癌症-样品特性及测序质量全解析
Raw data（G）
Effective (%)
Q30 (%)
GC (%)
Duplicate（%）
Properly mapped（%）
90.82
97.39
89.27
43.56
93.77
99.35
90.23
42.77
91.37
97.13
88.67
42.75
A-1A-2A-3
Sample
图1 DNA样品电泳检测
常规正常样品测序数据质量高，有效数据比例多在98％-99%范围内，GC含量分布正常，d up比例在7％-15%之间，Prop erly mapped比例一般不低于97%。
目前诺禾致源已经完成人基因组相关项目总计1600+，样本总计20000+，具有丰富的样本处理经验。
D-1D-2D-3
Q30 (%)
GC (%)
Duplica te（%）
99.36
99.85
85.38
45.06
91.06
99.79
85.57
46.06
109.46
99.58
87.84
44.87
Sample
Raw data（G）
Effective (%)
Q30 (%)
GC (%)
Duplica te（%）
Properly mapped（%）
10.03
99.94
91.63
48.27
10.74
99.90
91.40
48.74
16.22
99.93
90.41
49.16
B-1B-2B-3 Raw data（G）
Effective (%)
Q30 (%)
GC (%)
Duplica te（%）
Properly mapped（%）
3.30
95.00
96.64
45.06
3.29
95.44
95.72
45.19
3.29
95.44
95.72
45.23
C-1C-2C-3
Sample
项目经验
cfDNA（Cell-free DNA）
cfDNA以核小体为载体释放进入血液循环系统，大部分提取得到的cfDNA长度都在166bp左右，或是166bp的倍数；总量方面，血浆中cfDNA含量个体差异很大，一般1ml血浆可提取10-50ng cfDNA。
采用国际认可度最高的c fDNA提取试剂盒：QIAamp? C irculating Nucleic Acid Kit，提取成功率约67%。利用Agilent 2100 bioanalyzer 检测c fDN A片段分布情况，观察其样品是否存在基因组污染。
图3 Agilent 2100 bioanalyzer检测cfDNA峰图
由于c fDN A建库起始量低及插入片段长度较短等原因，通常存在有效数据比例偏低、d up偏高、properly mapped偏低的情况。
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人类基因组学
样品特性及测序质量全解析
DNA测序常见问题及分析
DNA测序过程可能遇到的问题及分析 对于一些生物测序公司（如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。 为什么呢？ PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。 N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。在序列的3’端易产生N值。一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。 测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。有两种方法可以得到引物序列。1.对于较短的PCR产物 （<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。载体上的通用引物与所插入序列间
中国2019最新癌症统计数据出炉
中国2019最新癌症统计数据出炉！ 2019年1月，国家癌症中心发布了最新一期的全国癌症统计数据。报告显示，2015年全国恶性肿瘤发病约392.9万人，较2014年的380.4万增加12.5万，增长率为3.2%；这意味着，平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7.5人被确诊为癌症。 发病率最高：肺癌 从发病人数看，肺癌仍位居我国恶性肿瘤发病首位，发病人数为78.4万。第二至第十分别为胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、甲状腺癌、子宫颈 癌、脑癌、胰腺癌。前10位恶性肿瘤发病约占全部恶性肿瘤发病的76.70%。
前十位癌症发病人数（万） 其中，男性发病首位为肺癌，每年新发病例约52.0万，其他高发恶性肿瘤依次为胃癌、肝癌、结直肠癌和食管癌等，前10位恶性肿瘤发病约占男性全部恶性肿瘤发病的82.20%。 女性发病首位为乳腺癌，每年发病约为30.4万，其他主要高发恶性肿瘤依次为肺癌、结直肠癌、甲状腺癌和胃癌等，女性前10位恶性肿瘤发病约占女性全部恶性肿瘤发病的79.10%。 40岁以上发病率快速上升 癌症发病随年龄增加而上升，40岁以下青年人群中，癌症发病率处于较低水平；从40岁开始快速升高，发病人数分布主要集中在60岁以上，到80岁达到高峰。
2015年中国恶性肿瘤年龄别死亡情况估计 女性乳腺癌发病从30岁左右开始上升，男性前列腺癌发病则从60岁左右才开始上升。因此，应针对不同癌症发病年龄特点，采取有针对性的防控措施。 生存率与欧美国家仍存在较大差距 在过去的十余年里，我国癌症生存率呈逐渐上升趋势，目前癌症5年相对生存率约为40.5%，与十年前相比，提高了约10个百分点，但与欧美发达国家相 比还有很大差距。 主要原因是，我国癌谱和发达国家存在差异。我国高发癌是预后较差的肝癌、胃癌和食管癌等消化系统肿瘤，欧美发达国家则是甲状腺癌、乳腺癌和前列腺癌等预后较好的肿瘤高发。 同时，我们也应看到，我国预后较好肿瘤的5年生存率，比如乳腺癌(82%)、 甲状腺癌(84.3%)和前列腺癌(66.4%)，仍与欧美发达国家存在差距，美国的数字依次为90.9%、98%和99.5%。 差距的根源在于，我国癌症患者早诊早治率低、晚期病例临床诊治不规范。因此，扩大癌症筛查覆盖面、促进肿瘤诊治规范化，是我国亟需发力解决的两个问题。 随着我国人口老龄化逐渐加剧、工业化和城镇化进程的不断加快，以及慢性感染、不健康生活方式等危险因素的累加，癌症防控形势比较严峻。
国家癌症中心全国癌症报告
国家癌症中心全国癌症 报告 This model paper was revised by LINDA on December 15, 2012.
全国肿瘤登记中心负责全国肿瘤登记数据收集、质量控制、汇总、分析及发布工作。2018年2月，国家癌症中心发布了最新一期的全国癌症统计数据。由于全国肿瘤登记中心的数据一般滞后3年，本次报告发布数据为全国肿瘤登记中心收集汇总全国肿瘤登记处2014年登记资料。 报告主要发现 2014年全国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例（男性211.4万例，女性169.0万万例），平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7个人被确诊为癌症。 肿瘤发病率为278.07/10万（男性为301.67/10万，女性为253.29/10万），中标率（中标率：人口标准化率按照2000年中国标准人口结构）为190.63/10万，世标率（世标率：人口标准化率按照Segi's世界标准人口结构）为186.53/10万。0-74岁累积发病率为21.58%。 胂瘤死亡率为167.89/10万，中标率为106.98/10万，世标率为106.09/10万。0-74岁累积死亡率为12.00%。 恶性肿瘤发病率由高到低依次为东部、中部、西部。调整人口结构后地区间发病率的差异缩小，但趋势并未改变。各地区中男性发病率均高于女性。 按发病例数排位，肺癌位居全国发病首位，每年发病约78.1万，其后依次为胃癌、结直肠癌、肝癌和乳腺癌。肺癌和乳腺癌分别位居男女性发病的第1位。 恶性肿瘤死亡率由高到低依次为东部、中部、西部，调整人口结构后，中部地区死亡率高于东、西部地区。各地区肿瘤年龄别死亡率趋势相似，主要恶性肿瘤死因大致相同，肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌在各地区均为主要恶性肿瘤死因。 报告数据来源和质量控制 截至2017年8月30日，全国肿瘤登记中心共收集到全国31个省、自治区、直辖市的449个登记处提交的2014年肿瘤登记资料，其中县级以上城市160个，县及县级市289个。根据质量控制标准纳入339个登记处，其中东部地区140个，中部地地区112
一代测序常见问题及解决策略
测序常见问题及解决策略 一、PCR常见问题 1.假阴性，不出现扩增条带 PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因： 1）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。 2）酶：酶失活或反应时忘了加酶。 3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 4）反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。 5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 2.假阳性 假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。常见原因有： 1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引 物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。二是空气中的 小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 3.出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物
国家癌症研究中心(IRAC)致癌物分类
国际癌症研究中心（IARC）致癌物分类（2005） 1类（95种）+2A类（66种）+2B类（241种） 天然的黄曲霉毒素 4－氨基联苯 砷及其化合物1 石棉 硫唑嘌呤、氮杂硫嘌呤 苯 联苯胺 铍及其化合物2 N，N－双（氯乙基）－2－萘胺（萘氮芥） 双氯甲醚和氯甲甲醚（工业品） 1，4－丁二醇二甲烷磺酸酯；白消安；马利兰 镉其化合物 苯丁酸氮芥 1－（2－氯乙基）－3－（4－甲基环己）－1－亚硝脲、赛氮芥 铬化合物（六价）2 环孢霉素 环磷酰胺 己烯雌酚 EB病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒 毛沸石 环氧乙烷3 鬼臼乙叉苷与顺氯氨铂和博来霉素合用 甲醛 砷化镓 幽门螺旋菌（感染） 乙型肝炎病毒（感染） 丙型肝炎病毒（感染） 含麻兜铃碱的草药 人免疫缺陷病毒Ⅰ型（感染） 人乳头瘤病毒16型 人乳头瘤病毒18型 人T－细胞亲淋巴病毒Ⅰ型 左旋苯丙氨酸氮芥；米尔法兰 8－甲氧基补骨酯素加长波紫外线 MOPP及其他包括烷化剂的联合化疗 芥子气；硫芥 2－萘胺
中子 镍化合物2 绝经后的雌激素治疗 非甾族雌激素1 甾族雌激素1 麝猫后睾吸虫（感染） 联合口服避孕药（注：也有结论性证据证明本品有保护作用对抗卵巢癌和子宫内膜癌）序贯口服避孕药 32磷，作为磷酸盐 239钚及其衰变物（可含有240钚和其他同位素），作为气溶胶 放射性碘的短寿同位素，包括因原子反应器事故和核武器爆炸来源的131碘 核素，发射α粒子，体内沉积 核素，发射β粒子，体内沉积 224镭及其化合物 226镭及其化合物 228镭及其化合物 222氡及其化合物 埃及血吸虫 二氧化硅，结晶型（职业接触吸入的石英或方晶石尘） 日光辐射 含石棉状纤维的滑石 三苯氧胺、它莫西芬（注：也有结论性证据证明本品可降低对侧乳房癌危险） 2，3，7，8－四氯二苯－对－二噁英、TCDD3 噻替哌 232钍及其衰变物，以二氧化232钍胶体溶液静脉注射 苏消安 氯乙烯 X-射线和γ射线 混合物： 酒精饮料 含非那西汀的镇痛合剂 槟榔果 槟榔与烟草同嚼（含烟草的萎叶） 不含烟草的萎叶 煤焦油沥青 煤焦油 未处理和稍处理的矿物油 咸鱼（中国式咸鱼） 页岩油 烟炱 无烟的烟草制品 木尘
国家癌症中心最新癌症报告：乳腺癌为宫颈癌的三倍
国家癌症中心最新癌症报告：乳腺癌为宫颈癌的三倍 导读：中国最新癌症报告发布，报告显示，我国恶性肿瘤负担日益加重，城乡差异较大，其中乳腺癌依然是我国主要的恶性肿瘤，为女性癌症发病首位，并且由于地区分布不均衡，导致乳腺癌防控形势严峻，防治难度巨大。 恶性肿瘤（癌症）已经成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一，其中乳腺癌为女性癌症之首。根据最新的统计数据显示，女性乳腺癌恶性肿瘤死亡占女性居民全部死因的17.1％，且近十几年来乳腺癌的发病死亡均呈持续上升态势。扩大乳腺癌的筛查及早诊早治覆盖面，为降低我国乳腺癌死亡率具有重要意义。 乳腺癌发病率为宫颈癌的三倍 根据国家癌症中心2019年中国最新癌症报告显示，女性发病首位为乳腺癌，每年发病约为30.4万，其他主要高发恶性肿瘤依次为肺癌、结直肠癌、子宫癌、甲状腺癌和胃癌等，目前基层医院最为重视的宫颈癌甚至都排不上前五。 数据显示，乳腺癌占女性癌症发病率的17.10%，而宫颈癌为6.24%，乳腺癌发病率将近是宫颈癌的三倍。
大城市女性乳腺癌风险最高 近年，我国乳腺癌发病率的增长速度，高出高发国家1～2个百分点，城市地区发病率约为农村地区的2倍。 报告表明，城市地区主要高发恶性肿瘤依次为肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌和肝癌等，农村地区主要高发恶性肿瘤依次为肺癌、胃癌、肝癌、食管癌和结直肠癌等。城市地区与农村地区前10位恶性肿瘤发病分别占城乡全部恶性肿瘤发病的74.80％和79.50％。 其中乳腺癌在农村与城市有较为明显的区别，表现在城市乳腺癌发病率高于农村，而农村乳腺癌死亡率高于城市。 这可能与城乡生活差异有关，农村地区相较城市生活节奏慢，工作压力小，因此乳腺癌发病率较少，但由于农村医疗条件差、诊治水平低、居民健康意识不足，导致乳腺癌生存率相对偏低。与之相反的是，城市生活节奏快，工作强度大，乳腺癌发病率高。但城市医疗条件好，相比农村，城市对癌症的科普比较全面深入，因此死亡率低。 与其谈癌色变，不如及早预防 据国家癌症中心专家介绍，癌症有三分之一可以预防，三分之一可以治愈，三分之一可以缓解，只要有针对性的检测，个性化疗养保健，
20个测序常见的问题
20个测序常见的问题 1．为什么需要新鲜的菌液？ 首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。2．如何提供菌液？ 如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以将培养好的4～5ml菌液沉淀下来，倒去上清以方便邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。 3．如何制作穿刺菌？ 用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂(7g/L)斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或4度保存。 4．PCR产物直接测序有什么要求？ （1)扩增产物必须特异性扩增，条带单一。如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果； (2）必须进行胶回收纯化； (3）DNA纯度在1.6—2.0之间，浓度50ng/ul以上。 5．为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？ 如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰，这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。大多所谓的PCR“纯化试剂盒”实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。 6．如何进行PCR产物纯化？ PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将特异扩增的条带切割下，然后纯化。使用凝胶回收试剂盒回收，产物用ddH2O溶解。 7．PCR产物直接测序的好处？ （1) PCR产物直接测序可以反映模板的真实情况； （2) 省去克隆的实验费用和时间； （3) PCR产物测序正确的片段进行下一步克隆实验使结果更有保障； （4) 混合模板进行PCR的产物直接测序可以发现其中的点突变。 8．对用于测序的质粒DNA的要求有哪些？ 对测序模板DNA的一般要求：（1)DNA纯度要求高，1.6—2.0之间，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等；（2)溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行。 9．如何鉴定质粒DNA浓度和纯度？ 我们使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入0.5ug/ml的EB(电泳缓冲液中不必加E，加一个已知浓度的标准样品。电泳结束以后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等，也可以鉴别抽提的质粒DNA 的不同构型。 质粒DNA的3种构型是指在抽提质粒DNA过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合环状结构的质粒(SC)的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果两条链发生断裂，就变成为线状(L)分子。这3种分子有不同的迁移率，通常，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢为开环状(OC)分子。使用紫外分光光度计检测，或者用溴乙锭-标准浓度DNA比较法只能检测抽提到的产物中的浓度，甚至由于抽提的质粒DNA中含有RNA、蛋白质、染色体DNA等因素的干扰，浓度检测的数值也是没有多少意义的。
国家癌症中心全国癌症报告定稿版
国家癌症中心全国癌症 报告 HUA system office room 【HUA16H-TTMS2A-HUAS8Q8-HUAH1688】
全国肿瘤登记中心负责全国肿瘤登记数据收集、质量控制、汇总、分析及发布工作。2018年2月，国家癌症中心发布了最新一期的全国癌症统计数据。由于全国肿瘤登记中心的数据一般滞后3年，本次报告发布数据为全国肿瘤登记中心收集汇总全国肿瘤登记处2014年登记资料。 报告主要发现 2014年全国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例（男性211.4万例，女性169.0万万例），平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7个人被确诊为癌症。 肿瘤发病率为278.07/10万（男性为301.67/10万，女性为253.29/10万），中标率（中标率：人口标准化率按照2000年中国标准人口结构）为190.63/10万，世标率（世标率：人口标准化率按照Segi's世界标准人口结构）为186.53/10万。0-74岁累积发病率为21.58%。 胂瘤死亡率为167.89/10万，中标率为106.98/10万，世标率为106.09/10万。0-74岁累积死亡率为12.00%。 恶性肿瘤发病率由高到低依次为东部、中部、西部。调整人口结构后地区间发病率的差异缩小，但趋势并未改变。各地区中男性发病率均高于女性。 按发病例数排位，肺癌位居全国发病首位，每年发病约78.1万，其后依次为胃癌、结直肠癌、肝癌和乳腺癌。肺癌和乳腺癌分别位居男女性发病的第1位。 恶性肿瘤死亡率由高到低依次为东部、中部、西部，调整人口结构后，中部地区死亡率高于东、西部地区。各地区肿瘤年龄别死亡率趋势相似，主要恶性肿瘤死因大致相同，肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌在各地区均为主要恶性肿瘤死因。 报告数据来源和质量控制 截至2017年8月30日，全国肿瘤登记中心共收集到全国31个省、自治区、直辖市的449个登记处提交的2014年肿瘤登记资料，其中县级以上城市160个，县及县级市289个。根据质量控制标准纳入339个登记处，其中东部地区140个，中部地地区112
CHIP SEQ分析常见问题集锦
ChIP-Seq分析常见问题集锦 染色质免疫共沉淀测序（ChIP-Seq）是指对染色质免疫共沉淀（ChIP）获得的DNA片段进行大规模测序，并能把所研究蛋白的DNA结合位点精确定位到基因组上。 Roche GS FLX Titanium、Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID4这3种测序技术均可以用于ChIP-seq，其中采用Illumina Solexa GA IIx进行ChIP-Seq已有较多文献报道。 ChIP-Seq技术高质量、高通量、低成本的数据产出，为表观遗传组学研究奠定了技术基础。研究者可以在以下几方面展开研究：（1）判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；（2）检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位；（3）研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系；（4）CTCF转录因子研究。 ChIP-Seq有什么样品要求？ 答：（1）请提供浓度≥10ng/ul、总量≥200ng、OD260/280为1.8~2.2的DNA样品；若单次ChIP后DNA量不够，建议将2~3次ChIP的DNA合并在一起。 （2）请提供DNA打断时检测胶图，要求打断后DNA电泳主带在200-500bp范围内；请对于ChIP 获得DNA设计引物进行QPCR验证和定量，能够提供检测位点的检测报告。附阳性和阴性对照。（3）样品请置于1.5ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm 封口。在运输前将所有样品管固定于50ml带盖离心管中，再将50ml管放在封口袋中。 ChIP-Seq相比ChIP-chip有哪些优势？ 答：第一，ChIP-Seq能实现真正的全基因组分析。目前所能获得的芯片上固定的探针只能代表全基因组部分序列，所获得的杂交信息具有偏向性；第二，对于结合位点分析，ChIP-Seq 通过寻找“峰”，结合分辨率可精确到10~30bp，而芯片上探针由于长度所限，无法精确定位，即使目前最高水平的商业芯片都无法提供可与ChIP-Seq媲美的分辨率；第三是所需样本数量。ChIP-chip需要多达4~5μg的起始样本，在杂交之前需要进行LM-PCR，但可能导致背景增高，竞争性扩增等导致假阳性。而ChIP-Seq仅需要纳克级起始材料，如SOLiD起始材料可低至20ng。两者技术特点如下： 研究方法CHIP-on-chip CHIP-Seq 分辨率30~100bp1bp 覆盖范围受芯片容量限制，只能选择性地扫 描特定区域，无法覆盖全基因组只要测定的序列（Reads）能够定位到基因组上，就能获得全部基因组信息 缺陷探针和非特异性区域杂交测序数据会有一些GC含量偏向 性价比只能研究在基因组上广泛存在的目 的位点（Broading bingding）可以扫描全基因组；可以研究在基因组上存在的稀有目的位点（Sharp bingding） 需要的DNA 量 高低（10~50bp）动态量程弱信号会被遗弃；强信号会饱和没有局限 选择数据产 出量 不可以可以
国家癌症中心：2018年全国最新癌症报告
全国肿瘤登记中心负责全国肿瘤登记数据收集、质量控制、汇总、分析及发布工作。2018年2月，国家癌症中心发布了最新一期的全国癌症统计数据。由于全国肿瘤登记中心的数据一般滞后3年，本次报告发布数据为全国肿瘤登记中心收集汇总全国肿瘤登记处2014年登记资料。 报告主要发现 2014年全国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例（男性211.4万例，女性169.0万万例），平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7个人被确诊为癌症。 肿瘤发病率为278.07/10万（男性为301.67/10万，女性为253.29/10万），中标率（中标率：人口标准化率按照2000年中国标准人口结构）为190.63/10万，世标率（世标率：人口标准化率按照Segi's世界标准人口结构）为186.53/10万。0-74岁累积发病率为21.58%。 胂瘤死亡率为167.89/10万，中标率为106.98/10万，世标率为106.09/10万。0-74岁累积死亡率为12.00%。 恶性肿瘤发病率由高到低依次为东部、中部、西部。调整人口结构后地区间发病率的差异缩小，但趋势并未改变。各地区中男性发病率均高于女性。 按发病例数排位，肺癌位居全国发病首位，每年发病约78.1万，其后依次为胃癌、结直肠癌、肝癌和乳腺癌。肺癌和乳腺癌分别位居男女性发病的第1位。
恶性肿瘤死亡率由高到低依次为东部、中部、西部，调整人口结构后，中部地区死亡率高于东、西部地区。各地区肿瘤年龄别死亡率趋势相似，主要恶性肿瘤死因大致相同，肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌在各地区均为主要恶性肿瘤死因。 报告数据来源和质量控制 截至2017年8月30日，全国肿瘤登记中心共收集到全国31个省、自治区、直辖市的449个登记处提交的2014年肿瘤登记资料，其中县级以上城市160个，县及县级市289个。根据质量控制标准纳入339个登记处，其中东部地区140个，中部地地区112个，西部地区87个。覆盖人口共288243347人（包括男性146203891人，女性142039456人），占全国2014年年未人口数的21.07%,其中东部地区164062330人，中部地区81477272人，西部地区42703745人。 恶性肿瘤发病总体情况 据估计，2014年全国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例（男性211.4万例，女性169.0万万例），平均每分钟有7个人被确诊为癌症。 肿瘤发病率为278.07/10万（男性为301.67/10万，女性为253.29/10万），中标率（中标率：人口标准化率按照2000年中国标准人口结构）为190.63/10万，世标率（世标率：人口标准化率按照Segi's世界标准人口结构）为186.53/10万。0-74岁累积发病率为21.58%。胂瘤死亡率为167.89/10万，中标率为106.98/10万，世标率为106.09/10万。0-74岁累积死亡率为12.00%。
基因测序(PCR常见问题)
基因测序（PCR常见问题）生物专业很实用 PCR常见问题 PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无 原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间 问题2：非特异性扩增 现象：条带与预计的大小不一致或者非 特异性扩增带
原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 4.Mg2+浓度偏高 5.退火温度偏低 6.循环次数过多 对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数 问题3：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 原因： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多 对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数 问题4：假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因： 靶序列或扩增产物 的交*污染 对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）
2015年中国癌症统计数据
02015年中国癌症统计数据 中国医学科学院肿瘤医院、国家癌症中心赫捷院士、全国肿瘤登记中心主任陈万青教授等，在影响因子的《CA：A Cancer Journal for Clinjicians》杂志上发表了2015年中国癌症统计数据。 能在影响因子最高的期刊上发表文章，足以让大家顶礼膜拜！我们都来学习一下这项国人癌症统计数据研究吧。 该研究分析结果提示，2015年中国预计有万例新发肿瘤病例和万例死亡病例。肺癌是发病率最高的肿瘤，也是癌症死因之首。胃癌、食管癌和肝癌是紧随其后的我国发病率和死亡率较高的常见肿瘤。 文章指出，在中国，癌症已成为疾病死因之首，发病率和死亡率还在攀升，癌症已成为非常重要的公共健康问题。该研究报告了我国最新的癌症发病率、死亡率和生存分析数据，不同地区几种常见肿瘤的最新发病和死亡情况，常见肿瘤的发病趋势以及防控重点等。 中国人口有亿之巨，过去关于国人癌症发病率和死亡率的统计报告，多基于上世纪九十年代起的小样本数据，或局限于某特定年份的统计。全国肿瘤登记中心（NCCR）成立于2002年，2008年全国癌症登记项目启动后，全国以人群为基础的登记点从2008年的54处增加到2014年的308处（覆盖3亿人口）。 本文报告的高质量的数据来自中国肿瘤登记中心数据库72个登记点最新（2009~2011年）数据，覆盖代表我国%的总人口数。 图A显示有2000~2011年数据的22个数据点，图B显示2009~2011年数据的72个数据点 分析显示，预计2015年有新发浸润性癌病例数万，相当于平均每天新发12000例癌症，有万癌症死亡病例，相当于平均每天7500人死于癌症。
DNA测序结果中常见的几个问题
D N A测序结果中常见 的几个问题 公司内部档案编码：[OPPTR-OPPT28-OPPTL98-OPPNN08]
1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别 这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。 2 、为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂 由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。 3 、测序结果怎么找不到我的引物序列 如果找不到测序所用的引物序列。这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。 4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点 可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。 5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事
首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。 6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)是否会影响测序结果 序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。 7 、测序结果为什么与标准序列有差别 原因可能有：样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。当然尽管我们有时做了最大努力，但还是保证不了和文献序列完全一致，但我们测序报告是客户样品序列的真实结果。 8 、 PCR 产物测序与克隆后测序序列为什么有差别 PCR 产物克隆到载体中进行测序，有两个方面可能序列有变化：首先，PCR 扩增过程中可能产生错配。将片段克隆到载体中也有可能发生突变；其次，测序的准确率并非100%。 9 、有杂合位点，但你们的报告上看不到杂合的信号！ 如果在您认为应该出现杂合信号的位置上只出现单一的信号，那么可能是您样品突变的模板与正常的模板的比例没达到可以测出的浓度。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所占的比例很低，仪器会自动将它作为背景信号了，很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体
肿瘤研究所简介
南方医科大学肿瘤研究所简介 南方医科大学肿瘤研究所最早于1999年7月由第一军医大学基础部病理教研室提出成立"第一军医大学肿瘤研究所"，研究所挂靠病理学教研室，实行"室、所合一"的运转方式。2004年第一军医大学整体移交广东省后更名为"南方医科大学肿瘤研究所"。2006年7月，肿瘤研究所与病理学教研室剥离，并挂靠南方医院，独立运转。2007年9月，肿瘤研究所回归大学，挂靠在基础医学院，由学校下拨1000万重点学科建设经费，在生命科学大楼3楼长臂端建设肿瘤研究所的实验和办公场地。2008年4月，肿瘤研究所正式开始运行。2008年9月，肿瘤研究所也正式加入肿瘤学科，开始招收肿瘤学硕士和博士研究生。 肿瘤研究所建设现状： 1.实验室建设和设备购置 在学校和学院领导的直接关心下，肿瘤研究所迅速完成了实验室的设计和规划，并在学校基建处和设备处的帮助下，于08年4月底完成了实验场地的装修、实验室家具的添置及部分仪器设备的安放。同月，肿瘤研究所开始独立运转。到目前为止，肿瘤研究所已完成了学校重点学科建设经费全部1000万和省211工程一部分经费（150万左右）仪器设备的投资，引进了Clin Prot，流式细胞分选仪以及小动物整体成像系统等一大批仪器。目前实验室配置相对完善，可以基
本上完成肿瘤学方面的实验。 2.实验室人员配置 肿瘤研究所现有14名在职职工，其中高级职称9人，正高级5人，副高级4人，中级2人，实验员3人。博士生导师3人，硕士生导师4人。现任肿瘤所所长为中科院院士姚开泰教授。3.承担课题及发表论文研究所从成立以来，共承担课题18项，其中11项目前在研，包括了国家863、973分题各1项，国家重点基金1项以及国家面上基金多项，在研经费为753万元。共发表SCI 收录论文18篇。 研究所所长：姚开泰 职务：教授、博士生导师、中国科学院院士 研究所地址：南方医科大学生命科学楼3楼
中国2019最新癌症统计数据出炉
中国２019最新癌症统计数据出炉！ 2019年1月，国家癌症中心发布了最新一期得全国癌症统计数据。报告显示，2015年全国恶性肿瘤发病约392、9万人,较20１４年得38０、4万增加1２、5万,增长率为３、2%；这意味着,平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7、5人被确诊为癌症。 发病率最高:肺癌 从发病人数瞧,肺癌仍位居我国恶性肿瘤发病首位，发病人数为78、4万。第二至第十分别为胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、甲状腺癌、子宫颈癌、脑癌、胰腺癌。前10位恶性肿瘤发病约占全部恶性肿瘤发病得７６、70%.
前十位癌症发病人数（万） 其中，男性发病首位为肺癌，每年新发病例约52、0万,其她高发恶性肿瘤依次为胃癌、肝癌、结直肠癌与食管癌等,前10位恶性肿瘤发病约占男性全部恶性肿瘤发病得８2、2０％. 女性发病首位为乳腺癌，每年发病约为3０、４万,其她主要高发恶性肿瘤依次为肺癌、结直肠癌、甲状腺癌与胃癌等,女性前10位恶性肿瘤发病约占女性全部恶性肿瘤发病得７９、10％。 40岁以上发病率快速上升 癌症发病随年龄增加而上升,40岁以下青年人群中，癌症发病率处于较低水平；从40岁开始快速升高,发病人数分布主要集中在60岁以上，到80岁达到高峰。
2015年中国恶性肿瘤年龄别死亡情况估计 女性乳腺癌发病从３0岁左右开始上升，男性前列腺癌发病则从60岁左右才开始上升。因此，应针对不同癌症发病年龄特点，采取有针对性得防控措施。 生存率与欧美国家仍存在较大差距 在过去得十余年里，我国癌症生存率呈逐渐上升趋势，目前癌症5年相对生存率约为40、5%，与十年前相比，提高了约10个百分点,但与欧美发达国家相比还有很大差距。 主要原因就是，我国癌谱与发达国家存在差异。我国高发癌就是预后较差得肝癌、胃癌与食管癌等消化系统肿瘤,欧美发达国家则就是甲状腺癌、乳腺癌与前列腺癌等预后较好得肿瘤高发。 同时,我们也应瞧到，我国预后较好肿瘤得5年生存率,比如乳腺癌（８2%)、甲状腺癌(84、3％）与前列腺癌(66、４%),仍与欧美发达国家存在差距，美国得数字依次为90、9％、９8％与99、５%。 差距得根源在于，我国癌症患者早诊早治率低、晚期病例临床诊治不规范.因此，扩大癌症筛查覆盖面、促进肿瘤诊治规范化，就是我国亟需发力解决得两个问题。 随着我国人口老龄化逐渐加剧、工业化与城镇化进程得不断加快,以及慢性感染、不健康生活方式等危险因素得累加，癌症防控形势比较严峻。
美国约翰霍普金斯癌症研究中心
美国约翰霍普金斯癌症研究中心的科学家们创造了一个可以测量主要由干细胞分化过程中发生的随机变异所导致的不同组织类型中癌症发生比例的统计模型。根据他们的测量，2/3的不同组织成年癌症发病主要是因“运气不佳”所导致，也就是随机变异发生在那些能够驱动癌症生长的基因里，而剩余1/3则是因环境因素和遗传基因所导致的。 研究发现得不得癌症全靠运气 “所有的癌症都是噩运、环境和遗传的结合所导致的，而我们创造了一个或可以量化这三种因素导致癌症发展的比例的模型，” 约翰霍普金斯大学医学院克莱顿肿瘤学教授、约翰霍普金斯大学路德维格中心联合主任、霍华德休斯医学研究所调查员波特·福格斯坦(Bert Vogelstein)这样说道。 “那些接触容易致癌的药剂，例如烟草的人们却没有任何癌症的长寿往往被归结于他们的…好基因?，但事实是他们大多数只是运气比较好，”福格斯坦补充说道。他警告称较差的生活方式加上运气欠佳可能会导致癌症的发展。 他们模型所蕴含的启示意义包括改变公众对癌症风险因素的感知，以及对癌症研究的资金资助。“如果整个组织的癌症发生中有2/3是因为干细胞分化过程中随机DNA变异所导致，那么改变我们的生活习惯以及生活方式或可能极大的帮助预防某些癌症，但对其它的效应可能就非常有限。”约翰霍普金斯大学医学院和彭博公共卫生学院肿瘤学助理教授、生物数学
家克里斯蒂安·托马赛蒂(Cristian Tomasetti)博士这样说道。“我们应该将更多资源关注于寻找在早期可治疗阶段检测癌症的方式。” 在发表在1月2日的期刊《科学》上的这篇文章里，托马赛蒂和福格斯坦表示他们查阅了科学文献寻找31个组织类型在一个平均个体生命过程中干细胞分化的累计总数目的信息。干细胞“自我更新”，然后在那些细胞死去的特定器官里重新补充新细胞。 当组织-特定干细胞发生随机错误或者变异时，也就是细胞分化的复制过程中DNA的一个化学字母被另一个替换，就会产生癌症。变异积累的越多，细胞生长不受控制的风险越高，后者是发展癌症的一个里程碑。而相比遗传和环境因素所导致的癌症，这种随机变异所导致的癌症在此之前仍是未知，福格斯坦说道。 为了查明这种随机变异在癌症风险中所起的作用，约翰霍普金斯大学的科学家们绘制了31个组织里干细胞分化的数量，并将这些速率与美国人中相同组织癌症生命风险进行对比。通过所谓的数据散点图，托马赛蒂和福格斯坦确定了全部数量的干细胞分化和癌症风险之间的相关性为0.804。从数学角度说，这一数值越接近1，干细胞分化与癌症风险的相关性越高。 “我们的研究显示，一般来说，一种组织类型里干细胞分化数量的改变与同一组织里癌症发生的改变是高度相关的。” 福格斯坦解释道。其中一个例子便是结肠组织，它所进行的干细胞分化是人体小肠组织的4倍。同样的，结肠癌比小肠癌要更加普遍。 “你可以辩解认为结肠比小肠暴露的环境因素要更多，这会增加已知变异的潜在速率。”托马赛蒂说道。然而科学家在老鼠结肠里的发现却恰恰相反，老鼠结肠里干细胞分化的数量要比小肠内的更少。研究人员表示这支持了全部数量的干细胞分化在癌症发展中所起的关键作用。利用统计学理论，科研人员计算出癌症风险中有多少变异量是因干细胞分化数量所导致的，这一结果大约为0.804的平方，或者用百分比的形式表示大约为65%。 最终，研究人员将他们研究的癌症类型分为两组。他们统计计算了哪些癌症类型的发生可以通过干细胞分化数量来预测，以及哪些癌症类型具有较高的发生率。他们发现22种癌症类型可以通过细胞分化过程中随机DNA变异的“运气不佳”因素来解释。而另外9种癌症类型的发生率高于“运气不佳”所能预测的，因此可能是“运气不佳”结合环境或者遗传因素所致。 “我们发现那些无法仅仅用干细胞分化数量来预测的癌症类型基本都是我们可以预料到的癌症类型，例如肺癌，它主要与吸烟有关；皮肤癌，它主要与暴晒在阳光下有关；以及与遗传症状有关的癌症类型。”福格斯坦解释道。
测序过程常见问题分析与解答
测序过程常见问题分析与解答 1、DNA测序样品用什么溶液溶解比较好？ 答：溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。如果DNA用缓冲液溶解后，在进行了测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。 2、提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？ 答：我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。如果您要以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“测序模板的要求”部分的说明。 3、提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？ 答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。这样既误时间，又浪费客户的样品。一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。而甘油保存菌则容易污染。制作穿刺菌时，可在1.5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基（固体）中，37℃培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。 4、与测序引物有关的问题
测序常见问题分析实例
测序常见问题分析实例 峰型整齐，在某一点前后突然变乱 信号迅速衰减 信号极弱或无信号 整条序列信号杂乱 峰型整齐，在某一点前后突然变乱： 图1 PolyT特殊结构 上图是我们的一个质粒测序样品，用T7通用引物进行测序，从图中可以看出，在约285bp 的polyT结构后，序列明显变乱。主要原因是在polyT结构后，测序酶容易在模板上滑动，导致polyT结构后的峰型变得杂乱。此类样品通过对其反向互补序列进行测序，一般可以得到好的结果。 图2 移码突变双模板的存在 上图是我们的一个质粒测序样品，用M13+通用引物进行测序，从图中可以看出，该序列在290bp后序列明显有两套峰存在。造成该现象的原因可能有如下几条： 序列发生缺失突变
插入外援片段的载体和未插入外援片段的载体同时存在 PCR产物用T载体进行克隆时，PCR片段可以以两个方向克隆进T载体 所挑克隆不纯 两个大小相近的PCR产物同时存在，无法纯化分开 解决的办法： 对于质粒模板，重新挑选克隆，或从另一段进行测序 对于PCR模板，用另一端引物进行测序，或克隆后进行测序 图3 等位基因双模板的存在 上图是针对一个质粒进行的测序结果，从图中可以明显看出，在序列的80bp到120bp之间有两套峰存在，但是没有发生移码突变。该情况与图2所举的例子有所不同，该情况下从反向进行测序仍然不可能得到好的测序结果。该种情况下只能采取克隆的方法将两套模板分开，分别进行测序。 信号迅速衰减返回 图4 CTT重复结构 如上图，在大约260碱基后出现了一个严重的CTT重复结构，导致信号迅速衰减，很难得到跨过该区后的信息。该种情况下，只能从另一端进行测序，一般来说，AAG重复结构不会太影响测序。也可以对片段进行亚克隆，使每个片段大小不大于200bp，然后再进行测序。不过，该方法要麻烦很多。
DNA测序常见问题解析
DNA测序常见问题解析 一．引物问题 Q：为什么我在测序报告上找不到我的引物序列？ A：这里分以下几种情况： 1. PCR引物作为测序引物进行测序时，所测序列是从引物3'末端后第一个碱基开始的，而且刚刚开始的碱基由于在毛细管电泳中不能很好地分离而导致准确性下降，所以找不到您的引物序列。 （1）对于较短的PCR产物（<600 bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。 （2）对于较长的序列，一个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中，用载体上的通用引物进行测序。由于载体上的通用引物与您的插入序列之间还有一段距离，因此就可以得到您的完整的引物序列。（3）由于在测序的起始端总会有一些碱基无法准确读出，因此，您如果想得到您的PCR产物的完整序列，最好克隆后进行测序。 2. 有时质粒做模板进行测序时，由于某些原因，质粒上没有插入外源片段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时也找不到引物序列。 3. 找不到克隆片段的扩增引物。发生这种情况原因有2个： （1）您在构建质粒时采用的工具酶的酶切位点距离您的测序引物太近，由于荧光染料的干扰在序列开始的部分会不十分准确。比如pBluescript Ⅱ KS这个质粒如果采用Sac I做工具酶，采用T7引物测序： 那么从T7引物末端到Sac I的酶切位点只有6个bp，这样酶切位点后的扩增引物序列在测序报告上很可能不完整。 解决的办法是采用M13 Forward引物来测序，这样可以保证Sac I的位点和之后的引物序列都可以完整的出现在报告中。 （2）您的插入片段的插入方向是反的，这时您不妨找一下您引物的反向互补序列。或者您插入的片段可能不是您的目的片段，而是由于非特异性扩增出来的片段，还有可能您送过来的样品被污染。 Q：测序发现引物有突变或缺失是什么原因？ A：测序发现引物区有突变，主要考虑三个方面的原因：测序，PCR/克隆过程，引物本身。 1. 测序引入的错误 对于PCR产物进行的克隆而言，无论是TA克隆或酶切克隆，引物区往往位于载体两端，如果用载体引物进行测序，此时克隆引物区离测序引物区的距离比较近，处于测序起始阶段或正好处于测序染料峰所在的区域内（90-120 bp），这两个区域也是最容易产生测序错误的地方。因此，首先要看原始的测序峰图在引物区内是否清晰，碱基的错误或缺失是否是由于峰图不清楚而导致的计算机误读。 2. PCR/克隆过程