液质联用操作规程

1．适用范围

本设备配备ACQUITY UPLC液相色谱仪、TQS MS/MS 质谱仪，适用于食品、药品中各种有机物的定性、定量分析，是一种具有高灵敏度的检测仪器，仪器由主机、计算机和数据处理软件等组成。

2. 职责

2.1操作人员按照本规程操作仪器，认真填写实验使用记录。

2.2保管人员负责对仪器进行定期维护和保养。

2.3科室负责人负责监督检查规程的执行。

3．操作程序

日常操作步骤：

准备UPLC —→设置样品表—→运行样品—→定量—→打印报告。

注：如果一个星期内不运行样品请不要关质谱仪，使其保持真空。

建立新方法和project的操作步骤：

准备UPLC —→建立新的project —→用标准品调谐—→编辑质谱方法—→编辑UPLC方法—→设置样品表—→运行样品—→定量—→打印报告。

3.1开机：

3.1.1 彻底开机顺序（仪器已关闭）

确定MS及其它仪器电源电缆已连接，开氮气发生器、开氩气，小表<0.1mpa。打开计算机电源> 等待windows正常启动>电脑界面右下角网络图标红叉。

打开UPLC自动进样器电源，等到电脑界面右下角网络图标出现感叹号！。

打开UPLC泵电源，等约30s或者是有响声。

打开质谱电源，等待5min，离子源透视镜里面亮。

打开Masslynx软件，masslynx主界面-----左侧instrument----Mass tune---界面菜单栏vacuum---pump 同样界面左侧偏上diagnostics---vacuum---analyser MS1 turbo speed[%]要在5分钟内升到80。至少抽真空4个小时> 查看真空状态主界面mass console---界面左侧xevo tq ms detector加号展开---ms display > 碰撞室真空度>达

到7.x e-5mbar 。

3.1.2 日常开机顺序（仪器未关闭）

开氮气发生器、开氩气，小表<0.1mpa，打开Masslynx软件，进入工作站。

3.2建立项目

点击file下的project wizard ,出现对话框，单击yes 出现对话框，输入

project ,location 为C:\MS DATA ,单击next ,选择create existing project as template,

并以c:\masslynx\default.pro 为模板，单击finish .点击OK。

3.3 准备UPLC系统

准备液相的一般流程：准备流动相> 准备样品> 灌注二元泵> 灌注自动进样器> 建立液相方法> 平衡液相

3.3.1. 准备流动相

用0.22um的膜过滤缓冲液，所有的缓冲液和超纯水都要新配制，超纯水和缓冲液使用不得超过二天，缓冲盐一定要是可挥发的，而且浓度不要大于10mM。

3.3.2.样品要求

所有样品都要用流动相初始梯度比例的溶剂来溶解，并用0.22um的膜过滤。

3.3.3灌注二元泵

在Masslynx 主界面，单击MS Console,进入UPLC交互显示界面，点击左栏Acquity UPLC System> Control > Start Up System ，单击QSM，选择需要用到的流动相位置，如A 和B，选择seal wash，时间设为3分钟。

单击SM，选择Strong Wash 5 cycles , Sample syringe 20

单击Equilibrate to Method，将流速设为0 ,单击Start 开始灌注. 时间大约为9min 左右。

设定流速，平衡液相

在Masslynx主界面，单击Inlet Method 图标，打开液相方法编辑窗口，单击status > ACQUITY Additional Status ，进入液相控制台，单击A 或B或流速的位置，出现流速、比例设定对话框, 设定液相流速与比例，单击对勾，开始平衡液相，如果后面要做调谐，可设定流速0.2ml/min,有机相与水相的比例为50:50。

3.4 准备质谱

3.4.1. 计算化合物单同位素质量数

Masslynx主界面> 单击Tools> Molecular Weight Calculator, 输入化合物的分子式（大写-注意Cl、Br等正确的输入方法）,注意选单同位素Monoiso ,Ion Mode:离子化模式，+ve 正离子，-ve 负离子,单击Calculate。

3.4.2 用Intellistart进行自动调谐

在Masslynx 主界面单击MS Tune图标，打开调谐窗口，

单击Ion Mode> ES+ 或ES- ，单击API Gas 图标打开氮气，单击打开高压选择MS Mode 图标，设定液相流速0.2ml/min, 水：乙腈的比例为50:50。

把标准品调谐液放入质谱仪塑料瓶位置处的A（或B或C）号位(注:浓度在200ppb 左右)

单击Fluidics ,选择Reservoir为A ,Flow State 为LC 模式，点击Purge 图标。Purge 结束后，将Flow State 改为Combine 模式，设定Function 为MS1 scan，Mass为计算出化合物的质量数，span 为5，点击进样，开始进样，直到离子的响应比较稳定。保存调谐文件：File > Save As至已建的项目下。

在Masslynx主界面，选择Ms Console> Xevo TQ MS Detector

选择Intellistart ，选择Sample Tune and Develop Method ，ES+

单击Start 图标，出现Intellistart 自动调谐编辑窗口，选择Switch to Advanced mode ，输入Compound name (化合物名称) ，Molecular Mass/Formula (分子量或分子式) Adduct A+（[ M+H] +，选择Load Existing Sample Tune ,在Sample Tune Name 方框后的“。。。”处调用开始保存的调谐文件，在Develop MRM Method 前的方框打钩，并在方框出输入MRM 方法的文件名，路径为已建的项目下。在Print Report 前方框打钩，Cone Voltage ，Collision Energy 处为默认值，Fluidics 下的Flow Path 选择Combined 模式，Sample Reservoir 和Sample Flow Rate 参数与Fuldics 下Combined 模式下的进样参数保持一致。单击右边的Start 开始自动调谐。调谐成功，会有绿勾出现，查看intellistart 报告

3.4.3 查看intellistart 中自动生成的质谱方法：

从MassLynx 主窗口，单击MS Method，出现MS Method 编辑对话框, 选择File > open, 选择Intellistart 中保存的质谱方法的文件，双击方法,如发现自动调谐生产的质谱方法中部分参数有误，则可以在Channels 窗口手动修改参数，填写relentinon window 中的end时间，此时间必须与液相色谱方法运行时间保持一致，选择Auto Dwell,单击OK，点击File> Save As, 保存质谱方法文件。

3.5建立液相方法

3.5.1编辑液相方法

在液相方法编辑窗口，单击Inle t ，输入溶剂名称，run time 及梯度洗脱程序，梯度洗脱程序中最后阶段时间必须与run time 符合，单击OK, 选择File > Save As 保存方法，单击Load Method ，平衡液相。

3.5.2 建立样品列表

在Masslynx 主窗口，选择File > New 建立一个空白的表samplelist。输入文件名File Name ，样品信息File Text ，双击MS File ，选择质谱方法，双击Inlet File, 选择液相方法，在Bottle 中输入样品瓶的位置，在Inject Volume 中输入进样体积，可右键> Add, 增加样品表的行数，保存样品表：File > Save As 。

3.6数据采集和处理

3.6.1.选中要采集的样品，单击Run > Start ,选择Acquire Sample Data only,，单击OK 开始进样并采集。

3.6.2在采集过程中，可查看色谱图，点击Chromatogram窗口，点击Real-time Update icon . 如果不能见整个TIC图，单击Default Range 图标。

如果方法中包括多个通道，可通过Display > Mass 查看

如果方法中包括多个检测器或多个Function,可通过Display > TIC 查看

3.6.3处理多个Function的数据

如果质谱方法中有多个Function，如有三个Function，如想看第二个Function，MS Scan 的数据。

3.6.3.1 在色谱图窗口，点击Display > TIC，选中MS Scan ，选择Add trace ，单击OK。

3.6.3.2如想查第二个Function, Daughter Scan 质谱图，在色谱图中，选择Display > TIC, 选择ScanWaveDS Add trace ，单击OK。

3.6.3.3. 选择Process > Combine spectra. 分别用右键输入信号和本底噪音. 单击OK. 得到Daughter Scan的质谱图，单击Process > Smooth…，单击OK。

3.7 数据处理-外标定量法

3.7.1在Masslynx 主页面单击Targetlynx/Edit method，出现定量方法编辑对话框，单击新建方法图标，新建一个定量方法。

3.7.2单击Add new compound (添加新的化合物)图标，添加一个新的化合物。

3.7.3单击菜单栏update,选中Quantitation Ion 和Compound Name（前面打勾）

在Masslynx 主页面，打开中等偏下低浓度标准品的色谱图，Display/Mass chromatogram选出要定量的化合物的离子对，一般强度高的化合物用来做为定量离子，另一个离子对则作为确证离子，用鼠标右键在定量离子对色谱图上拉一下，则compound name, Acquisition Function Number, Quantification Trace, Predicted Retention Time和Retention Time window 将自动输入到定量方法中。注意：在色谱图上拉的时候，要遵循两个原则，拉的位置要以色谱峰的峰尖左右对称，拉的宽度要超过峰的起点和终点。

3.7.4单击工作曲线图标，在工作曲线设置页面，填入

Concentration Units:浓度单位，例如ng/ml, ug/kg，ppb, ppm等。

Concentration of Standard: Level –选择Conc.A。

Polynomial Type –选择Linear. （可根据自己行业的规定）

Calibration Origin_选择exclude(排除原点)，include(包含原点)，force(强制过原点) Weithting Function(权重)_1/x （根据自己行业规定）

Propagate Calibration Parameters_如果所有的化合物均用相同的工作曲线的参数，选Yes

3.7.5打开积分参数列表，选中Apex Track Enabled （打勾，YES），Integration Window Extent 输入2，选中Propagate Integration Parameters (打勾)，如果色谱峰并不是很对称的色谱图，可先在色谱图上先设定参数，积分，好积分参数满意之后，process/integrate…/copy ,在Targetlynx 方法中Edit/Past 就可将其粘贴到Targetlynx 方法中。建议用Apex Track 积分方法，Smooth 方法建议用smooth iteration 1,smooth width 2。重复上面的过程，把其他几个化合物的信息全部加入，保存方法：File/Save As, 保存到当前项目的MethDB 文件夹中，正确的samplelist 表格模板，除了前面进样时的选项之外，还要有sample type, ConA, 等选中要处理的样品，单击Process Samples，出现下图的对话框，确保选中,Integrate 、sample ，calibrate Standard，Quantify Sample,选择刚才编辑的Targetlynx 方法，单击OK后，出现定量结果对话框。可根据自己的需要，用鼠标右键，Chang Column Order 来增加或减少Summary中的选项。

3.8关机程序

3.8.1日常关机：

3.8.1.1如果流动相中有缓冲盐必须先将缓冲盐换成水，灌注2分钟，流速设为0.2ml/min，80%水相，冲洗至少30分钟，换成80%有机相，冲洗至少20分钟，停流速，水相，冲洗至少30分钟，换成80%有机相，冲洗至少20分钟，停流速，柱温为室温。

3.8.1.2关质谱：主界面mass tune或者电脑下面仪器图标----界面左侧偏上fluidics---flow state选择为waste、关氩气，mass tune界面或者电脑下面仪器图标工具栏第6个> 关高压mass tune界面右下角> 等待去溶剂气温度降低至100度以下mass tune界面或者电脑下面仪器图标左侧偏上。

ES+source-----temperature---desolvation > 关氮气，点击氮气发生器开启开关。

3.8.2彻底关机

3.8.2.1 先完成日常关机

3.8.2.2泄真空: tune page > vacuum > vent---yes > 等待涡轮分子泵转速降到10以下，masslynx主界面-----左侧instrument----Mass tune---界面左侧偏上diagnostics---vacuum---source turbo speed[%]

3.8.2.3退出软件，其他界面先退出，主界面最后退出

3.8.2.4关质谱电源> 关所有UPLC电源，计算机电源，仪器三个电源顺序无所谓，关氮气发生器，氩气。

3.8.2.5如果有UPS，关闭UPS电源，计算机电源。

4日常维护、保养及注意事项

4.1 仪器室要保持整洁、干净、无尘；配套设施布局合理。

4.2 仪器室温度应相对稳定，一般应控制在20-25℃，保持恒温；相对湿度最好为50-70%，室内应备有温度计和湿度计，一般采用空调和吸湿机调节温度和湿度。

4.3气压过滤机械泵油，停止样品采集、停止流动相、关闭高压、关闭所有气流，关闭离子源内的真空隔离阀。用一字镙丝刀顺时针方向拧开机械泵上的Gas Ballast 阀四分之一圈，运行 30 分钟后再把 Gas Ballast 阀旋转到原来关闭的位置。对于 ESI源，至少每星期做一次，对于APCI源，每天做一次。

4.4 开高压之前一定要先开氮气，关氮气之前一定要先关高压。

4.5 ESI 离子化与溶剂密切相关，在使用某些溶剂和添加物需要注意以下几个方面：三氟乙酸（TFA）多用于蛋白质和多肽分析，但对ESI离子化有抑制效应；三乙胺（TEA）在m/z 102处有较强的[M+H]+峰，有可能会抑制某些碱性化合物在正离子ESI条件下的离子化，也有可能会增强某些碱性化合物在负离子ESI条件下的响应；

4.6 要避免使用非挥发性的盐 (phosphate, borate, citrate, etc.)；表面活性剂、清洁剂和去污剂 (会抑制离子化)；以及无机酸 (sulphuric acid, phosphoric acid etc.)等。

4.7 连接UPLC泵、色谱柱、注射泵以及ESI探头时，要将仪器置于standby状

态。

4.8.当改变分辨率的时候，仪器的质量数也会有轻微的偏移，所以在不同分辨率的条件下，应该做质量数校正。

4.9样品贮存在塑料离心管中，其中的添加剂很容易混入，尤其是被有机溶剂浸泡时间较长时，会产生干扰物信号。

4.10工作站计算机不要安装与仪器操作无关的软件，要经常清理计算机磁盘碎片，定期查杀病毒，定期备份实验数据。

4.11仪器应定期检查，并有专人管理，负责维护保养及清洁。

4.12实验完毕要清洗进样针、进样阀等，用过含酸的流动相后，色谱柱、离子源都要用甲醇/水冲洗，延长仪器寿命。

4.13定期清洗样品锥孔：关闭隔断阀，取下样品锥孔，先用甲醇：水：甲酸（45：45：10）的溶液超声清洗10分钟，然后在分别用超纯水和甲醇各溶液超声清洗10分钟，待晾干后再安装到仪器上。当灵敏度下降时，需要清洗Source、二级锥孔和六级杆。

4.14 定期（每星期）检查机械泵的油的状态，如果发现浑浊、缺油等状况，或者已经累积运行超过3000小时，要及时更换机械泵油。

5 支持性文件

Waters Xevo-TQS液质联用仪使用手册。