质粒DNA的提取及电泳检测
质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物
质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
质粒dna提取及电泳检测实验报告
质粒dna提取及电泳检测实验报告质粒DNA提取及电泳检测实验报告引言质粒DNA提取及电泳检测是生物学实验中常用的技术手段，用于分离和检测质粒DNA样本中的目标序列。
本实验旨在通过提取质粒DNA并进行电泳检测，验证提取的质粒DNA的纯度和完整性。
材料与方法1. 材料：- 质粒DNA样本- 细菌培养液- 细菌裂解液- 氯仿- 异丙醇- TE缓冲液- 琼脂糖- TAE缓冲液- DNA分子量标记物2. 方法：1. 质粒DNA提取：a. 将细菌培养液中含有质粒DNA的细菌进行离心，收集细菌沉淀。
b. 加入适量的细菌裂解液，裂解细菌细胞，释放质粒DNA。
c. 加入氯仿，离心分离上清液和有机相。
d. 收集上清液，加入异丙醇，使DNA沉淀。
e. 用TE缓冲液溶解DNA，得到质粒DNA提取物。
2. 质粒DNA电泳检测：a. 准备琼脂糖凝胶，加入TAE缓冲液，制备电泳槽。
b. 加载质粒DNA提取物和DNA分子量标记物于琼脂糖凝胶孔中。
c. 连接电源，进行电泳分离。
d. 观察电泳结果，记录质粒DNA的迁移情况和分子量。
结果与讨论通过质粒DNA提取及电泳检测实验，我们成功地提取到质粒DNA，并进行了电泳分离和检测。
在电泳结果中，我们观察到质粒DNA 片段在凝胶中呈现出带状分布，且迁移距离与分子量呈正相关关系。
根据电泳结果，我们可以初步判断质粒DNA的纯度和完整性。
如果质粒DNA在电泳过程中呈现单一的清晰带状分布，且没有明显的附加杂带，说明质粒DNA的纯度较高，没有明显的污染物。
而如果质粒DNA呈现模糊或多条不清晰的带状分布，可能存在其他DNA片段或杂质的污染。
通过电泳结果中质粒DNA片段的迁移距离，我们可以估算出质粒DNA的大致分子量。
通过与DNA分子量标记物的比对，我们可以初步判断质粒DNA的大小和可能的构造。
这对于进一步的研究和应用具有重要意义。
结论通过质粒DNA提取及电泳检测实验，我们成功地提取到质粒DNA，并验证了其纯度和完整性。
质粒dna提取及电泳检测实验报告(一)
质粒dna提取及电泳检测实验报告(一)质粒DNA提取及电泳检测实验报告实验目的•提取质粒DNA并检测其纯度和浓度•进行电泳检测，分析质粒DNA的大小和完整性实验材料•培养基含有质粒DNA的细菌培养物•高纯度DNA提取试剂盒•离心管、移液器、显微镜等常规实验仪器设备实验步骤1.收取 mL培养基含有细菌的培养物样品，放入离心管中。
2.将离心管置于高速离心机中，以12000 rpm离心5分钟，使细菌沉淀于离心管底部。
3.弃掉上清液，轻轻地加入合适的缓冲溶液悬浮沉淀的细菌细胞。
4.加入适量的裂解液使细菌细胞裂解，使质粒DNA释放到溶液中。
5.加入蛋白酶K进行蛋白质降解，使DNA更易提取。
6.加入冷乙醇混合液，沉淀DNA。
7.使用离心机离心，将沉淀的DNA分离出来。
8.用缓冲液洗涤提取的DNA，去除杂质。
9.使用专门的仪器或试剂盒检测提取的质粒DNA的浓度和纯度。
10.备取质粒DNA样品，进行电泳检测。
结果与分析•通过电泳检测，可以观察到质粒DNA的带状图案。
•根据带状图案的迁移距离，可以初步判断质粒DNA的大小。
•如果带状图案清晰且没有模糊的杂带，说明质粒DNA的完整性良好。
•通过测量提取的质粒DNA的浓度和纯度，可以进一步评估实验结果的可靠性。
结论•本实验成功提取并检测了质粒DNA，并通过电泳检测初步分析了其大小和完整性。
•经测量，质粒DNA的浓度和纯度符合实验要求。
•本实验结果可应用于后续实验或研究中，为进一步分析质粒DNA 的功能提供了基础。
实验注意事项•操作过程需严格遵守实验室安全规范，避免接触有毒或有害物质。
•仪器设备使用前需检查并确保正常工作。
•实验室内要保持清洁，避免污染样品。
•测量和记录数据时，要仔细操作，确保准确性和可重复性。
参考文献（如果有的话，请列出相关参考资料）。
质粒DNA的提取纯化与电泳检测
法、羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放
法、酸酚法等。
1 .碱裂解法提取质粒DNA
1.1原理
共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓
扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线
性的DNA双螺旋结构解开而被变性，共价闭合
接种含pUC-mT质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60μg/ml Amp抗生素
的LB 液体培养基
37℃摇培过夜（10~12h）12000rpm,
3min
弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。
加100μl Ⅰ液，涡旋震荡，充分混匀
配制适量的Ⅱ液
加200μl Ⅱ液，迅速轻轻混匀（以颠倒EP管5-10次为宜），
电泳介质相同（电泳液和凝胶）：
• 分子在电场中迁移的速度主要取决于
分子本身的大小和形状。
• 形状相似的分子的迁移速度主要与分
子量相关: 分子量越大，移动越慢。
凝胶板
（二）琼脂糖凝胶电泳介绍
琼脂糖:
是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物
琼脂中提取而来。
琼脂糖凝胶:
琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点
电泳缓冲液的组成。
5.溴化乙锭染料
Biblioteka EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐
Ethidium Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基
对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫
外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的
射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。
离子交换层析法
质粒dna的提取及电泳检测实验报告
质粒dna的提取及电泳检测实验报告一、实验目的本实验的主要目的是学习质粒DNA的提取方法和电泳检测技术，并通过实验观察质粒DNA的提取情况和电泳检测结果。
二、实验原理质粒DNA的提取方法主要采用碱裂解法，通过将细胞裂解后，用酸性物质中和碱性物质，使DNA分离出来，最后用酒精沉淀纯化。
电泳检测是通过将DNA 样品置于琼脂糖凝胶上，加上电场后，DNA在凝胶中移动，通过电泳带电的原理，将DNA分离出来，从而观察DNA的大小和形状。
三、实验步骤1.准备样品：将含有目标DNA的菌落挑出放入EP管中，加入100μl TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl,1.0mmol/L EDTA,pH8.0），用微量移液器均匀混合。
2.制备裂解液：取10μl 0.25mol/L NaOH加入菌液中，轻轻摇匀，并立即加入200μl 1%SDS（十二烷基硫酸钠）液，翻转混匀。
3.裂解DNA：加入150μl NaOH-SDS溶液，翻转10次，置于80℃水浴中裂解细胞壁和细胞膜，20min后取出，加入150μl冷KAc/EDTA溶液（3mol/L KAc，pH5.2，0.5mol/L EDTA），翻转混匀，冰上静置5min。
4.离心沉淀：10000r/min离心10min，将上清液移至新的96孔板中，加入0.6倍体积的冰凉乙醇，反复翻转，置于-20℃上进行冷却，离心12000r/min 10min，去掉上清液，用95%乙醇洗涤沉淀物，最后用300μl TE缓冲液溶解沉淀DNA。
5.电泳检测：取相同浓度的DNA样品，加入琼脂糖，混合后加入电泳槽中，通电检测10min。
四、实验结果经过实验操作后，取出DNA样品，通过电泳检测，观察到有一条长度合适的条带，证明质粒DNA已经成功提取，并且检测结果与对照组差异不大，说明实验操作规范，结果可信。
五、实验结论本次实验通过碱裂解法成功提取了质粒DNA，并通过电泳检测技术检测到了DNA条带，证明提取质粒DNA的方法可行，同时也说明电泳检测是一种可靠的分子生物学技术，对于DNA分离和检测有着重要的应用价值。
质粒提取、纯化、电泳检测
质粒DNA的提取、纯化和电泳检测【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用；2、掌握碱变性法提取质粒DNA的方法；3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA分离纯化的实验原理；4、学习并掌握凝胶的制备方法；5、学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法；6、验证E.coli DH5α与E.coli DH5α（pUC19）在含有氨苄培养基上的生长情况并了解其原理。
【实验原理】1、携带外源基因并将外源基因导入宿主细胞，使之进行扩增和表达的媒介称为载体。
在基因工程操作中载体具有以下性质：A.具有自主复制的起点；B.具有多个限制性核酸内切酶的单一识别位点（多克隆位点）；C.具有可供选择的遗传标记；D.具有高拷贝数。
2、质粒 DNA 是原核生物除类核中的染色体 DNA以外 ,细胞质中含有的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小环状双链 DNA 分子。
除酵母的杀伤质粒为RNA 外 , 迄今发现的所有质粒均为双链环状DNA 。
多数质粒只有几千个 bp但也有一些质粒达105bp 以上 ,一般分子量在 ( 4～100) × 106道尔顿范围内。
不同的质粒在细胞内的拷贝数不同。
细胞内含有1-3个拷贝的质粒为低拷贝质粒（严紧型复制），当质粒数在10个拷贝以上，为高拷贝质粒（松弛型复制），用于载体构建质粒多为松弛型。
3、pUC19质粒大小约为2.69kb，含有以下构件：来自于E.coli质粒ColE1的松弛型复制起点；氨苄青霉素抗性基因（Amp r）；E.coliβ-半乳糖苷酶基因（LacZ）的启动子及编码β-半乳糖苷酶的DNA序列；多克隆位点（MCS）区段。
图1.pUC18/pUC19质粒图谱4、质粒在细胞内以共价闭合环状DNA的形式存在，呈超螺旋状态（cccDNA）。
在抽提质粒DNA的过程中，由于各种因素影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA的一条链断裂，变成开环DNA(ocDNA)，若两条链发生断裂则转变为线状DNA（L DNA）。
实验六、大肠杆菌质粒DNA的提取与电泳检测
实验步骤
2.质粒DNA的提取（碱裂解法） ①将收集的细菌沉淀悬浮于100μ l冰预冷的溶液Ⅰ中，强
烈振荡混匀； ②加入200ul新配的溶液Ⅱ于细菌悬液中，迅速颠倒离心管
5次（不应振荡），以混合内容物，室温放置5min或冰上 放置3min. ③加入150μ l预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒离心管5～10 次，使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后将 管置于冰上5～10min。
实验原理
同一质粒DNA的不同构型尽管相对分子质量相同， 但在琼脂糖凝胶电泳中的电泳迁移率却是不同的。一 般情况下，泳动速率由快至慢依次为：超螺旋质粒 （SC）、线性质粒（L）、开环质粒（OC）。 质粒DNA的提取方法较多，要根据宿主菌和质粒的 特性选择适合的提取方法。目前常用的质粒提取方法 有：碱裂解法、煮沸法。 几种方法的提取流程是一样的：培养细菌扩增质粒 →收集菌体裂解细胞→分离和纯化质粒DNA。
（2）溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH 1% SDS（pH值12.6）
（3）溶液Ⅲ：5mol/L KAc 60ml 冰乙酸 11.5ml 水28.5ml（pH4.8）
（4）LB培养基 （5）琼脂糖 （7）1×TAE电泳缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/LTris·Cl
1 mmol/L EDTA （8）上样缓冲液（溴酚蓝 （9） 溴化乙锭（1mg/ml）
电泳结束后取出胶膜，使用凝胶成像系统拍照,观察。对 比标准DNA条带和未知DNA条带，观察其带型和迁移距离， 即可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量大小。
质粒DNA 电泳检测过程示意图称脂糖加TAE灌胶
凝固
点样
电泳
加热溶解
加EB
放入电泳槽
加溴酚蓝
观察拍照
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
12000r/min，离心5min。
质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳鉴定
实验题目质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳鉴定实验目的掌握质粒提取的原理与各种试剂的作用和琼脂糖凝胶电泳原理和操作实验原理质粒存在于细菌，线粒体等，独立于染色体之外，能够稳定遗传并自我复制，是一个双链环装DNA。
对数期大肠埃希菌含有质粒。
溶液一可使细菌充分重悬，溶液二使细菌裂解，释放质粒和基因组DNA.溶液三起到中和作用，使得质粒DNA迅速复性，而基因组DNA因为分子巨大，复性时间长。
离心后，质粒DNA留在上清液，而基因组DNA和细胞碎片沉淀在离心管。
琼脂糖凝胶电泳蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此泳动的速度不同，根据这个原理可将其分开。
电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。
常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。
用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50bp的DNA。
此外，直接用低浓度的核酸染料进行染色，可以确定DNA 在凝胶中的位置。
实验主要步骤质粒DNA提取1.取4ml细菌平均分两份加入离心管，以12000r/min离心1min，去除上清液2.加100ul用冰预冷溶液I，移液枪打散细菌沉淀使其成为悬浮液3.加入200ul溶液II，盖紧盖口，翻转五次，充分混合，避免振荡，置于冰上4.加入150ul冰预冷溶液III，盖紧盖口，翻转离心管5次，温和摇匀直到粘稠的细菌裂解物出现，放于冰上5min5.离心管以12000r/min离心5min6.取上清液加入等量的酚：氯仿混合液，轻轻摇匀，以12000r/min离心7min7.取上清液加入2倍体积100%乙醇沉淀DNA，轻轻摇匀，12000r/min离心5min，去除上清液，倒置在滤纸上干燥8.用1ml70%乙醇洗涤DNA沉淀，按照步骤7去除上清液，空气干燥10min9.用50ul无菌水溶解质粒DNA琼脂糖凝胶电泳：1.制胶。
将电泳缓冲液和琼脂糖在微波炉中熔化,混匀,冷却至55°℃,加入EB染料,倒入已封好的凝胶灌制平台上,插上样品梳。
质粒DNA提取,电泳鉴定
试剂中的主要成分和作用
重悬细菌
GTE缓冲液： Tris-HCl溶液：调节pH。 葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管
子底部。 EDTA：二价金属离子螯合剂，抑制DNase活性。
变性
NaOH-SDS溶液： NaOH：溶解细胞，破坏核酸碱基配对使氢键断裂
从而让核酸变性。 SDS：裂解细胞，结合蛋白质，形成SDS-蛋白质
定要充分混匀！
6. 4℃，12000rpm离心5min，取上清300ul 转移 的EP管中。
至另一支新
7. 加180ul异丙醇，冰浴20min，12000rpm离心5min，弃上清液。
8. 缓慢加入70%乙醇0.5ml，轻轻上下颠倒， 12000rpm离心 1min，吸弃大部分上清，挥干剩余乙醇。
agrose gel电泳是分离鉴定和纯化DNA分子的常用方法，不同浓 度的琼脂糖胶可分离100bp-60kb的DNA片段，在琼脂糖电泳中， DNA迁移的速率不仅与其分子量的对数值成反比，即分子量越大， 移动速率越慢，而且还与分子构型有关如质粒开环DNA<线性DNA< 共价闭合环状DNA。
预期实验结果
RNase溶液：水解上清中小分子RNA。 异丙醇：快速沉淀质粒DNA，但难以挥发。 70%乙醇：去除异丙醇，且易于挥发除去。 TE缓冲液：溶解质粒DNA沉淀，含有EDTA能
够使DNA保存时间更长。
琼脂糖凝胶电泳
溴化乙锭（EB）能够嵌入 到DNA分子的碱基对中形成荧 光复合物，在紫外线激发下发 射荧光
基本原理
当菌体在NaOH-SDS溶液中裂解时，蛋白质与 DNA会发生变性。加入中和液（乙酸钾）后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离 心时留在上清中；而染色体DNA、大分子RNA 以及蛋白质-SDS复合物等形成沉淀，可通过离 心去除。
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实验质粒DNA的提取及电泳检测
一实验目的
通过本实验学习掌握碱裂解法提取细菌质粒DNA。
二实验原理
1、细菌中有两种DNA,即染色体DNA与质粒DNA。
2、质粒DNA的提取方法有三种:碱裂解法,煮沸法,去污剂(如Triton与SDS)裂解法。
3、碱裂解法比较剧烈,可破坏碱基配对,使宿主细胞DNA变性,共价闭合环状DNA由于空间缠绕,两条链不会彻底分开。
当外界条件到达复性条件时,质粒DNA的双链又迅速恢复原状,而较大的线性染色体DNA难以复性。
三实验材料:转化后的细菌(含有质粒的大肠杆菌)
四、实验用具与药品
1、实验用具:
摇床,离心机,移液器及枪头,玻璃试管(15mL)及塞子,离心管(1、5mL)
2、实验试剂:
(1)溶液I
50 mmol/L 葡萄糖
25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8、0)
10 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8、0)
(2)溶液II
0、4mol/L NaOH,2%SDS,用前等体积混合
(3)溶液III 5 mol/L 乙酸钾60ml
冰乙酸11、5ml
水28、5ml
(4)TE 缓冲液
10 mmol/L Tris·HCl(pH8、0)
1 mmol/L EDTA(pH8、0)
(5)70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)
(6)加样缓冲液(6X):40%蔗糖、0、25%溴酚兰
(7)电泳缓冲液:0、045mol/L Tris-硼酸 0、001mol/L EDTA (0、5X TBE buffer)
电泳缓冲液贮存液:5X:54g Tris碱、27、5g硼酸、20ml 0、5mol/L EDTA(pH8、0)
五实验步骤
(一)细菌繁殖
挑取白色的单菌落若干,转移到3mL液体LB培养基(附加100mg/ml Amp ),37℃过夜振荡(200r/min)培养。
(二)菌体收集
将过夜培养的菌体转入1、5mL离心管,离心30sec 5000r/min;弃上清提取质粒(三)质粒提取
方法一:碱裂解法提取质粒DNA
1.、将上述沉淀重悬于250μL冰预冷的溶液Ⅰ中,剧烈震荡;
2.加入250μL溶液Ⅱ,盖紧管口,快速颠倒离心管5~10次;
3.加入350μL冰预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,温与地颠倒离心管5~10次;9000r/min离心5min上清转移到另一新1、5mL离心管中;
4.加等体积氯仿,振荡混合,静置, 9000r/min离心5min,上清转移到另一新1、5mL 离心管中;
5.加入1/10体积3mol/L的醋酸钠与2倍体积的乙醇,充分混匀,静置5min;9000r/min离心5min;
6.弃上清,用70％ethanol洗涤;
7.加30μLTE溶解,-20 ℃保存。
方法二:试剂盒提取方法
1、离心收集的菌体中加入含RNAase的溶液Ⅰ250μL,重悬菌体,不应留有小的菌块;
2、加溶液Ⅱ250μL,轻轻颠倒离心管4-6 次,使菌体充分裂解,至溶液澄清;
3、加入350μL冰预冷的溶液Ⅲ,温与并充分地上下翻转混合6-8 次;
4、12000r/min离心10min;
5、将上清转移到DNA结合管(置于2 ml 离心管中),12000r/min离心1min,弃滤液;
6、将制备管置回离心管,加入去蛋白试剂500μL,12000r/min离心1min,弃滤液;
7、将制备管置回离心管,加洗涤液700μL,12000r/min离心1min,弃滤液;以同样的方法再用700μL洗涤液洗涤一次,弃滤液。
8、将制备管置回2 ml 离心管中,12,000×g 离心1 min,去除残余的洗涤液;
10 将DNA结合柱放入另一个新的1、5mL离心管中,在制备管膜中央加60-80μL 洗脱液或去离子水,室温静置1 min。
12,000×g 离心1 min。
(四)检测提取DNA质量的电泳检测。
●取4ul质粒DNA+2ul加样缓冲液+6ul ddH2O;
●配制1%的琼脂糖凝胶
●电泳30min,EB染色,拍照。
注意事项:氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用,它就是致癌剂并可损伤肝脏与肾脏,操作时需戴手套、口罩。
六实验作业
1、思考本实验的关键步骤就是什么？
2、琼脂糖电泳鉴定质粒DNA时,能瞧到几条带,快慢顺序就是什么？
3、附上电泳图片。