蛋白酶活性的测定
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法有多种，常见的方法包括：
1. 比色法：基于酶催化底物的产物与染色剂之间发生化学反应的原理。
测定过程中，酶水解底物产生的产物与染色剂发生反应形成有色产物，通过测定产物的吸光度来估计酶活性的强弱。
2. 荧光法：利用荧光底物的酶催化产物发出的荧光信号来测定酶活性。
荧光强度与酶催化产物的浓度成正比，通过测定荧光强度来分析酶活性。
3. 放射性标记法：将底物标记上放射性同位素，使其具有放射性。
通过测定底物放射性崩解的程度来估计酶活性的大小。
4. 免疫学方法：利用特异性抗体与酶结合形成抗原-抗体-酶复合物，测定抗原-抗体-酶复合物的活性来检测酶活性的强弱。
5. 吸收光谱法：利用特定的酶底物，通过测量其吸收光谱的变化来分析酶活性的强弱。
需要根据具体实验目的和条件选择适合的测定方法。
蛋白酶酶活测定方法
蛋白酶酶活测定方法一、实验原理：一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及脂类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸（TCA）溶液的肽的数量与酶的数量和反应时间成正比。
在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，计算酶的活力。
一分钟内1mg牛血清蛋白（BSA）相当的非蛋白性Lowry试液显色物质的增量值定义为一个蛋白酶活性单位（IU）。
二、试剂配制：A溶液：含2%KCl，1%TrltonX-100的50mM磷酸盐缓冲溶液（pH 6.0）试样TG酶溶液：直接取发酵样12000rpm离心5min，取上清测定。
底物溶液：精确称取底物二甲基酪蛋白0.250g，加入50mM PB缓冲溶液（pH 6.0）10mL，常温搅拌30min使其溶解后备用。
三、操作步骤：1. 试样1）将底物溶液放入37℃恒温水浴中预热备用2）试管中加入试样TG酶溶液0.2mL后放入恒温水浴中，10min后加入已预热的底物溶液1mL，立即振荡混合，于37℃反应60min3）反应结束后，加入12% TCA溶液1mL，再于37℃反应30min，使反应终止4）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。
2.空白1）试管中加入已预热底物溶液1mL，再加入12% TCA溶液1mL，振荡混合后，于37℃反应60min2）加入试样TG酶溶液0.2mL，振荡混合后，于37℃反应30min3）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。
四、Lowry法显色反应试管中分别加入试样清液和空白清液各0.2mL，加入A溶液1mL，振荡混合后室温下放置10min，然后加入试剂B 0.1mL，振荡混合后，于37℃反，空白的吸应30min。
蛋白酶活性测定
1.5.2.2 蛋白酶活性测定采用福林酚−试剂法[3]测定肠道及肝胰脏中蛋白酶活性，其原理是：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯醋酸（TCA ）氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，这些氨基酸可与福林酚试剂反应呈蓝色，用756分光光度计在波长680nm 测定。
蛋白酶活性的定义：1克食糜或组织在30℃，pH7.0[4]的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg 酪氨酸的酶量为1个蛋白酶活力单位。
测定步骤如下：将2%的酪蛋白溶液放入30℃恒温水浴锅中预热3-5min ，每个样品取两个重复（每个酶液样品设一个空白对照），各取1mL 酶液注入试管中，在30℃恒温水浴锅中预热1-2min ，加入2%的酪蛋白1mL ，准确反应10min ，加0.4M 三氯醋酸2mL 终止反应，在水浴锅中静置10min 后过滤，取滤液0.5mL 加0.4M 碳酸钠溶液2.5mL ，并加入显色剂福林试剂0.5mL 摇匀，在30℃恒温水浴中显色20min ，取出放在756分光光度计，680nm 的波长下测定吸光度（OD ）。
蛋白酶活性计算公式：4—反应总体积(mL) 10—反应时间(min) K —标准曲线获取 N —酶液稀释倍数 M —样品质量(g)A. Setting up the Protease Assay1. Pre-heat 0.5% Casein solution In a water-bath at 30 o C for 5min2. Follow the following table蛋白酶酶活性(U/g) =4×K×OD×N 10×M3.4.Follow the following table to determine sample blank。
蛋白酶活力的测定
1 蛋白酶活力的测定1.1 原理采用福林-酚试剂法。
福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。
因此可利用此原理测定蛋白酶活力。
通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。
1.2 试剂1.2.l 福林-酚试剂向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴溴水，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL乱，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。
此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。
1.2.2 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。
1.2.3 0.4mo1/L碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。
1.2.4 pH值3～6醋酸缓冲液精确取NaAc?3H2O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合，用去离子水稀释定容至1000mL。
1.2.5 2%酪蛋白底物缓冲液1.2.5.1 测试酸性蛋白酶缓冲液精确称取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制)，在水浴中加热溶解，然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。
蛋白酶活性测定方法
水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取 3 尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4C冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入一26C冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。
二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml, 4C冷却去离子水稀释，4C下离心20min（13, OOOg）, 上清液标号分装，并与4C冰箱中冷却保存，24Hr待测。
将肝胰脏及肠道组织用4C去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。
按样品重量加10倍的4C冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm 匀浆玻璃管外设冰浴）。
匀浆液在4C下离心20分钟（13, OOOg）,上清液标号分装，并于4C 冰箱冷却保存，24Hr 内测定完毕。
酶粉及饲料：取2 . 0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。
测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。
取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。
三、酶活性测定1. 蛋白酶测定：前、中、后肠,肝胰脏。
方法：福林—酚试剂法1.1 原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA ）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等） ,这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应）,用分光光度计测定。
1.2 蛋白酶活性单位：1克食靡或组织在30C, PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为 1 个酶活力单位。
1.3 试剂1. 福林试剂（已配）2. 0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3 ）42.4g 用水溶解和定容至1,000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。
3. 0.1M三氯醋酸（TCA ）:用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1 , 000ml 。
蛋白酶活性采用茚三酮比色法测定
蛋白酶活性采用茚三酮比色法测定
称取29过lm二筛的风干土样置于IOOml三角瓶中。
往三角瓶中加入0.5ml甲苯，摇匀后放置15分钟。
再加入10ml用pH7.4磷酸缓冲液配制的白明胶溶液，将瓶塞紧，小心摇荡。
将三角瓶置于30℃恒温箱中，培养24h。
培养结束后，将瓶中悬液用致密滤纸过滤至另一三角瓶中。
吸取sml滤液于一试管中，加 0.5ml0.IN硫酸和 3ml20%硫酸钠以沉淀蛋白质，然后再过滤到另一试管中。
于上述试管中加入lm120/0荀三酮溶液，将混合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴上
加热 10min。
将着色液转移到50ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至刻度。
用光电比色计于56Onm处进行比色测定。
实验设无土对照和无基质对照。
蛋白酶活性以24h后19土壤中酶促反应后生成的甘氨酸毫克数表示。
中性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定
取10.00g新鲜土壤(<lmm)于 100ml容量瓶中，加入1.5ml甲苯，室温下静置15min，然后加 10ml磷酸苯二钠溶液和ZOml柠檬酸缓冲溶液，盖上瓶塞，充分混匀后，37’C下培养3h，用38.C去离子水定容至IOOml，摇匀后迅速过滤。
同时做空白对照，用10ml去离子水代替磷酸苯二钠溶液。
三次重复。
取上述滤液卜4ml于 50ml容量瓶中，加 2.5ml缓冲液，混匀后用去离子水稀释至大约4Oml，再加0.5m12，6一二滇2424酮氯亚按溶液，室温下20一3Omin，定容至50ml，在 600nm处比色测定。
结果以24h后19土壤中释放出的酚的mg数表示。
蛋白酶活性的测定方法
结果分析
酶活性计算
根据实验数据，计算蛋白酶的活性，包括比活力和米氏常数等参 数。
显著性检验
通过t检验、方差分析等方法，对实验组和对照组之间的差异进行 显著性检验，确定实验结果是否具有统计学意义。
可重复性评估
评估实验结果的重复性，判断实验方法的可靠性和稳定性。
误差分析
误差来源
分析实验过程中可能存在的误差来源，如试剂不纯、 操作误差、仪器误差等。
电化学法
总结词
电化学法是一种快速、简便的蛋白酶活性测定方法，通过电化学信号的变化来检 测酶的活性。
详细描述
电化学法利用电化学探针或电极检测酶反应过程中产生的电化学信号，如电流、 电位等，通过分析这些信号的变化可以计算酶的活性。该方法具有快速、简便和 实时监测等优点。
核磁共振法
总结词
核磁共振法是一种高分辨率、高灵敏度的蛋白酶活性测定方法，通过检测核自旋磁矩的变化来计算酶的活性。
酶液的保存
选择适当的保存条件，如温度、pH值和添加稳定 剂等，以确保酶液的活性。
反应条件优化
温度对酶活性的影响
通过在不同温度下测定酶活性，找到最适温度范围，确保酶活性 的最大化。
pH对酶活性的影响
在不同pH条件下测定酶活性，找到最适pH值，确保酶活性的最大 化。
底物浓度对酶活性的影响
通过改变底物浓度，观察酶活性的变化，找到最佳底物浓度。
在测定过程中，可能存 在异常值、缺失值或重 复数据，需要进行数据 清洗，确保数据准确性 和可靠性。
图表绘制
通过绘制图表，如柱状 图、折线图或散点图， 可以直观地展示蛋白酶 活性随时间、温度、pH 等参数的变化趋势。
数据转换
根据需要，对数据进行 适当的数学转换，如对 数转换或归一化处理， 以便更好地分析数据。
SUMO蛋白酶活性片段的表达、纯化及活性测定
SUMO蛋白酶活性片段的表达、纯化及活性测定
SUMO蛋白酶被认为在多种细胞过程中起着调节作用。
为了
进一步研究SUMO蛋白酶的生物学功能，需要进行其活性片
段的表达、纯化及活性测定。
首先，可以使用质粒构建技术从人类cDNA库中克隆SUMO
蛋白酶的一个片段，如Ulp1，Ulp2或Ulp3。
将其插入到表达
载体中，并进行适当的序列验证。
接下来，需要选择适当的宿主细胞进行表达。
常用的宿主细胞为大肠杆菌，但也存在其他表达系统，如酵母菌表达系统。
通过在表达时添加不同的诱导剂，可以控制蛋白的表达量和时机。
之后，需要对表达的蛋白进行纯化。
可以利用亲和纯化柱进行初步的纯化，然后再使用离子交换、凝胶过滤和透析等方式进行进一步的纯化。
纯化后的蛋白需要经过SDS-PAGE和Western blot验证。
最后，需要对SUMO蛋白酶活性片段进行活性测定。
可以观
察其对SUMO修饰蛋白的去SUMO化作用。
可以通过Western blot、荧光标记或质谱等方法进行定量。
活性测定的
结果可以用于进一步研究SUMO蛋白酶的生物学功能及调节
机制。
在表达、纯化和活性测定这一系列实验中，需要严格控制实验条件和研究方法。
同时，还需要注意跟踪和记录实验结果，以便后续分析和讨论。
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实验四蛋白酶活力的测定
一、实验目的
1、了解蛋白酶活力测定的原理；
2、掌握蛋白酶活力测定的方法。
二、实验原理
蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。
三、实验试剂
①微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）：称取1.0g酶制剂，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数；
②0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5）；
③1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5），加热并搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；
④5%三氯醋酸（TCA）溶液。
四、实验步骤
1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37℃下保温。
2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号A1、A0、B1和B0。
在A1和A0试管中各吸入0.20ml酶液，在B1和B0试管中各吸入0.40ml酶液，分别用0.2mol/L 磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。
在A0和B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中保温。
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（准确计时）10min37℃下保温3、在各试管中吸入2.00ml 1%酪蛋白溶液，在三氯醋酸溶液。
试管中吸入6.00ml5%后，再向A1和B1，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保1h4、将试管从水浴中取出，在室温下放置留滤出液。
滤液的吸光和B1和B0滤液为空白，测定A15、在280nm波长下，分别以A0 度。
五、计算0.001吸光度定义为一个酶单位。
1、在规定的实验条件下，以每分钟增加2、每克酶制剂中酶活力的计算：克酶制剂酶活力单位/×1000 / (t ×w) A ?酶作用t ——和B1的吸光值）；A1 式中，?A——样品与空白吸光度差值（即g w——反应中酶的用量，时间（本实验为10min）；
六、说明范围表现出活力，但是在接近中性条、微生物蛋白酶粗提取液在较宽广的PH 1 件下最有最高活力。
℃以下可保持较长时间的稳定性。
2、微生物蛋白酶在45
七、思考题、蛋白酶有哪几类？1 、影响酶活力的因素有哪些？2 、使用紫外分光光度计时应注意哪些问题？3六、数据记录与处理
A1 = 0.279 B1 = 0.573 酶含量为0.001g/ml
酶活力1 = ?A ×1000 / (t ×w)
= 0.279×1000/10/0.001/0.20=1.395×10酶活力单位/克酶制5剂
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酶活力2= ?A ×1000 / (t ×w)
克酶制/ = 0.573×1000/10/0.001/0.40=1.4325×10酶活力单位5剂
克酶制剂/=141375酶活力单位（1.395×10平均值= + 1.4325×10）55
）/141375 ×100%=2.65%143250 - 139500= （平均相对相差
七、思考题
、蛋白酶有哪几类？1
内肽酶：切开蛋白质分子内部肽键，答：①按蛋白酶水解蛋白质的方式：A切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基B外肽酶：生成相对分子质量较小的多肽类；水解蛋白D水解蛋白质或多肽的酯键；末端的肽键，而游离出氨基酸的酶类；C 质或多肽的酰胺键。
②按酶的来源可分为：动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶
酵母蛋白酶和放线菌蛋白霉菌蛋白酶、③微生物蛋白酶又可分为：细菌蛋白酶、酶
）（B）可以分为（APH2.5~5.0的酸性蛋白酶，④按蛋白酶作用的最适PH的中性蛋白酶PH7~8（的碱性蛋白酶，C）PH9.5~10.5
、影响酶活力的因素有哪些？2
酶活力的大小即酶含量答：酶活力是酶催化某一化学反应的速率来表示的。
酶活
力的测可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示，的多少，定也就是测定酶促反应的速率。
在一定范酶促反应速率与酶分子的浓度呈正比，①酶浓度对酶活力的影响：围内，当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。
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②底物浓度对酶活力的影响：若酶的浓度为定值，底物的起始浓度越低时，当所有的酶与底酶促反应速度与底物浓度呈正比，即随底物浓度的增加而增加。
酶促即使再增加底物浓度，中间产物浓度也不会增加，物结合生成中间产物后，反应速度也不会增加。
酶促反应速度随温度升高而在适宜的温度范围内，③温度对酶活力的影响：增加，超过最适反应温度，酶活力将会下降。
范围内表现出活性，大于或小于最适PH④PH对酶活力的影响：酶在最适，都会降低酶活性。
PH
有机化合物可作为激某些无机阳离子、⑤激活剂对酶活力的影响：阴离子、活剂，能够激活酶，使其表现出催化活性或强化其催化活性。
⑥抑制剂对酶活力的影响：酶的抑制剂能够减弱、抑制甚至破坏酶的活力，它可降低酶促反应速度。
、使用紫外分光光度计时应注意哪些问题？3
手指应拿毛玻璃面的两侧，并注意配对使用。
答：①使用的比色皿必须洁净，为度。
透光面要用擦镜纸擦拭干净。
装盛样品量以2/3
倒置晾干。
使用后应立即用自来水冲洗干净，②比色皿使用前应用试样润洗，间最符合吸收定律，线性好，读数误差③测定溶液的吸光度值应在0.1~0.7小。
④吸光值在测定前应用空白溶液校正调零，再进行测定。
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