综述基因芯片技术、蛋白芯片技术的原理及应用。

综述基因芯片技术、蛋白芯片技术的原理及应用。

1.1 基因芯片是生物芯片技术中发展最成熟和最先实现商品化的产品。

基因芯片是基于核酸探针互补杂交技术原理而研制的。

所谓核酸探针只是一段人工合成的碱基序列，在探针上连接上一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。

基因芯片，又称DNA芯片，DNA微阵列（DNAmicroar ray），和我们日常所说的计算机芯片非常相似，只不过高度集成的不是半导体管，而是成千上万的网格状密集排列的基因探针，通过已知碱基顺序的DNA片段，来结合碱基互补序列的单链DNA，从而确定相应的序列，通过这种方式来识别异常基因或其产物等。

目前，比较成熟的产品有检测基因突变的基因芯片和检测细胞基因表达水平的基因表达谱芯片。

基因芯片技术主要包括四个基本技术环节：芯片微阵列制备、样品制备、生物分子反应和信号的检测及分析。

目前制备芯片主要采用表面化学的方法或组合化学的方法来处理固相基质如玻璃片或硅片，然后使DNA片段或蛋白质分子按特定顺序排列在片基上。

目前已有将近40万种不同的DNA分子放在1平方厘米的高密度基因芯片，并且正在制备包含上百万个DNA探针的人类基因芯片。

生物样品的制备和处理是基因芯片技术的第二个重要环节。

生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片进行反应。

要将样品进行特定的生物处理，获取其中的蛋白质或DNA、RNA等信息分子并加以标记，以提高检测的灵敏度。

第三步是生物分子与芯片进行反应。

芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。

通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配比率，从而获取最能反映生物本质的信号。

基因芯片技术的最后一步就是芯片信号检测和分析。

目前最常用的芯片信号检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中，通过采集各反应点的荧光强弱和荧光位置，经相关软件分析图像，即可以获得有关生物信息。

自从1992年Affymetrix公司首次合成第一块基因芯片诞生以来，在之后的十几年里该技术以其高通量、平行性、多样化、微型化、自动化的显著特点被广泛应用到了各个领域，展现出了巨大的发展前景。

1）在医学上的应用：基因芯片的诞生为医学界提供了一个全新的平台。

它不仅使实验室检测的高通量、高自动化、微量化得以实现，而且使临床上对一些疑难疾病的准确判断成为可能。

例如，在毒理学方面，查找药物毒性或其副作用，尤其是慢性毒性的副作用，往往涉及基因表达的改变，而用芯片作表达研究可以节省大量的动物试验，使医生能够给个体的基因拍个“快照”，然后决定什么疗法更好，可以尽量避免使用有危害的药物；在药物筛选方面，可以通过芯片技术将药物的生物效应和基因变化联系起来。

如Ducke大学人类基因组中心的Roses教授，用基因芯片技术鉴定了一种引起肌肉萎缩侧索硬化的基因，并鉴定了这种载体脂蛋白是引起该病的主要因子，这一新的药物靶点的发现，为新的药物设计提供了指导。

2）在免疫研究中应用：免疫应答（如同种异体移植物的识别与排除）涉及许多基因的表达与调控，弄清它们变化机理是亟待解决的问题。

目前基因芯片在该领域中的应用主要是在免疫细胞发育、成熟、活化、分化基应答的调控机制、变态反应的分子基础、免疫药理等方面，它加深了人们对免疫系统的认识，同时也可以从基因水平上对医药治疗免疫相关疾病机制的研究，从而建立起药物筛选的靶标。

3）在农业上的应用：①作物基因组测序和发现新基因。

继人类基因组计划以来，许多农作物的基因测序工作也都相继展开如水稻基因组计划、拟南芥基因测序等，基因芯片技术为大规模的测序提供了方便、快捷、准确的技术手段。

同时，也可以利用该技术发现新基因，如构建cDNA文库，对野生型和突变体的植株进行杂交筛选，发现其差异表达序列后，从文库中找出相应的克隆，以判断它是否是新的基因。

②基因表达水平的检测。

用基因芯片技术得到农作物不同环境条件下或不同发育时期基因表达的数据并进行分析，就可以找出基因型和表现型之间的关系，为大田实验提供依据。

③转基因产品的检测。

对于转基因产品的安全问题目前还有较大的争论，但目前还没有通用的检测方法，而基因芯片技术可以快捷准确地对其检测。

将目前通用的报告基因、抗性基因、启动子和终止子的特异片断制成检测芯片与待测产品的DNA进行杂交，就可以判断待测样品是否为转基因产品，其可靠性已被对大豆、玉米、油菜、棉花等农作物样品的检测结果所证实。

另外，利用该技术也可以筛选转基因所需要的目的基因。

④其它。

如在病虫害检验、食品卫生监督等中也有广泛的应用。

4)在后基因组中的应用：人类基因组计划的测序工作已经完成，现在已进入了后基因组时代，其研究的重点已从基因序列的测序转相了基因功能的测定，要想了解人类3-4万条基因的功能及它们之间的联系，传统的技术手段已不能满足需要了，这就必需依靠以基因芯片为先导的高新技术才能完成。

1.2蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片, 然后, 用标记了特定荧光抗体的蛋白质或其他成分与芯片作用,经漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去, 再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术, 测定芯片上各点的荧光强度, 通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系, 由此达到测定各种蛋白质功能的目的。

为了实现这个目的, 首先必须通过一定的方法将蛋白质固定于合适的载体上, 同时能够维持蛋白质的天然构象, 也就是必须防止其变性以维持其原有特定的生物学活性。

另外, 由于生物细胞中蛋白质的多样性和功能的复杂性, 开发和建立具有多样品并行处理能力、能够进行快速分析的高通量蛋白芯片技术将有利于简化和加快蛋白质功能研究的进展。

蛋白芯片的快速发展,极大地促进蛋白诊断和蛋白质组学等方面的研究。

如:利用蛋白芯片发现新的蛋白并且阐明其功能;寻找与疾病有关或直接引发疾病的新蛋白;在蛋白芯片上筛选与这些疾病蛋白有关的新药,发现新的药物靶标和生物标记物,这些都已成为当前蛋白研究的重点课题。

而蛋白芯片的研究起着重要的作用。

1）免疫检测及酶活性测定目前许多临床检验及环境毒物检测均是基于抗原、抗体反应进行的,如果将多种检测集中在一块芯片上进行,就会极大的提高检测效率、降低检测成本。

Ewalt KL 等人首次利用“主动式”芯片进行葡萄球菌肠毒素B 及霍乱毒素B 的检测,证明利用这种芯片进行蛋白质检测具有许多优点,如检测所需时间少、整个分析所需样品少(10μL) 及不需要封闭等。

2）抗体筛选利用抗原与抗体可以进行特异性的结合反应,可以对噬菌体抗体库进行筛选。

Wildt RM 等人用带有抗体基因的高密细菌阵列进行重组抗体的筛选,一次可以对18342 个不同的抗体克隆进行高通量的检测。

3）蛋白质组研究随着蛋白质组研究的不断展开,人们需要一种高通量的检测技术对细胞或组织所表达的众多蛋白质进行研究, 蛋白质芯片正适合进行此项研究。

Nacbeath G 等人研制出一种新型的蛋白质芯片，在一张215cm×7.0cm 的玻璃片上可以固定10000个蛋白质样品,从而保证其实现高通量的检测功能。

利用这种芯片进行蛋白质检测时,灵敏度可达150pg/ mL 。

他们还证明用这种芯片可以进行蛋白质间相互作用、确定蛋白激酶底物、分析蛋白质与其它小分子物质相互作用的研究。

4）蛋白芯片用于生物分子间的相互作用研究蛋白微阵列具有和DNA 微阵列一样的潜力,会对生物科学产生巨大影响。

它会显著地拓宽现在蛋白表达和蛋白相互作用分析的范围8 。

现在分析蛋白质的技术,例如二维凝胶电泳(2 - DE ,two - dimension2al gel electrophoresis) 和质谱联用,可以检测生物相关蛋白,有很高的分辨能力,但也有很大的局限。

这一点已经被Gygi 等人证明,从全细胞提取物观测到,2 -DE 中的大多数的点,是高丰度蛋白。

然而低丰度蛋白,例如信号分子或激酶,就只有很少的显示。

蛋白微阵列能显著的加快药物新的标记物和靶标的发现,而且有高通量应用的潜力。

达到这个目标的关键是,对低丰度蛋白有高的读出灵敏度,蛋白的功能分析、化验分析的时间短,处理简便而且可以和各种各样的不同的靶标和新的化验分析方法联用的能力。

近年来,研究蛋白质相互作用的主要方法是酵母双杂交系统技术。

该技术是体内方法,易于操作实施并且应用范围广,但存在着许多局限性,如假阴性和假阳性等。

蛋白质阵列芯片技术由于是在体外条件下进行操作,突破了酵母双相杂交系统技术的局限,可直接检测目标蛋白质。

5）蛋白芯片用于蛋白质和小分子间的相互作用蛋白质芯片可用于研究蛋白质和小分子相互作用,解决药物筛选中的瓶颈问题。

蛋白芯片可以高通量、大规模、并行进行新药筛选,直接在蛋白质水平上寻找药物靶标,解释药物的作用机理,检查药物的毒性或副作用。

它不仅能大大缩短药物筛选的时间,而且为药物的进一步开发和设计提供理论指导。

6）药物靶标及其作用机理的研究疾病的发生发展与某些蛋白质的变化有关。

如果以这些蛋白质构筑芯片,对众多候选化学药物进行筛选,直接筛选出与靶蛋白作用的化学药物,将大大推进药物的开发。

另外,蛋白质阵列芯片有助于了解药物与其效应相关蛋白质的相互作用,并允许对化学药物作用机制细节不够清楚的情况下,直接研究蛋白质谱,这可能将化学药物作用与疾病联系起来,以反应药物是否具有毒副作用、判定药物的治疗效果,为指导临床用药提供实验依据,并能进一步建立和发展外源化学药物与蛋白质表达谱的数据库,促进药理学和毒理学的研究。

7）疾病诊断蛋白质芯片能够同时检测生物样品中,与某种疾病或环境因素损伤可能相关的全部蛋白质的含量变化情况,即表型指纹(Phenomicfingerprint) 分析。

对于疾病的诊断或筛查来说,表型指纹要比单一标志物准确可靠得多。

此外,表型指纹对监测疾病的进程和预后,判断治疗的效果也具有重要意义。

蛋白质阵列在临床医学中最有可能应用于自身免疫病的实验室诊断,以确定特异性自身抗体谱的存在。

8）蛋白芯片在食品分析中应用蛋白芯片在食品分析方面也具有较好的应用前景。

食品营养成分的分析(蛋白质) ,食品中有毒、有害化学物质的分析(包括农药、重金属、有机污染物、激素) ,检测食品中污染的致病微生物的检测,食品中污染的生物毒素(细菌毒素、真菌毒素) 的检测等大量工作几乎都可以用生物芯片来完成。

目前国内此领域的工作才刚刚开始,但已显示出良好的应用前景,如建立利用免疫芯片技术检测食品中黄曲霉毒素和葡萄球菌肠毒素、农药、雌激素、生物碱的方法。

相信在不久的将来,生物芯片技术一项高灵敏、快速的分析方法在食品安全监测、检验方面将获得广泛应用。

另外,利用免疫芯片或酶芯片检测各种蛋白毒素类生物战剂和侦检化学战剂。