第15章 单核苷酸多态与人类疾病

共和国、日本和我国科学家共同参与了这一预算 达30亿美元的人类基因组计划。按照这个计划的 设想，在2005年，要把人体内约10万个基因的密
码全部解开，同时绘制出人类基因的谱图。换句 话说，就是要揭开组成人体4万个基因的30亿个碱
基对的秘密。人类基因组计划与曼哈顿原子弹计 划和阿波罗计划并称为三大科学计划。
第一节 引 言
Introduction
一、什么是单核苷酸多态
单核苷酸多态（Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs）是人类染色体上 的单个核苷酸的差异。
单核苷酸多态性是指基因组DNA中某一特定核苷
酸位置上发生转换、颠换、插入或缺失等变化而
且任何一种等位基因在群体中的频率不小于1 ％。
（ 二）遗传病的分类
***
遗传学中把生物体所具有的形态结构和生理生化 特征统称为性状(character)；
同一类性状的相对差异称为相对性状。杂合状态 下能表现出来的亲本性状称为显性性状(dominant character);
不能表现出来的亲本性状称为隐性性状(recessive character)。
第十五章 单核苷酸多态与 人类疾病
SNPs In Human Diseases
了解遗传因素在疾病中的作用是遗传学家的首要 任 务，它将有利于疾病的诊断、治疗和预防，也 有助于了解环境因素在疾病发生中的作用。
人类基因组计划的完成 标志着寻找致病基因的方
法进入了一个新时代，人们不再局限于单纯的定 位克隆寻找致病基因， 而转向了连锁不平衡和关 联分析，尤其对于多基因病的基因定位和克隆。
这种子代与亲代之间、子代各个体之间的差异称 为变异(variation)
变异增加了生物对环境的适应性和物种的多样性 ， 为生物的进化提供了选择的材料。
研究生物体遗传与变异现象的本质和规律的科学 称为遗传学(genetics)
医学遗传学是人类遗传学的重要分支，是临床医 学与遗传学相互渗透形成的一门边缘学科，它是 遗传学知识在医学中的应用，是现代医学的一个 新领域。
理想的温度梯度可以通过垂直TGGE （即温度梯 度与电泳方向垂直） 的方法来优化， 它可以分析
长度在200~900内的双链DNA片段。如果在高 Tm 值的区段， 需在PCR引物的5’ 端加上一段约40~50 的GC夹子， 但如果SNP在GC富集区， 则很难检 测到。
4. 限制性片段长度多态性 （restriction fragment length polymorphism, RFLP）
5. 非同义SNP（non-synonymous SNP） 能够改变基因产物结构或影响基因 表达量的SNP
第二节 SNP分型技术与数据资 源
SNP Genotyping Technologies and Resources
一、SNP检测和分型技术
SNP分型（genotyping）是对SNP基因 型的检测过程
医学遗传学的研究对象是人类遗传病，它着重研 究人类遗传病的发病原因、传递方式、诊断、治 疗、预后和预防等，从而达到控制遗传病在一个 家庭中的再发，降低它在人群中的危害，进而提 高人类的健康水平。
二、医学遗传学的研究范围
（ 一）遗传因素在疾病发生中的作用
人类的一切性状都是遗传因素和环境因素 相互作用的结果，即： 遗传基础+环境条件发育成特定的性状
异源DNA双链与同源DNA双链由于熔解温度 Tm 值不同，从而在分子稳定性或单链构象上也不会 完全相同,DGGE正是根据这一特点，利用变性
剂的浓度梯度凝胶电泳来进行分离检测。分别具 有一种SNP等位基因型的两种DNA分子之间即使 只有一个碱基对的差异，也会在不同时间发生部 分解链，从而分离成两条带。 DGGE的检测片段 可以达1000bp，对100~500bp的片度更为准确。
即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。由于 正常的DNA双链与具有错配碱基的双链分子相比 有更高的热力学稳定性，所以前者的荧光强度要 比后者高5%~35%.
第3代标记
1996年MIT的Lander ES又提出了SNP（single nucleotide polymorphysm）的遗传标记系统。对每 一核苷酸突变率为10-9，双等位型标记，在人类 基因组中可达到300万个，平均约每1250个碱基对 就会有一个。3~4个相邻的标记构成的单倍型（ haplotype）就可有8~16种。
又称连锁图谱（linkage map），它是以具有遗传 多态性（在一个遗传位点上具有一个以上的等位 基因，在群体中的出现频率皆高于1%）的遗传标 记为“路标”，以遗传学距离（在减数分裂事件 中两个位点之间进行交换、重组的百分率，1%的 重组率称为1cM）为图距的基因组图。
第1代标记
经典的遗传标记，例如ABO血型位点标记，HLA 位点标记。70年中后期，限制性片段长度多态性 （RFLP），位点数目大与105，用限制性内切酶 特异性切割DNA链，由于DNA的一个“点”上的 变异所造成的能切与不能切两种状况，可产生不
3.温度梯度凝胶电泳 （ temperature gradient gel electrophoresis, TGGE）
TGGE也是根据正常DNA片段与含SNP的DNA片 段的 Tm值不同进行分离的，即一个碱基的突变可 以引起在不同温度下DNA双链的解链行为不同， 从而引起电泳迁移率的不同，最终达到分离。
SNP分型包括两方面内容：对未知SNP 的进行分析和对已知SNP进行分析
用于SNP发现的技术
1. 单链构象多态性（single-strand conformational polymorphism, SSCP）
单链DNA的折叠结构是由单核苷酸序列决定的， 某一个碱基发生突变时，便会直接影响该链的构 象，从而引起其电泳行为的差异。该方法是将聚 合酶链反应 （polymerase chain reaction, PCR）产物 先在95 ℃ 下变性解链， 再在冰中骤冷， 然后通 过非变性凝胶电泳分离。
医学遗传学简介
一、医学遗传学的概念
任何生物体生长发育到一定的大小和程度时，都 要产生与自身相似的新个体，这是生命的基本特 征之一。在这个过程中，子代与亲代的相似现象 称为遗传(heredity)
遗传使物种保持相对稳定，但是谁都不会在自然 界发现任何两个完全一样的生物，即使是双胞胎 也很容易被其父母分辨出来。
位于一对同源染色体的相同基因座位上，控制相 对性状的一对基因称为等位基因(allele ) ，如基因 Ａ与基因 ａ,它们影响着同一对相对性状的形成。
人类基因组计划(human genome project, HGP)是由 美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启
动的。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦
同长度的片段（等位片段），可用凝胶电泳显示
多态性，从片段多态性的信息与疾病表型间的关 系进行连锁分析，找到致病基因。如Huntington症 。但每次酶切2-3个片段，信息量有限。
第2代标记core）、可变串 联重复VNTR（variable number of tandem repeats） 可提供不同长度的片段，其重复单位长度为6至12 个核苷酸 ，1989年微卫星标记（microsatellite marker）系统被发现和建立，重复单位长度为2~6 个核苷酸，又称简短串联重复（STR）。
二、SNP相关的基本概念
1. 等位（allele）SNP是一种双等位多 态（即SNP的二态性）
2. 基因型（genotype）同源染色体上 一对SNP等位的组合
3. 单体型（haplotype）特定染色体区 域相邻近的SNP的组合
SNP等位、基因型、单体型与TagSNP
4. 最小等位频率（minor Allele Frequency, MAF）群体中，一对SNP等位 中出现较少的等位的频率，以5%(1%)为界 将SNP分为常见SNP和罕见SNP
Yao等在检测黑色素受体基因 （MC2R）突变时， 用SSCP方法发现了两个新SNP位点。SSCP方法操 作简单、经济，适用面广。
一般来说，对于150~450bp的片段，SSCP的检出
率可高达90%，但它的影响因素较多，如电泳温
度、凝胶浓度等均可影响灵敏度。
2. 变性梯度凝胶电泳 （denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）
控制显性性状的基因称为显性基因 ,通常用大写英 文字母表示；
控制隐性性状的基因称为隐性基因,通常用小写英 文字母表示。
生物个体所表现出来的遗传性状称为表现型(表型 ,phenotype) ;
控制生物性状的基因组成称为基因型( genetype) 。
一对基因彼此相同的个体称为纯合体， 如基因型 为 ＡＡ 、ａａ的个体；一对基因彼此不同的个体 称为杂合体，如基因型为 Ａａ的个体。
压力的原因，SNP在单个基因或整个基因组中的 分布是不均匀的 ，SNP的数目在非编码区要远远 大于编码区。
它的基本特性有以下几个方面： ( 1 ) 某一人群中的频率大于1 ％； ( 2 ) 具有遗传稳定性。S N P s 的遗传稳定性高于 微卫星等重复序列多态性； ( 3 ) 可以建立单体型区域； ( 4 ) 分布频密。据估计 S N P s 在人类基 因组 的平 均密度为 1 / 1 0 0 0 ， 数量巨大， 因此多态性信息 含量高，可以在任何一个 待研究基因的内部或周围 找到； ( 5 ) S N P s 是一种二等位基 因标记，适于大规模检 测分析
限制性内切酶是一类识别DNA特异位点， 并在特 异位点进行切割的酶类。该技术的前提是待检测 的SNP位点的两侧需含有限制性内切酶识别序列 。此法简便、 快速， 可进行大量样本的分析，
缺点是不能直接分析DNA的排列顺序， 且有近半 数的SNPs并不导致酶切位点的改变。在PCR中引 入错配引物可克服这一不足。
这 一策略的关键就是比较家系中和( 或) 人群中的 大量遗传标记的频率， 从而寻找与疾病相关的 D N A变异并将其定 位。