层析法血浆产品制备
血液制品生产现场检查指南——20171130终稿
血液制品生产现场检查指南（征求意见稿）目录一、目的 (4)二、适用范围 (4)三、检查依据......................................................................................................... 错误!未定义书签。
四、血液制品生产工艺概述 (4)(一)人血白蛋白生产工艺简介 (6)(二)人免疫球蛋白生产工艺简介 (7)(三)人凝血因子类产品生产工艺简介 (8)五、原料血浆管理检查要点 (12)(一)单采血浆站 (12)(二)原料血浆运输 (12)(三)原料血浆管理 (12)六、生产现场检查要点 (15)(一)生产用原辅料 (16)(二)原料血浆融化合并 (17)(三)血浆蛋白制作（调制） (18)(四)离心分离 (18)(五)压滤分离 (19)(六)层析纯化分离 (19)(七)超滤 (20)(八)原液及半成品配制 (20)(九)病毒去除/灭活 (22)(十)分装，冻干，轧盖，物检，包装 (25)(十一)产品贮存和运输 (25)(十二)产品持续稳定性考察 (25)(十三)冷沉淀调拨 (25)(十四)乙醇回收 (27)(十五)供应商审计 (27)七、实验室检查要点 (29)(一)原料血浆检测实验室 (29)(二)质量检定实验室(除原料血浆检测外) (31)八、废弃物管理 (32)(一)不合格血浆处理 (32)(二)不合格品处理 (32)(三)生产废弃物处理 (33)(四)检定废弃物处理 (34)九、投诉和召回 (34)十、参考技术资料 (35)一、目的本指南的主要目的是为检查员在实施血液制品生产企业检查时提供指导。
检查员应参照本指南的要求检查血液制品生产质量管理情况，评价企业对血液制品生产质量控制情况，以确定企业是否符合《药品生产质量管理规范》（以下称药品GMP）的要求。
二、适用范围及检查依据本指南适用于血液制品的GMP检查，包括原料血浆接收、入库储存、复检、血浆分离、血液制品制备、检定到成品入库的全过程。
层析法从血浆分离静注人免疫球蛋白及其初步检定
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｍ ａ ｎ ｕ ｆ ａ ｃ ｔ ｕ ｒ ｅ ｈ ｉ ｇ ｈ ｑ ｕ ａ ｌ ｉ ｔ ｙ Ｉ Ｖ Ｉ Ｇ ｆ ｒ ｏ ｍ ｐ ｏ ｏ ｌ ｅ ｄ ｈ ｕ ｍ ａ ｎ ｐ ｌ ａ ｓ ｍ ａ ｂ ｙ ａ ｓ ｅ ｒ ｉ ｅ ｓ ｏ ｆ ｓ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｃ ｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｔ ｏ ｇ —
・
１ ０・
微 生物学免疫学进展
２ ０ １ ３年 １ ０月第 ４ １卷第 ５期
Ｐ ｒ ｏ ｇ ｉ ｎ Ｍ ｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｌ Ｉ ｍ ｍｕ ｎ ｏ ｌ ，Ｏ ｃ ｔ ２ ０ １ ３， Ｖ ｏ １ ． ４ １ Ｎ ｏ ． ５
・
论
著 ・
层 析法 从 血浆 分 离静 注 人 免 疫球 蛋 白析 、 离子交换 一套 工艺 纯化 出 Ｉ Ｖ Ｉ Ｇ产 品， 进 而按 照 《 中华 人 民共 和 国药 典》 对静 注人 免疫 球 蛋 白
（ ｐ Ｈ ４ ） 及其关键指标进行 了检测 。在此基础上还采用免疫浊度法等方法 ， 对其纯度和非 目的蛋 白构成 与国际产品
进行 比较。结果 工艺获得 Ｉ Ｖ Ｉ Ｇ产品的关键性指标检测均 达到《 中华人 民共和 国药 典》 的要求 ， 其质量不 低于现 本工艺能 以较高 回收率 获得 高质 量的 Ｉ Ｖ Ｉ Ｇ产 品。 文献标志码 ： Ａ 文章编 号 ： １ ０ ０ ５— ５ ６ ７ ３ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ５— ０ ０ １ ０— ０ ４ 有国际同类产 品。结论 中图分类号 ： Ｒ ３ ９ ７ ． ２
关键词 ： 静注人免疫球蛋 白；亲和层析 ； 离子交换层析
Ｐｒ ｉ ｍａ ｒ ｙ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐｒ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｉ ＶＩ Ｇ
C反应蛋白检测试剂盒(胶体金免疫层析法)产品技术要求北京库尔
C反应蛋白检测试剂盒（胶体金免疫层析法）
适用范围：本产品用于体外半定量检测人血清、血浆、全血样本中C反应蛋白。
1.1产品规格
条型：1人份/袋、1人份/盒、25人份/盒、50人份/盒、100人份/盒；
25人份/筒、25人份×4/盒。
卡型：1人份/袋、1人份/盒、25人份/盒、50人份/盒。
1.2主要组成成分
2.1外观
外观应整洁完整，无毛刺，无破损，无污染。
2.2膜条宽度
膜条宽度应不小于2.5mm。
2.3液体移行速度
液体移行速度应不低于10mm/min。
2.4 准确度
本产品用空白对照和0.5μg/mL、1.0μg/mL、3.0μg/mL、10.0μg/mLCRP 质控液，进行检测。
检测结果与相应参考溶液标示值相比，同向不超过一个量级，不得出现反向相差。
阳性参考溶液不得出现阴性结果，阴性参考溶液不得出现阳性结果。
2.5 重复性
检测结果的一致性不低于90%。
2.6 检出限
用浓度为1.0μg/mL C反应蛋白样品检测，结果不能为阴性。
2.7分析特异性
2.7.1 与胆红素的交叉反应
检测浓度为250ng/mL的胆红素，结果均应为阴性。
2.7.2 与胆固醇的交叉反应
检测浓度为250ng/mL的胆固醇，结果均应为阴性。
2.7.3 与人血红蛋白的交叉反应
检测浓度为150ng/mL的人血红蛋白，结果均应为阴性。
2.8 批间差
检测结果之间相差不超过一个量级。
2.9 稳定性
2℃～30℃贮存至有效期后2个月内，对产品进行检验，应符合2.3～2.7的要求。
血液制品的生产工艺及产品安全性-1
恒温室
保持温度30-32°C
生产过程
23
普通血浆
特定血浆
制备血浆 基础分馏 批量生产 无菌灌装
灯检 包装
灯检
在灌装前，对所有空瓶进行100%的控制 对介质灌装进行100%控制
在包装前，对所有已灌装的瓶子进行100%的控制 对所有溶剂进行100%控制
例子:
24
例子:
生产过程
25
普通血浆
特定血浆
制备血浆 基础分离 批量生产 无菌灌装
100 200 300 400
分钟
37
病原体灭活
溶剂/清洁剂: S/D介导破坏包膜
例如 - Triton-X100 / 磷酸三丁酯 - 胆酸盐 / 磷酸三丁酯
胆酸盐
仅对有包膜的病毒有效!
38
TX-100 TNBP
病毒大小
细小病毒科
18 - 25 B19V, 鼠微小病毒（MVM）
小核糖核酸病毒科 ~30 甲肝，脊髓灰质炎
HIV-1/2抗体 丙肝抗体 乙肝表面抗原 HCV RNA HBV DNA HIV-1 RNA
血浆样品
32
确保质量和安全性的措施
捐献后信息（PDI） 任何有关捐献者或捐献物的信息，都将作为捐献后信息，可影响血 浆产品的质量和/或安全： - 延缓出现的症状 - 错误放行 - 反馈通知 （捐献者血清转化、可疑的输血后感染） - CJD / vCJD
灯检 包装
分馏
• 基础分馏
• 血浆到中间产品
制备血浆
融化
离心分离
冰冻沉淀物
过滤
沉淀物A
VIII因子
沉淀物IV
过滤
沉淀物C
过滤
过滤
D—二聚体(D—Dimer)测定试剂(荧光免疫层析法)产品技术要求万孚
1.性能指标1.1外观检查外观应平整，材料附着应牢固，各组份应齐全，卡固定紧密。
1.2物理检查膜条宽应不小于 3.5mm；液体移行速度应不低于 10mm/min。
1.3线性范围取同一批号的试剂分别对浓度为 0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10mg/L 的D-二聚体参考品进行检测，每份参考品重复检测 3 次，计算出直线方程 y=a+bx，以及相关系数 r，其中 r 值应≥0.98。
1.4精密度1.4.1批内精密度随机抽取同一批号的试剂 10 人份，分别对浓度为 1.0mg/L 的D-二聚体参考品进行检测,其变异系数 CV（%）值应≤15％。
1.4.2批间精密度随机抽取连续三个批号的试剂，每个批号取 3 人份，分别对浓度为 1.0mg/L 的D-二聚体参考品进行检测，其变异系数 CV（%）值应≤15％。
1.5准确度用同一批号的试剂分别对浓度 0.5mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L 的D-二聚体参考品进行检测，每个参考品重复检测 3 次，计算样本检测结果的均值和相对偏差，其中相对偏差（Bias%）应在±15%内。
1.6最低检出限取同一批号的试剂 10 人份，对配制参考品基质进行检测，计算样本检测结果的均值X和标准偏差 SD，其中（X +2SD）≤0.1mg/L。
1.7分析特异性选择浓度 1.0mg/L 的D-二聚体参考品分别加胆固醇、胆红素、甘油三酯，使干扰物最终浓度胆固醇 15mg/mL、胆红素 0.2mg/mL、甘油三酯 30mg/mL，各干扰样本重复检测 3 次，计算样本检测结果的均值和相对偏差，其中相对偏差（Bias%）应在±15%内。
卡马西平测定试剂盒(荧光免疫层析法)产品技术要求北京丹大生物
卡马西平测定试剂盒(荧光免疫层析法)适用范围：该产品用于体外定量测定人血清、血浆或全血中卡马西平的含量。
1.1规格1人份/盒；10人份/盒；25人份/盒；50人份/盒；100人份/盒1.2组成试剂盒组成见表1表1卡马西平测定试剂盒组成注：质控品赋值具有批特异性，每批次靶值详见标签。
2.1 外观试剂盒外观应整洁, 文字符号标识清晰，液体无渗漏，测试卡完整无破损，质控品为冻干疏松体，复溶后为无色至淡黄色液体。
2.2装量样本缓冲液装量与理论装量偏差不超过±10%。
2.3检出限应不高于2μg/mL。
2.4线性范围在[2，20] μg/mL内，相关系数R≥0.990。
2.5 重复性重复测试（5±1）μg/mL和（10±2）μg/mL的样本，所得结果的变异系数（CV）应不大于15%。
2.6批间差测试（5±1）μg/mL和（10±2）μg/mL的样本，批间相对极差（R）应不大于15%。
2.7准确度回收率应在85～115％范围内。
2.8质控品2.8.1预期结果试剂盒内的质控品，检测结果均在质控范围内。
2.8.2均匀性瓶间差≤15%。
2.8.3复溶稳定性质控品复溶后在2℃～8℃密封避光保存24h。
检测复溶后的质控品，检测结果均在质控范围内。
2.9 效期稳定性试剂有效期为18个月。
取到效期后3个月内试剂盒进行检测，测定结果应符合2.3、2.4、2.5、2.7、2.8项要求。
2.10溯源性根据GB/T21415-2008的要求，校准曲线可溯源至企业工作校准品，企业工作校准品与已上市卡马西平测定试剂盒进行对比赋值。
一步柱层析纯化血浆分离多种血液制品组分
Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｓ ｏ ｕ ｒ ｃ ｅ ｐ ｌ ａ ｓ ｍａ ｗ ａ ｓ ｌ ｏ ａ ｄ ｅ ｄ ｏ ｎ ｔ ｏ ｃ ｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｉ ｃ ｃ ｏ ｌ ｕ ｍ ｎ ａ ｔ ａ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ａ ｎ ｔ ｌ ｆ ｏ ｗ ｒ ａ ｔ ｅ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ａ ｇ ａ ｍｓ ｅ（ ｔ ｕ ｎ ｇ ｓ ｔ ｅ ｎ ｃ ａ ｒ ｂ ｉ ｄ ｅ ） －
Ｌ Ａ Ｗｅ ｎ － ｊ ｕ ｎ ， ＷＡ Ｎ Ｇ Ｙ ａ ｈ ， Ｚ ＨＯ Ｕ Ｊ ｉ ｎ ｇ ， Ｌ Ｉ Ｎ Ｘ ｉ ａ ｏ ・ ｆ ａ ， Ｚ ＨＡ Ｎ Ｇ Ｌ ｉ － ｊ ｕ ｎ
Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｏ ｆ Ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｅ ｄ Ｃ ｈ ｅ ｍ ｉ ｓ ｔ ｒ ｙ ａ ｎ ｄ Ｂ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｓ ｈ ｅ ｎ ｚ ｈ ｅ ｎ Ｐ ｌ ｏ ｙ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｉ ｅ ，
期短 、 成本低 、 可去除病毒等优势 ， 其有望成为传统低温 乙醇工艺的有效替代技术 ， 应用 于工业化生产 。
关键 词 ：人血浆 ； 柱层析 ； 扩张床吸附 中图分类号 ：Ｒ ５ ５ ２ Ｒ ３ ９ ２ ． ３ ３ 文献标 识码 ：Ａ 文章编号 ：１ ０ ０ ４ — ５ ５ ０ ３ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ２ ． ０ １ ９ ４ — ０ ５
Ｓ ｈ ｅ ｎ ｚ ｈ ｅ ｎ ５ １ ８ ０ ５ ５ ，Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ Ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｃ ｅ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
Ｃ ｏ ｒ ｒ ｅ ｓ ｐ ｏ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇ ａ ｕ ｔ ｈ ｏ ｒ ： Ｚ Ｈ Ａ Ｎ Ｇ Ｌ ｉ ￣ ｕ ｎ 。 Ｅ — ｍ ａ ｉ ｌ ： ｃ ７ ｚ Ｏ ＇ ＠ ｓ ｚ ｐ ｔ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ
单克隆抗体免疫亲和层析法制备缺凝血因子Ⅸ人基质血浆的初步报告
单克隆抗体免疫亲和层析法制备缺凝血因子Ⅸ人基质血浆的初
步报告
王海龄;肖小璞;丁卫;李和
【期刊名称】《中国输血杂志》
【年(卷),期】1990(3)1
【摘要】本文报告在 Mg^(++)存在下,将一种能特异地连接凝血因子Ⅸ的单克隆抗体偶联至 Affi-Gell5凝胶上,组成亲和层析柱,新鲜血浆通过该柱时, 唯独因子Ⅸ被吸附,流出液即为成品,以此制备缺因子Ⅸ基质血浆。
成品内残余的因子Ⅸ极少(<1%),而其他凝血因子的活性基本末变。
分别用本成品和重症乙型血友病病人血浆测定因子Ⅸ活性,再将两者的结果进行比较,相关系数 r=0.93(n=26),表明本成品可作为重症乙型血友病病人血浆之代用品。
本法制备缺因子Ⅸ基质血浆快速、简便,仅需一步即可完成。
【总页数】4页(P1-4)
【关键词】血友病;因子Ⅸ;血浆;免疫亲和层析
【作者】王海龄;肖小璞;丁卫;李和
【作者单位】中国医学科学院输血研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R554.104
【相关文献】
1.免疫亲和层析法制备高纯凝血因子Ⅸ和缺凝血因子Ⅸ人基质血浆 [J], 王海龄;肖小璞
2.亲和层析法制备人凝血因子Ⅸ概述 [J], 赖翼;刘阳
3.缺凝血因子Ⅱ/Ⅴ基质血浆测定FⅡ∶C/FⅤ∶C及其临床应用 [J], 薛浩;邓承祺;邱宇
4.单克隆抗体免疫亲和层析法纯化人的凝血因子Ⅸ [J], 王海龄;耿力;丁卫;肖小璞;Steiner J;Battey F;Strickland D
5.联合应用配体和单克隆抗体亲和层析纯化人血浆天然MBL蛋白 [J], 王明永;张丽芸;张雅妮;雷鸣;刘莹;陈政良
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25-羟基维生素D测定试剂盒(荧光免疫层析法)产品技术要求丹大
25-羟基维生素D测定试剂盒(荧光免疫层析法)适用范围：该产品用于体外定量检测人血清、血浆中的25-羟基维生素D含量。
1.1规格1人份/盒；10人份/盒；25人份/盒；50人份/盒；100人份/盒质控品(选配,2水平) ：0.5mL×2； 1mL×21.2组成试剂盒组成见表1表1 25-羟基维生素D测定试剂盒组成注：质控品具有批特异性，每批次靶值详见标签。
2. 性能指标2.1 外观试剂盒外观应整洁, 文字符号标识清晰，液体无渗漏，测试卡完整无破损，质控品为冻干疏松体，复溶后为无色至淡黄色液体。
2.2 装量不少于标示值。
2.3空白限应不高于1 ng/mL。
2.4线性范围在[3，100] ng/mL内，相关系数R应不小于0.990。
2.5 重复性重复测试（20±4）ng/mL和（80±16）ng/mL的样本，所得结果的变异系数（CV%）应不大于15%。
2.6批间差测试（20±4）ng/mL和（80±16）ng/mL的样本，批间相对极差（R）应不大于15%。
2.7准确度回收率为85～115％。
2.8质控品2.8.1质控品赋值有效性试剂盒内的质控品，检测结果均在质控范围内。
2.8.2质控品瓶间差瓶间差CV应不大于15%。
2.8.3质控品复溶稳定性质控品复溶后在2～8℃密封避光保存24h。
检测复溶后的质控品，检测结果均在质控范围内。
2.9 效期稳定性试剂有效期为18个月。
取到效期后3个月内试剂盒进行检测，测定结果应符合2.3、2.4、2.5、2.7、2.8项要求。
2.10溯源性根据GB/T21415-2008的要求，校准曲线溯源至工作校准品，工作校准品与已上市25-羟基维生素D测定试剂盒进行方法学比对赋值。
血液制品病毒灭活及去除工艺进展
血液制品病毒灭活及去除工艺进展摘要：血液制品主要是通过将多人份血浆进行混合之后，使用特定的分离纯化技术制备的产品，血液制品通常被用在医疗急救以及某些特定的疾病预防和治疗中，具有其他药物不可替代的作用。
从理论上来说，经血液传播的疾病也可以经血浆传播，所以，为了能够最大限度保障血液制品的安全性，就需要严格按照原则要求，在生产血液制品的过程中，就需要使用一定的工艺方法对血液制品中的病毒进行灭活处理，去除其中的病毒，制造出健康的血液制品。
鉴于此，本文就血液制品制造过程中的病毒灭活方法和去除工艺展开如下探讨。
关键词：病毒灭活；病毒去除；血液制品1.病毒灭活方法1.1物理方法1.1.1巴氏消毒法这种方法的应用对温度和时间的要求非常高，大量临床研究证明，在溶液状态下，对白蛋白进行10h的60℃加热处理，能够灭活人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV），即巴氏消毒，从而提高白蛋白在病毒安全方面的可靠性。
最近这些年，经常将巴氏消毒法用在静脉注射免疫球蛋白的生产以及纤维蛋白原的处理中。
没有经过巴氏消毒法灭活处理的产品，其输血传播病毒率高达50%~75%，而经巴氏消毒灭活处理之后，产品阳性检出率为0[1]。
1.1.2干热法（冻干制品）干热法也就是对冻干后的制剂使用干热处理和加热处理来杀活病毒的一种方法，常见的干热法主要有10~72h，60~80℃加热法及72h，80℃加热法。
早在20世纪80年代初期，对于FⅧ冻干浓制剂和凝血酶原复合物的处理，就有人用到了10~72h，60~80℃加热处理方法，但是，现在这种方法的使用已经无法满足彻底灭火HCV、HBV、HIV病毒的目的。
1.1.3γ射线辐照法γ射线主要由光子组成，来自于核转变，在放射性衰变过程中形成的子核处于不稳定状态和激发状态，在从高激发态跃迁到低激发态的过程中，就会将γ射线释放出来。
钴－60和铯－137是常用的两种γ射线放射源。
大量实验研究表明，对于大多数微生物，比如无包膜病毒、有包膜病毒以及所有的基因型物质，经过γ射线的辐照都有杀灭作用。
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高纯度的 IgG(每升血浆约 5 克)继续进行浓缩 配制 除
艺或分离纯化技术制备的生物活性制剂 目前国内常用的 制备方法有 Cohn 氏低温乙醇沉淀法 离心法及压滤法
菌过滤和冷冻干燥
新鲜冰冻血浆
层析法等 其中应用最多的是 40 年代发展起来的 Cohn 法 以及改良法 随着国内生产能力的相对过剩 市场竞争日 趋激烈的现状 各厂家急需改进生产工艺 增加收率 改
Sepharose 4 FF
液经过 脱盐 浓缩 配制 除菌分装等步骤 得到 IVIG
Q Sepharose FF
制品
FII+III 沉淀溶解
S/D 处理
膜过滤
SP Sepharose FF
辛酸病毒灭活
80 72 小时
板框过滤
高纯 FVIII
图 5 FVIII(Nordiate)的工艺流程
强阴离子 Sepharose FF
Q Sepharose FF CM Sepharose FF
产不同产品
Sephacryl S-200
S/D 处理
从生产经济学角度来看 规模 产量 速度和重复性 是生产工艺生存适应的基本组合 安发玛西亚生物技术公
60 10 小时
CM Sepharose FF
司积累几十年层析技术研发的经验 专门为从中试试生产
Alb,IgG
Centre Regional de Transfusion Sanguine (CRTS)
超滤 调制 IVIG
图 4 从 FII+III 沉淀层析法制备 IVIG(Bayer corporation USA)
工艺的效率 步骤(FII III 沉淀 分装)
的病毒灭活方法 深滤 通过两个串联的离子交换柱吸附
以得到高的纯度和收率
杂蛋白 第一个柱子是强阴离子交换的 Sepharose FF 凝胶
新鲜冰冻血浆
用以吸附所有可检测到的白蛋白 大多数的 IgA 及一些
化浆
IgM 第二个柱子是一种弱阴离子交换的 Sepharose FF 凝 胶 用来吸附剩余的 IgM 和其它污染物 过柱后的 IgG 溶
能力
去冷沉淀上清 DEAE Sephadex A-50
丹麦的 Hema Sure Denmark A/S 工厂 自 1993 年以 来 采用全层析工艺生产高纯 FVIII 商品名 Nordiate 方法如下
新鲜冰冻血浆融化后 通过 Sepharose 4 FF 凝胶过滤 柱 得到初纯的 FVIII 此步骤可以获得 60 70 的 FVIII 回收 比传统的冷沉淀法高 40 50 的收率 通过 Q Sepharose FF 去除混入的 IgG 和 Albumin 后 接着进行 S/D 法灭活脂包膜病毒 用 SP Sepharose FF 去除残留 S/D 及进 一步纯化 经过脱盐 超滤浓缩和冻干后 80 72 小时灭 活病毒 得到制品 整个工艺可以得到 200IU FVIII/L 血 浆的高收率和比活为 300IU FVIII/mg 蛋白的高纯 FVIII 将此工艺稍加改动 即可用于 vWF 因子的纯化 同样可
Amersham Pharmacia Biotech Application Note
层析法血浆产品制备
凝胶)进一步纯化 使用 S/D 法进行病毒灭活 残留的 TNBP 以及 Tween-80 再经过 CM Sepharose Fast Flow 去除 接着
血液制品主要指以健康人血液为原料 采用生物学工
PKA 低 于 10IU/ml 精 氨 酸 特 异 性 的 蛋 白 酶 活 性 低 于
情况下进行 只要加大层析柱的直径或增加柱子的数
1.5IU/L 比市场上其它四种品牌的 IgG 质量更优 精氨酸
目即可 而不必象 Cohn 法车间 需要对现有生产有太
特异性的蛋白酶是造成 IVIG 长期放置 特别是孵放后 IgG
但运行成本比低温乙醇法厂低 4 白蛋白的入库收率为 24 26 g/L
参数
纯度(% w/w) 单体(%)
二聚体(%) 多聚体(%)
PKA(IU/ml) 热源(EU/ml) 铝离子(mg/L) 杂蛋白含量(%w/w)
转铁蛋白 触珠蛋白 а1-糖蛋白 а2-HS 糖蛋白
а1-AT Apolipoprotein A1
图 1: 层析法白蛋白和球蛋白工艺流程
用此法生产的白蛋白纯度超过 98 而且没有多聚
体 PKA 低于 10 IU/ml 铝离子含量也少于 20 g/L 完
全符合 FDA 和 EU 欧洲药典 的要求
检测项目
层析法白蛋白
欧洲药典
pH 吸收度 E403
PKA Al3+ 多聚体 二聚体 单体 内毒素
6.8 7.1 0.03-0.08 <10 IU/ml <20 g/L
多次的中断才能完成改造 层析技术是一种模块化的
水解产生裂解片段 影响制品稳定性的主要原因 液剂 IVIG
应用方法
尤其如此 加入层析方法 可以很好的解决这个问题 同
6 经验证明 增加新的制品生产线 只需要在白蛋白工
时还能降低 IgA 的含量
艺主线的分支上加入其它的层析柱即可 CSL 的 IVIG
层析生产线的增加就是一个完美的例子 这就更加坚
0 1.5% 98.5% <1 IU/ml
6.7 7.3 <35 IU/ml <200 g/L
95%
表 1 白蛋白成品检测结果与欧洲药典标准的比较
析法白蛋白的生产和临床应用 证明层析技术的可靠性及
安全性 此层析技术同时更广泛的应用到各血液制品生产
厂家与 Cohn 法结合 在 IVIG 白蛋白生产 去除热源等
开发这种工艺是基于几种要求的综合考虑 首先 拜 耳公司可以用 Cohn 法 FII III 为原料 第二 可以容易的 整合进病毒灭活的方法 最后 能够放大到每批 200Kg FII
III 沉淀的规模 工艺流程如下 FII III 沉淀溶解后 进行使用辛酸
2
Amersham Pharmacia Biotech Application Note
CL-6B 推出后 从
到
年间 有超过 7
千万单位的高纯度 FIX 是用层析方法生产出来的 结合 S/D
处理 对包括 HIV 在内的脂包膜病毒清除率 10 log10 对 包括 SV-40 在内的非脂包膜壳病毒清除率 6.3 log10 新 介质 Heparin Sepharose FF 的面世将加快纯化的速度及处理
副反应例数 每批副反应数 x100
5 NSA(n=144) 93.7-100 90-98 1-3.0 0-8.4 <1-38.3 <0.06-4.8 9-80
0.06-0.46 0.13-0.21 0.23-0.28 0.46-0.76 <0.01-0.016
<0.004 77
0.015%
Albumex 5(n=23) 100 >99
图 2 层析法白蛋白制品和市场上其它三种品牌白蛋白的
PAGE 电泳比较图
1 3 市场上其它三种品牌白蛋白
4
层析法白蛋白制品
1
IgG 成品的纯度大于 99
Amersham Pharmacia Biotech Application Note
而且只有<1 的多聚体
5 研究表明 扩大产生规模 可以在不影响现有生产的
S/D 处理
DEAE Sepharose FF
Heparin Sepharose CL-6B
拜耳公司是美国 IgG 产量第一的血液制品生产企业 他们通过研究 开发了一种基于层析技术的 IVIG 生产工 艺 在原来低温乙醇工艺的基础上 提高了 50 的收率 在研发中 他们筛选了 42 种不同基质合成的凝胶 发现 效果最好的凝胶是安发玛西亚公司的基于 Sepharose Fast Flow 的离子交换凝胶
方面大量使用 具体方法如下
血浆先被解冻 然后用 Sephadex G-25 Coarse 凝胶柱
过滤换成醋酸钠缓冲液 沉淀去除优球蛋白 此时再把血
浆过阴离子交换凝胶 DEAE Sepharose Fast Flow 该凝胶
吸附白蛋白而让 IgG 组分流穿 白蛋白组分洗脱出来后
经过阳离子交换凝胶 CM Sepharose Fast Flow 最后用凝胶
收率 生产周期 小时
Cohn 法 11 48 100
表 3 IVIG 生产工艺效率的比较
层析法 8 75 30
在拜耳公司的报告指出 这种基于层析的工艺是超过
低温乙醇法的重大进步 产品的纯度 收率均提高 选用
Sepharose FF 系列凝胶的原因是 它们的吸附能力和再生
能力的综合性能是 42 种凝胶中最好的
0.2-0.6 0-0.6 <1-11.9 <0.06 2-22
<0.03 <0.03 <0.01 <0.04 ≧0.004 ≧0.004
3 0.0024%
表 2 层析法白蛋白(Albumex 5)与 Cohn 法白蛋白(5% NSA)的比较
美国拜耳公司 Bayer corporation, USA
澳大利亚 Commonwealth Serum Laboratory (CSL)
澳大利亚国民血清实验室 CSL 从 1995 年六月开 始建成投产了世界上最大的层析法白蛋白生产线 新生产 线的年处理量为 500 吨血浆 他们采用 Cohn 法与层析法 结合的工艺 将 FII III 上清脱盐 沉淀优球蛋白后 通 过 DEAE Sepharose Fast Flow CM Sepharose Fast Flow 两 步离子交换凝胶 一步 Sephacryl S-200 High Resolution 凝 胶过滤层析 得到白蛋白制品 从 CSL 的生产部经理 Edward M. Smith 先生在 1999 年第一届国际血液制品生物 技术会议上发表的论文可知 他们采用这种工艺 四年来 共投 1400 吨血浆 没有一批污染热源和 PKA 超标 主要 得利于层析工艺生产的自动化控制 减少了 Cohn 法中的 手工操作而来 而且 他们还将层析工艺十分成功地运用 于全低温乙醇法中因为热源 PKA 以及小白点数超标的不 合格制品的回收 他们的其它经验如下 1 层析凝胶的使用寿命超过 5 年 2 因为层析技术的运用 降低了最终产品的生产成本 3 建立一个层析工厂的资金花费与低温乙醇法厂相当