第二代和第三代慢病毒包装系统
腺病毒包装系统是什么？腺病毒包装系统详细介绍
腺病毒包装系统是什么？腺病毒包装系统详细介绍目前根据需要已经开发三代腺病毒载体：E1区或者E1&E3缺失的载体被称作第一代腺病毒载体；E2区或者E2&E4缺失的载体被称作第二代腺病毒载体；依赖于辅助病毒的腺病毒载体（Helper-Dependent Ad，HD-Ad）通常也称作无偿腺病毒或者高容量载体被划分为第三代腺病毒载体。
经典的双质粒共转染法（同源重组）原理是同源重组。
在腺病毒左臂区域（通常缺失E1基因区）插入目的基因表达盒构成腺病毒穿梭质粒，与带有腺病毒全基因组（通常缺失E1基因区）的大质粒共同转染携带E1基因区的细胞如293细胞，两种质粒在293细胞内通过同源重组形成重组腺病毒基因组，并包装成病毒颗粒。
主要缺点是重组效率比较低。
AdEasyTM包装系统AdEasyTM包装系统主要的特点是利用Cre/loxP系统在大肠杆菌中完成外源基因插入腺病毒基因组的过程，获得环状的重组腺病毒基因组，并且具有在细菌中复制的必需元件。
将重组腺病毒基因组酶切线性化后转染293细胞，避免了双质粒共转染得到重组腺病毒。
由于获得重组腺病毒质粒有明显的筛选方法，操作步骤也比较好掌握，因此这个系统一出现就受到极大的欢迎。
使用这个系统需要注意以下问题：要用能表达RecA重组酶的特定的大肠杆菌，建议建立菌种库以免细菌发生变化；由于重组是在细菌中发生的，微小的基因组变化不易发现；要获得高品质的重组腺病毒毒种（高病毒产量、高目的基因表达）应挑选多个重组腺病毒质粒，分别转染293细胞，获得多个重组病毒来筛选。
AdMax包装系统AdMax包装系统是通过Cre/loxP获得重组病毒，这个过程发生在293细胞中，从而避免在细菌中重组。
将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染293细胞，利用Cre/loxP系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。
这个系统有多种优势，包括操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高（一般大于104vp/cell）、目的基因的表达水平高（因为mCMV启动子比hCMV 启动子强若干倍）等。
慢病毒(过表达)包装步骤
慢病毒（过表达）包装步骤秦超1.转染复苏293T细胞,传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。
转染步骤：（以10cm培养皿为例）⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%—90%，保证细胞处于良好的状态,转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。
⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti—mem，混匀⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti—mem，混匀，室温静置5min⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。
2.收毒(36—48h)收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可.⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min,以沉淀细胞碎片。
⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管(用蛋白质浓缩管即可）中。
4000rpm离心至所需体积。
⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液,按每次的接毒量分装，-80℃冻存。
由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。
3.接毒接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40％—50%，务必使用生长状态良好的细胞。
将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml细胞密度60%—70%时可以再接毒一次。
4.检测及培养细胞系（48h)如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。
如需培养成细胞系,可继续培养。
如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。
慢病毒包装原理-介绍【范本模板】
慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV—1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体.区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短,体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制.采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略,不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ,在长期稳定表达载体的细胞中,甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的,这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。
当RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1～4 个U 。
U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构( stem loop ）。
在 siRNA 表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNA（small hairpin RNA， shRNA），载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ~ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 ’突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA 。
第三代慢病毒高效率包装系统的建立
崔奎青
陆凤花
石德顺 ”
广 西 大 学动 物 繁 殖 研 究 所 ， 宁， ３ ０ ５ 南 ５ ０ ０
摘 要 慢病 毒介 导法 是最 有前 途 的转基 因动 物生产 方法 之一 ， 滴度慢 病 毒颗粒 的包装 是慢 病毒 转基 因 高 动物 技术 的关键 。 本研 究应用 含有增 强 型绿色 荧光蛋 白基 因（ＧＦ ） ｅ Ｐ 的第 ３代慢 病毒载 体系 统 ， 用脂 质体转 染 法将 慢病 毒系统 ４质 粒共转 染 ２３ ９Ｔ包 装细胞 ， 培养 ４～ ２ｈ收集 病毒 上清液 ， ８ ７ 通过超 速 离心进 行浓 缩 ， 用 采
ｉｇｅｈ ｎ ｅ ｅｎｆ ｏｅｃｎ ｒｔ ｎｇｎ （Ｇ Ｐ ， ｓ ｇｔｅ ｉｏｅｔ ｎ ０ ０ｍｅ ｉ ｅ ａ ｓ ｃ ｏ ｔｏ ． ｎ ａ ｃｄ ｒｅ ｕ ｒｓｅ ｔ ｏｅ ｅ ｅ ｅ Ｆ ）ｕ ｉ ｐ ｆ ａ ｅ ０ ｄａ ｄｔ ｎｆ ｔ ｎｍｅ ｄ ｎ ｇ ｌ ｐ ｉ ｎ ｈＬ ｃ ｍｉ ２ ｔ ｒ ｅｉ ｈ
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第二代和第三代慢病毒包装系统定稿版
第二代和第三代慢病毒包装系统精编W O R D版IBM system office room 【A0816H-A0912AAAHH-GX8Q8-GNTHHJ8】第二代和第三代慢病毒包装系统将HIV-1 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。
载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由 HIV-1 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的 HIV-1顺式作用序列。
同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
第一代包装系统中，除vpu之外的辅助基因都被保留下来，Env包膜蛋白由VSV-G蛋白代替，应用 VSV-G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性。
3质粒系统，包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。
其中包装质粒在 CMV 启动子的控制下，表达 HIV 21 复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白 (VSV 2G)，应用 VSV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留 350 bp 的 gag 和 RRE，并在其中插入目的基因或标志基因( 绿色荧光蛋白 GFP) 。
在第二代系统中辅助基因vif、vpr、nef被进一步剔除，这些辅助基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。
第二代系统中5’LTR 634bp，3' LTR 634bp，5’LTR前不需要强启动子。
4质粒系统。
第三代系统中，tat调节基因也被剔除，对5’LTR进行了改造，换上了异源启动子，从而不需依赖tat基因（Tat 基因编码蛋白可与LTR结合，增加病毒所有基因转录率）；构建自身失活的慢病毒载体（SIN），即删除了U3区的3’LTR, 使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；一些增强包装病毒滴度的元件被加入，如cPPT、WPRE。
慢病毒包装技术和应用
慢病毒包装技术和应用慢病毒载体（lentivirus vector，LV）是实验室常用的病毒包装载体，在基因转染方面具有很多特有的优势，可以转染分裂期和非分裂期的细胞，基因转染效率高，可以导入较大基因片段等。
目前被广泛用于RNAi的研究，为基因功能研究和特定基因表达调节提供了可能性。
另外，慢病毒包装在临床中可作为基因治疗载体发挥重要作用。
慢病毒载体慢病毒属于反转录病毒的一种。
慢病毒载体是在人类免疫缺陷型病毒（HIV-1）基础上构建的载体。
HIV-1包含3个结构基因gag、env和pol，2个调控基因rev、tat，以及4个辅助基因vif、vpr、vpu和nef。
图1. HIV-1的基因结构。
为了提高生物安全性，慢病毒载体的建立经历了四个阶段：1、第一代质粒系统。
去除HIV基因组中的反式作用蛋白基因序列，包装上含有目标基因的重组载体和能为反式提供病毒颗粒所需蛋白的包装质粒，共转染包装细胞。
2、第二代的三质粒系统。
将HIV基因组中的顺式作用序列结构和编码反式作用蛋白的序列去除，分别克隆到独立的质粒中。
三个质粒包括包装质粒（含有CMV启动子）、包膜质粒（含有VSV-G基因，替代env基因，可提高宿主范围）和载体质粒（含有目标基因）。
图2. 第二代慢病毒质粒。
3、第三代三质粒系统。
为了提高安全系数，在第二代的基础上去除了HIV所有辅助基因序列，只保留了gag、pol和rev基因。
4、第四代四质粒系统。
在第三代质粒的基础上，将env基因独立克隆到一个质粒上，另外，除去tat基因。
四个质粒包括pGag/Pol，pRev，pVSV-G，和包含目的基因的载体。
图3. 第三代和第四代慢病毒质粒。
其他病毒载体除了慢病毒载体，常见的，还有腺病毒，腺相关病毒（AAV）等。
腺病毒载体是瞬时表达的首选载体，基因转染效率高，安全性高，缺点是不能整合到宿主细胞基因组，包装周期长，约6-8周。
腺相关病毒安全性高、免疫原性低、具有明显组织嗜性等特点，因此非常适合临床基因治疗，缺点是包装周期较长，约6-8周。
慢病毒包装
慢病毒包装慢病毒是逆转录病毒的一种，它需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。
它包括人免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒等。
其中研究最多的是HIV-1慢病毒。
慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，所需的目的基因取代部分基因构建而成。
目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。
与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。
慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。
在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。
随着人们对慢病毒载体的深入研究，为了提高慢病毒在临床上使用的安全性，慢病毒载体的优化也在不断的探讨中。
慢病毒载体的发展经历了三个阶段，第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表，在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转录和整合所需的顺式作用原件与编码反式作用蛋白的序列分离，分别构建在三个质粒表达系统上，即包装质粒、包膜质粒和载体质粒。
包装质粒在巨细胞病毒启动子的作用下，控制除env以外所有病毒结构基因的表达；包膜质粒编码水泡口炎病毒G糖蛋白；载体质粒中含有目的基因。
用这三种质粒共转染包装细胞如人胚胎肾293T细胞，在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无复制能力的慢病毒颗粒。
第一代慢病毒载体系统的特点是在构建三种包装质粒时，为了降低产生有复制能力的病毒的可能性，尽可能减少三种质粒之间的同源序列，但包装质粒中仍然保留HIV的附属基因。
第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进，在包装质粒中删除了HIV的所有附属基因。
这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。
第三代慢病毒载体系统又增加了两个安全特性：一是构建自身失活的慢病毒载体，即删除了U3区的3′LTR, 使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；二是去除了tat基因，用异源启动子序列代替，这样原始的HIV基因组中的9个慢病毒载体中只保留了3个。
第三代慢病毒高效率包装系统的建立
基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第2期，第326－330页Genomics and Applied Biology,2009,Vol.28,No.2,326－330实验技术与方法Techniques and Methodology第三代慢病毒高效率包装系统的建立张磊*刘庆友*胡天张晓溪崔奎青陆凤花石德顺**广西大学动物繁殖研究所,南宁,530005*同等贡献作者**通讯作者,ardsshi@摘要慢病毒介导法是最有前途的转基因动物生产方法之一，高滴度慢病毒颗粒的包装是慢病毒转基因动物技术的关键。
本研究应用含有增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)的第3代慢病毒载体系统，用脂质体转染法将慢病毒系统4质粒共转染293T 包装细胞，培养48~72h 收集病毒上清液，通过超速离心进行浓缩，采用批量快速测定法(LaSRT)测定病毒滴度。
结果显示，用脂质体转染法包装的慢病毒能成功地感染293T 细胞，经检测病毒滴度达到5×108IU/mL 以上，初步建成了高滴度慢病毒包装平台，为慢病毒介导制作转基因动物奠定了良好的研究基础。
关键词慢病毒,病毒包装,转基因动物The Construction of High-efficiency Packaging System of the 3rd LentivirusZhang Lei *Liu Qingyou *Hu Tian Zhang Xiaoxi Cui Kuiqing Lu FenghuaShi Deshun **Animal Reproduction Institute,Guangxi University,Nanning,530005*The authors who contribute equally **Corresponding author,ardsshi@ DOI ：10.3969/gab.028.000326Abstract Lentivirus-mediated method is one of the most promising methods of producing transgenic animals,high-titer lentiviral particles packaging is the key of lentivirus-mediated transgenic animal technology.In this study,293T cells were co-transfected with four plasmids,which are the 3rd generation of lentiviral vector systems contain-ing enhanced green fluorescent protein gene (eGFP),using the Lipofectamine 2000mediated transfection method.Virus supernate was collected after 48~72hours,and then concentrated by rge-scale real-time titration (LaSRT)was applied to test the titer of virus.The results showed that 293T cells could be successfully in-fected by the virus packaged using Lipofectamine-mediated transfection,as evidenced of that the virus titer reached higher than 5×108IU/mL,indicating that a high-titer lentiviral packaging platform was preliminary estabilished.This result will be beneficial for the further study of producing transgenic animal by lentivirus-mediated method.Keywords Lentivirus,Virus packageing,Transgenic animals /doi/10.3969/gab.028.000326基金项目：本研究由国家863计划(2007AA100505),广西青年科学基金(桂科青0991002)和广西亚热带生物资源保护利用重点实验室开放课题(SB0702)资助慢病毒(lentivirus)属于逆转录病毒科(Retrovi-dae)，为RNA 病毒，包括人免疫缺陷病毒(HIV )和猴免疫缺陷病毒(SIV )等。
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第二代和第三代慢病毒包装系统
将HIV-1 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。
载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由HIV-1 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的 HIV-1顺式作用序列。
同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
第一代包装系统中，除vpu之外的辅助基因都被保留下来，Env包膜蛋白由VSV-G蛋白代替，应用 VSV-G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性。
3质粒系统，包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。
其中包装质粒在 CMV 启动子的控制下，表达 HIV 21 复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白 (VSV 2G)，应用 VSV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留 350 bp 的 gag 和 RRE，并在其中插入目的基因或标志基因 ( 绿色荧光蛋白 GFP) 。
在第二代系统中辅助基因vif、vpr、nef被进一步剔除，这些辅助基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。
第二代系统中5’LTR 634bp，3' LTR 634bp，5’LTR前不需要强启动子。
4质粒系统。
第三代系统中，tat调节基因也被剔除，对5’LTR进行了改造，换上了异源启动子，从而不需依赖tat基因（Tat 基因编码蛋白可与LTR结合，增加病毒所有基因转录率）；构建自身失活的慢病毒载体（SIN），即删除了U3区的3’LTR, 使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；一些增强包装病毒滴度的元件被加入，如cPPT、WPRE。
因此，第三代系统的安全性大大提升，进一步减少重组成复制型病毒(RCV) 的可能性。
5' LTR (truncated) 181bp，3' LTR (ΔU3) 234bp，5’LTR前要有强启动子。
4质粒系统。
VSV-G包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度。
Invitrogen的3个质粒与Didier Trono的第三代系统的3个质粒相同。
第三代慢病毒载体系统由4个质粒构成，分别是：
（1）1个具有目的基因的慢病毒表达质粒。
表达质粒包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
目的基因两侧各有一个LTR（long terminal repeat）序列，LTR序列促使目的基因整合到目的细胞基因组里。
为了提高安全性能，表达质粒的3’LTR缺失了部分序列，使得整合后的病毒基因组失去自我复制能力。
（2）2个包装质粒。
其中一个质粒编码Rev，另外一个质粒编码Gag和Pol。
（3）1个编码包膜蛋白的质粒。
将上述4个质粒共转染细胞。
GAG基因编码约500个氨基酸组成的p55蛋白前体,经蛋白酶裂解形成病毒的核衣壳蛋白(p7)、内膜蛋白(p17)和衣壳蛋白
(p24)。
POL基因编码聚合酶前体蛋白，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H。
REV基因编码Rev蛋白。
表达质粒经转录产生慢病毒基因组mRNA，Rev蛋白与慢病毒基因组mRNA中的RRE结合，将基因组mRNA从细胞核转运到细胞质中。
基因组mRNA与衣壳蛋白、逆转录酶、整合酶、包膜蛋白等组装成假病毒颗粒。
3' LTR (ΔU3)(234bp)包括5' LTR (truncated)（181bp）序列，5' LTR (truncated)在3' LTR (ΔU3)的末端。