时间长。
离心后，质粒DNA留在上清液，而基因组DNA和细胞碎片沉淀在离心管。
琼脂糖凝胶电泳蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此泳动的速度不同，根据这个原理可将其分开。
电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。
常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。
用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50bp的DNA。
此外，直接用低浓度的核酸染料进行染色，可以确定DNA 在凝胶中的位置。
实验主要步骤质粒DNA提取1.取4ml细菌平均分两份加入离心管，以12000r/min离心1min，去除上清液2.加100ul用冰预冷溶液I，移液枪打散细菌沉淀使其成为悬浮液3.加入200ul溶液II，盖紧盖口，翻转五次，充分混合，避免振荡，置于冰上4.加入150ul冰预冷溶液III，盖紧盖口，翻转离心管5次，温和摇匀直到粘稠的细菌裂解物出现，放于冰上5min5.离心管以12000r/min离心5min6.取上清液加入等量的酚：氯仿混合液，轻轻摇匀，以12000r/min离心7min7.取上清液加入2倍体积100%乙醇沉淀DNA，轻轻摇匀，12000r/min离心5min，去除上清液，倒置在滤纸上干燥8.用1ml70%乙醇洗涤DNA沉淀，按照步骤7去除上清液，空气干燥10min9.用50ul无菌水溶解质粒DNA琼脂糖凝胶电泳：1.制胶。
将电泳缓冲液和琼脂糖在微波炉中熔化,混匀,冷却至55°℃,加入EB染料,倒入已封好的凝胶灌制平台上,插上样品梳。
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告#特选资料
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告#特选资料DNA（Deoxyribonucleic Acid），中文名叫脱氧核糖核酸，是生命活动的基础物质。
它是各种生物体的特征物质，在细胞的核内存在，也是遗传信息的载体。
病毒DNA也用于各种研究和检测，尤其是在病毒的鉴定及转基因技术中发挥着重要作用。
因此，定性病毒DNA提取及少量DNA琼脂糖凝胶电泳实验都成为实验室检测中必不可少的一项实验内容。
本实验采用DNA提取试剂盒（TOYOBO）进行DNA的提取，特点是无色素、无皂、无蛋白、简便快捷，可以获得高质量的脱氧核糖核酸产物并提高检测效率。
该试剂中的抗腐蚀劑、抑制核糖核酸的酶和其他特殊的保护剂，能够有效防止DNA降解，为提取保护DNA。
本实验做法如下：用离心机将试管内管壁完全湿润，然后在试管中加入灭菌液中离心5min，在电烙铁上将试管放置至400℃时将管口朝内容物烤，使病毒落入管内，加入溶解液将病毒完全溶解，加入避免pH影响的预测液，再加入 DNA提取试剂盒内的DNA提取液，再加入离心液，速度2000rpm/min，离心15min，将DNA分离，收集上清液，即可完成DNA 的提取。
下一步，将提取的DNA溶液经过超滤处理，清洗去盐、去酵氨酸和其他病毒物质，然后将收集的DNA溶液加入加热消化液（20ul加强热金属离子消化液），任务反应器中加入DNA溶液，改变反应器温度逐渐提高，以到达95℃时，保留10min，完成加热消化，之后将消化液在室温空气中反应30min，待反应液体质清澈后，收取液体。
最后，加入检测凝胶（1.2%琼脂糖凝胶）及TBE解剖液，调节溶液酸碱度至7.4,凝胶细胞中加入示性荧光物质即蛋白质标记剂，加入磁控脱水，进行凝胶电泳实验，常用50V ——200V，应用1.0mh氯化钠池，当特征带迁移至仪器中央时，实验完毕。
经上述实验，本实验成功提取了少量 DNA，并通过DNA琼脂糖凝胶电泳实验证实，获得了琼脂糖凝胶电泳图像，数据获取良好印证实验结果满足实验要求。
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实验报告课程名称：生物化学及实验 指导老师： 成绩：同组学生姓名：一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 二、实验内容和原理四、实验方法和步骤六、实验结果和分析一、实验目的和要求1、学习并掌握质粒DNA 的提取原理和方法2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作3、学习并掌握对电泳检测结果的初步分析二、实验内容和原理 1、质粒质粒是一种染色体（核质体）外的寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA 分子，大小在1-200kb 之间，具有自主复制和转录功能, 能表达例如抗性、菌毒素等细胞非必需的遗传信息，但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞（细菌）基因组DNA 编码的一些酶和蛋白质。
质粒能够自发的或人为的在细胞间转移，因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载体。
从细菌细胞中抽提质粒DNA 分为三个步骤：①细菌培养使质粒大量扩增；②收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA ；③进一步除去蛋白、脂类、RNA 等杂质，分离和纯化质粒DNA 。
2、碱裂解法分离纯化质粒DNA在EDTA 存在下，经过SDS 处理使细胞膜裂解，从而使菌体充分裂解，利用在碱性条件下（NaOH ），使核质体DNA 与质粒DNA 的变性；加入乙酸钾，在中性条件下，核质体DNA 与质粒DNA 又存在复性的差异，质粒DNA 很快得以复性，而细菌核质体DNA 分子难以复性，核质体DNA 会缠绕附着在细胞膜碎片上通过离心被沉淀下来，质粒DNA 则留在上清液内；上清液中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量核质体DNA 以及脂质类杂质等，可通过碱性酚-氯仿-异戊醇混合液的抽提去除；含有质粒DNA实验名称：质粒DNA 的微量制备及电泳检测 姓名： 吴逸璇 学号：当加入无水乙醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于聚合。
一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。
获得较纯的质粒DNA。
3、DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在碱性溶液中（pH8.3缓冲液）带负电荷，它在电场作用下向正极泳动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不同，并能区分出不同的区带。
DNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNA片断在凝胶中的位置。
4、影响DNA泳动速率（迁移率）的因素有：⑴ DNA分子质量的影响：双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。
分子量越大，迁移率越小。
⑵ DNA构型的影响：超螺旋DNA＞线状DNA＞开环DNA⑶胶浓度的影响：浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度为1％～2％；⑷电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。
但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5V/cm）（电场强度）。
而对于大片段电泳，甚至用0.5～1.0V/cm电泳过夜。
进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。
⑸ EB的影响：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。
⑹电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们各有利弊。
TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。
TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。
所以多采用TBE缓冲液。
在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护DNA。
缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。
⑺碱基组成与电泳温度的影响: 一般影响不大5、有关试剂的作用：①溶液Ⅰ：葡萄糖：增加溶液的黏度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA。
EDTA：络合掉Mg等二价离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。
Tris·HCl：使溶菌液维持溶菌作用的最适pH范围。
②溶液Ⅱ：SDS：解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。
NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性。
实验名称：质粒DNA 的微量制备及电泳检测③溶液Ⅲ：中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 复性而发生缠绕，并使质粒DNA 复性 。
高盐的3mol/L NaAc/KAc 有利于变性的大分子核质体DNA 以及K/Na 离子会与SDS 形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。
④酚／氯仿/异戊醇：酚: 一种强烈的蛋白质变性剂，能非常有效地去除蛋白质，同时抑制了核酸酶的降解作用。
氯仿: 有强烈的溶脂倾向，可以溶解细胞膜，同时溶解去除脂质类杂质，此外具有使蛋白质变性并分相的作用。
异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
⑤乙醇或异丙醇——可以沉淀核酸，当加入乙醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于聚合。
一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA 和RNA 。
⑥70％的乙醇——用于洗涤核酸沉淀，其目的是去除盐及挥发性较小的异丙醇。
⑦RNaseA ——用于消化质粒DNA 溶液中的残余RNA 。
三、实验材料和主要仪器1、实验材料含重组质粒菌种2、实验试剂⑴ LB 液体培养基 ⑵ 氨苄青霉素：100mg/ml⑶ 溶液Ⅰ⑷ 溶液Ⅱ⑸ 溶液Ⅲ⑹ 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）⑺ 无水乙醇，⑻ 70%乙醇⑼ TE 缓冲液（pH 8.0）⑽ RNaseA （1mg/ml ），⑾ 0.5×TBE 缓冲液（pH8.0）⑿ 琼脂糖⒀ 6×加样缓冲液 ，⒁ 1mg/ml 溴化乙锭（EB ），3、实验仪器和器材（1）恒温培养箱 37℃；（2）恒温摇床 37℃；（3）高压灭菌锅；（4）超净工作台；（5）台式离心机；（6）振荡器；（7）微量移液枪(10，20，200，1000ul)； 装订 线P.3（8）枪头（10，20，1000ul ）及枪头盒；（9）离心管 1.5ml 及离心管架；（10）制冰机；（11）冰箱；（12）干式恒温器 37℃、50℃ ；（13）微波炉；（14）电泳仪及；（15）电泳槽；（16）紫外检测仪。
四、实验方法和步骤（一）细菌培养质粒DNA 大量扩增 挑单菌落（有Amp 抗性）接种于5ml 含Amp 的LB 液体培养基中，37℃震荡培养过夜。
（二）收集细菌,碱裂解液提取质粒DNA ，纯化质粒DNA 1、取1.2ml 的过夜培养菌液加入1.5ml 离心管中，8000r/min 离心1min 。
2、弃上清液，将管倒置于吸水纸上，使液体尽可能流尽。
3、将菌体沉淀加100ul 溶液Ⅰ（含20mg/L RNaseA ），振荡悬浮菌体，冰浴放置5～10min 。
4、加200ul 溶液Ⅱ，盖紧管盖，快速温和颠倒离心管数次，确保离心管内溶液混匀使之变清，冰浴5～10min 。
5、加150ul 溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒数次使之混匀，冰浴放置5min 。
6、12000r/min 离心10min ，将上清液转至另一干净离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），振荡混匀，12000r/min 离心 10min 。
7、上清液移入另一干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温静置20min 。
8、12000r/min 离心10min ，弃上清液，将溶液管口倒置于吸水纸上，使液体尽可能流尽。
9、加入1ml 70﹪乙醇洗沉淀一次（动作要轻），弃70﹪乙醇溶液，将管口倒置于吸水纸上，使液体尽可能流尽，50℃干燥。
10、将沉淀溶于50ul TE 缓冲液（pH8.0）中，取质粒DNA 样液做琼脂糖凝胶电泳鉴定。
（三）琼脂糖凝胶电泳1、制胶（1.0％琼脂糖凝胶）在胶模上架好梳子。
称取1.2g 琼脂糖，置于250ml 锥形瓶中，加100ml 0.5×TBE 电泳缓冲液，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，待其冷却至50～60℃后，加入EB ，使其终浓度为0.5mg/L ，摇匀后立即倒入准备好的胶模中，待胶凝固后，放入电泳槽中，倒入适量0.5×TBE （刚好淹过胶面），拔去梳子备用。
（注：EB 为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作）2、加样取5ul 纯化的质粒DNA 样品，与1ul 6×电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中（注：勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡）。
若DNA 含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。
每加完一个样品要换枪头以防互相污染。
注意上 装订线样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
3、电泳加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到100V ，恒压电泳。
当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约2cm 时，停止电泳（约需30～60min ）。
4、观察和拍照取出胶块置于紫外灯下观察，DNA 存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带，再用成像仪进行拍照，以便于分析。
（注：紫外光对眼睛有害，观察时戴上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察）。
五、实验结果和分析1、现象观察：我的样品是从右往左数第7条（见图上箭头所指）。
观察到一共有四条荧光带，从上往下看：第一条是未除去的RNA 杂质，第二、三、四条依次是质粒DNA 的超螺旋构型，线性构型和开环构型。
会发现最亮的条带是第二条，为目标条带（超螺旋构型的质粒DNA ）。
其他三条条带较暗，但仍存在。
2、反映了两点问题：①RNA 杂质仍未除干净；②在质粒DNA 的提取过程中其超螺旋结构被破坏；装订线实验名称：质粒DNA 的微量制备及电泳检测3、原因分析①实验中除RNA 的步骤主要为加入RNaseA ，仅此一步，而其他步骤基本没有除RNA 的作用，因而有部分RNA 的残余。
（观察到其他人的条带，基本都含有RNA 的条带，说明由于操作本身而导致RNA 的可能性较小，而是原理本身造成了RNA 的少量残余）②由于质粒DNA 的超螺旋构型较不稳定，在提纯的过程中，经常有的“颠倒摇晃均匀”的操作可能会导致其构型的改变，从而形成了线性构型和开环构型。
4、改进意见由于本实验是定性操作，所以杂质的存在不会对结果的分析造成太大影响，反而会作为原理认识的有利例子。
但如果在涉及到质粒环状DNA 的提取&分析的定性操作中，这样的原理可能会造成一定的误差，因而可以增加除去RNA 的步骤，使其被更完全的除去；其次，可以采用更温和的均匀方法，避免“颠倒震荡”造成质粒DNA 超螺旋构型的破坏，或者加入某种构型稳定剂，保持其稳定性，再或者在其构型改变之后，使用某种方法将其构型复原。
六、实验讨论和心得1、操作中的注意事项①在第一步振荡之后所有步骤中的混匀操作均需要动作轻柔，颠倒2-3次左右即可，切不可像原来的实验一样，用力混匀，这样很容易导致双链环状DNA 分子构型的破坏。