流式细胞分选原理与应用
流式细胞仪分选原理
流式细胞仪分选原理流式细胞仪是一种高效、快速、准确的细胞分析工具，它能够实现对细胞的快速分类、计数和分选。
其分选原理主要基于光散射和荧光信号的检测与分析。
本文将详细介绍流式细胞仪的分选原理及其应用。
一、光散射的检测与分析流式细胞仪通过激光束照射样品细胞，细胞与光发生相互作用后会发生光散射。
光散射分为前向散射、侧向散射和后向散射三种。
前向散射主要与细胞的大小和形状有关，可用来区分不同类型的细胞。
侧向散射则与细胞的复杂度和颗粒物含量相关，可用来评估细胞的复杂度和颗粒物含量。
后向散射则与细胞的内部结构有关，可用来评估细胞的核质比。
二、荧光信号的检测与分析流式细胞仪通过荧光染料标记的抗体或荧光染料直接标记的细胞，可以检测到细胞表面或内部相关蛋白、DNA或RNA的荧光信号。
这些信号可以用于检测细胞的免疫表型、细胞周期和细胞凋亡等生物学特性。
通过检测细胞的荧光信号，可以实现对不同类型细胞的快速分类和分析。
三、细胞的分选在细胞检测和分析的基础上，流式细胞仪还可以实现对特定类型细胞的分选。
分选是通过细胞仪中的细胞排序系统实现的，通常采用静电分选或压力分选的方式。
静电分选是通过根据细胞的光信号特征将其分为阳性和阴性细胞，然后通过高压电极将细胞引导到相应的收集器中。
压力分选则是通过调整细胞流速和压力差，使目标细胞以一定方式排列并被分选。
四、流式细胞仪在生命科学中的应用流式细胞仪在生命科学研究中具有广泛的应用。
首先，它可以用于免疫表型分析，通过检测细胞表面标记物的荧光信号，可以对细胞的免疫表型进行精确的鉴定。
其次，流式细胞仪可以用于细胞周期分析，通过检测DNA荧光信号的强度，可以确定细胞所处的不同周期阶段。
此外，流式细胞仪还可以用于细胞凋亡分析、细胞功能研究以及肿瘤细胞的分选等。
总结：流式细胞仪的分选原理主要基于光散射和荧光信号的检测与分析。
通过光散射可以评估细胞的大小、形状、复杂度和颗粒物含量等特征，而荧光信号则可以用于检测细胞的免疫表型、细胞周期和细胞凋亡等生物学特性。
(完整版)流式细胞分选技术
流式细胞分选技术一、定义流式细胞分选技术是利用流式细胞分选仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选，能复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离，单次可同时对其中一种到四种特定细胞进行超高速分选纯化、高通量单克隆分选或细胞芯片制备。
分选后的细胞能直接用于培养、移植、核酸提取、单细胞PCR扩增或原位杂交等，可进一步进行细胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同细胞之间的差异化研究。
硬件中样本细胞丢弃的比例低于5%，保证样本中目标细胞的高回收率。
【晶莱生物】二、实验原理当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。
流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。
在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。
将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。
三、实验流程（以分选有核红细胞为例）1.采抗凝血10 ml。
2.密度梯度分离单个核细胞层（1）在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
（2）取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。
水平离心2000 rpm×20分钟。
（3）离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。
中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞仪分析技术及应用
流式细胞仪分析技术及应用流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。
概述流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析。
一、工作原理（了解）基本组成结构1.液流系统由样本和鞘液组成。
待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的单克隆抗体染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流；鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液，其主要的作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中心位置以保证检测的精确性，同时又防止样本流中细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。
2.光学系统由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。
（1）激光光源：现代流式细胞仪采用的多为气冷式氢离子激光器，常用激光束波长为488nm，15mW。
（2）分光镜：作用是反射较长波长的光，通过较短波长的光。
（3）光束成形器：由两个十字交叉放置的圆柱形透镜组成。
（4）透镜组：有3个透镜，作用是将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。
（5）滤片：长通滤片，允许长于设定波长的光通过；短通滤片，允许短于设定波长的光通过；带通滤片，允许一定带宽的波长通过，其他波长的光不能通过。
（6）光电倍增管（PMT）：主要作用是检测散射光和荧光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。
3.数据处理系统主要由计算机及其软件组成，进行实验数据的分析、存储、显示，是流式细胞仪组成部件中的重要环节。
二、散射光的测定散射光信号的产生是细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，散射光的强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的方向也有关。
细胞流式分选
细胞流式分选细胞分选技术可以将不同种类的细胞根据其特定的属性进行分离和分析。
其中，细胞流式分选技术作为一种常用的手段，可以通过将细胞悬浮液经过流式细胞仪进行检测，再根据细胞特性进行高速分选。
该技术已经被广泛应用于许多生物医学领域，如肿瘤学、免疫学、神经学等，为细胞学研究提供了有力的工具。
一、细胞流式分选的原理细胞流式分选技术基于流式细胞仪和荧光标记技术。
首先，将细胞悬浮液加入流式细胞仪中，然后通过光学光谱仪对其进行检测，记录细胞具体的特性信息。
接着，根据细胞表面的特定标记分别用荧光染料染色，并将细胞以快速流动的方式通过激光束进行荧光检测，荧光信号被记录在荧光探测器中。
最后，细胞根据这些特征被迅速分选，实现不同类型细胞的分开操作。
二、细胞流式分选的应用细胞流式分选技术广泛用于肿瘤学、免疫学和生殖医学等领域。
以肿瘤学为例，该技术可用于分离纯化恶性肿瘤细胞，对于恶性肿瘤细胞的研究具有重要意义。
在免疫学中，该技术被用于对免疫细胞进行排序和筛选，以进行相关检测。
在某些实验中，要求使用高度纯化的单一类型细胞，因此，细胞流式分选技术也是必不可缺的技术手段。
此外，在生殖医学领域，该技术同样广泛用于人类胚胎和生殖细胞的筛选、筛查和分离。
三、细胞流式分选技术的发展随着生命科学的不断进步，细胞流式分选技术也得到了不断的升级和发展。
例如，现在的细胞流式分选仪已经不仅可以分选细胞，还能用于快速植物种子品质检测。
而流式细胞仪以及其中的荧光标记和探测器技术也在不断更新，以适应越来越多的研究需求。
未来，随着技术的进一步发展和完善，细胞流式分选技术将无疑在许多生命科学研究领域发挥更加重要的作用。
总之，细胞流式分选技术作为一项令人瞩目的细胞分离技术，在生命科学研究等许多领域具有重要作用。
其原理简单且操作便利，可以在很短时间内分离出纯化的特定类型细胞，为应用于生物和医学研究打下了坚实的基础。
随着技术的不断进步和发展，细胞流式分选技术将在未来更加普及，并为人类健康事业和细胞研究的发展带来更多的可能。
流式细胞术的原理与应用-FACS-aria
信号检测
FALS Sensor
Freq
散射光信号 （FSC、SSC）： 物理参数
Fluorescence
Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
荧光信号： 非特异荧光 + 特异荧 光
26
散射光信号
前向角散射光信号（FSC ，Forward Scatter ）：与激光方向同轴 侧向角散射光信号（SSC， Side Scatter ）：与激光束垂直
48
细胞膜检测： Annexin V/PI双染色法
死亡和晚 期凋亡
活细胞： annexinV-/PI早期凋亡： annexinV+/PI死亡和晚期凋亡： annexinV+/PI+
49
活细胞
早期凋亡
新功能基因CB12质粒转染的293T细胞明显促 进细胞凋亡 FL1:FITC-annexinV, FL2:PI
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信号的显示方式
单参数直方图（Histogram） 双参数：
二维点图(Dot Plot) 等高线图(Contour Plot) 二维密度图(Density Plot)
三维图(3D Plot)
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单参数直方图（Histogram）
阴性区
阴性 对照
横坐标：荧光信号的 强弱 (相对强度)，反 映了细胞抗原的表达 含量
27
前向散射光信号(FSC)
前向散射光信号（FSC ）：与细胞相对大小和体积相关
28
侧向散射光信号（SSC)
侧向角散射光（SSC） :代表细胞内部的精细结构变化，对胞膜、 胞质、核膜变化更敏感
流式细胞术基本原理及应用
流式细胞术基本原理及应用流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生命科学和临床医学研究的技术，能够快速、高效地分析和计数细胞，同时可以对细胞进行多参数的定位、鉴定和分离。
该技术的原理是通过激光束激发细胞中的荧光染料或标记物，然后检测细胞散射光的强度和荧光信号的强度，进而对细胞进行分析和排序。
本文将介绍流式细胞术的基本原理及其应用。
样本制备是流式细胞术的第一步，通过样本的处理来获取以细胞为基础的单细胞悬浮液。
这个过程可以通过机械或酶的方法破碎组织以获得细胞，并使用缓冲液来稀释细胞以避免细胞团。
通常，通过过滤或离心的方法，除去细胞碎片和大颗粒物质。
然后，用缓冲液沉淀细胞并冲洗细胞以去除细胞外的成分。
细胞悬浮是将细胞从红细胞和组织碎片中剥离并悬浮在缓冲液中的过程。
一种常用的方法是将细胞悬浮在含有胎牛血清等蛋白质的培养基中，以保持细胞的活力和稳定性。
细胞检测是流式细胞术的核心步骤，通过激光光束照射细胞，然后测量散射光和荧光信号来分析细胞的性状。
散射光包括前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）。
FSC反映了细胞的大小和形态，SSC反映了细胞的复杂性和颗粒含量。
荧光信号是通过用具有荧光标记分子（如抗体或染料）标记细胞，然后用激光激发标记物并测量其荧光强度来检测的。
可以使用多个激光器和相应的滤光片来激发和检测多个荧光染料，从而实现多参数的分析。
数据分析是流式细胞术的最后一步，通过计算机软件对测量到的数据进行处理和解读。
数据分析可以根据散射光和荧光信号的特征，将细胞分类和鉴定。
可以根据亮度、大小和形状等参数来区分细胞的不同类型或亚群。
1.免疫细胞学研究：通过荧光标记的抗体，流式细胞术可以用来鉴定和分析细胞表面分子的表达情况和细胞亚群的分布。
例如，用荧光标记的CD4和CD8抗体可以区分T细胞亚群，并研究它们在疾病发展中的作用。
2.细胞周期分析：流式细胞术可以通过荧光染料标记DNA，从而实现对细胞周期的分析。
流式分选的原理及应用
流式分选的原理及应用1. 引言流式分选（Flow Cytometry）是一种用于分析和分类细胞的技术，通过流式细胞仪可以对细胞进行快速、精确的检测和分离。
本文将介绍流式分选的原理及其在生命科学研究、临床诊断和药物开发领域的应用。
2. 原理流式分选的原理基于光学和生物学技术，主要包括以下几个步骤：2.1 细胞样品的准备首先，需要从待分选的样品中提取细胞，并进行适当的处理，如去除红细胞、细胞碎片和杂质。
2.2 细胞的染色为了能够准确地识别和分类细胞，需要对细胞进行染色。
常用的染色方法包括荧光染色和抗体标记。
2.3 光学系统的设置流式细胞仪的关键部分是光学系统，它包括激光器、光源、滤光片和光电倍增管。
这些光学元件能够发出、传递、分离和检测细胞产生的荧光信号。
2.4 细胞的流动和检测染色后的细胞悬浮液通过流式细胞仪的流动系统，以单个细胞的方式通过激光器。
当细胞被激光照射时，会发出特定波长的荧光信号。
光电倍增管会接收到细胞发出的荧光信号，并将其转换为电信号。
2.5 数据的分析和图像的展示流式细胞仪会将获取到的荧光信号转化为数字信号，并将其存储在计算机中。
研究人员可以通过专业的数据分析软件对这些数字信号进行处理和分析，生成条形图、散点图等图像展示。
3. 应用流式分选技术具有广泛的应用前景，主要体现在以下几个领域：3.1 生命科学研究流式分选技术在生命科学研究中起到了重要的作用。
通过对不同类型的细胞进行染色和分选，研究人员可以探究细胞的分子和功能特征，揭示细胞的发育过程、信号传导途径等重要信息。
3.2 临床诊断流式分选技术在临床诊断中有着广泛的应用。
通过检测患者血液或体液中的异常细胞数量和特征，可以帮助医生进行疾病的诊断和预后评估，如白血病、淋巴瘤等恶性肿瘤的诊断。
3.3 药物开发流式分选技术在药物开发过程中也发挥了重要的作用。
通过对药物对细胞的影响进行分析和评价，可以帮助研究人员筛选出具有特定效果的药物，并进行药物研发的进一步优化。
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流式细胞分选原理与应用
北京大学医药卫生分析中心
吴后男
2010. 04. 26
教学邮箱：cell-2009@ 密码：82802389
Tel : 8280 5034 or 2437
第一部分分选仪结构与原理
●流式细胞分选技术（Flow Cytometry，FCM）
利用分选仪检测单细胞或生物颗粒的多种特异性荧光信号，并针对同样荧光信号特性的细胞亚群从总细胞群体中分离和富集的高科技细胞分析技术。
●高速分选特点
1. 检测对象：荧光素标记单个细胞悬液
2. 分选速度快：5万个细胞/秒
3. 分选纯度高：99%以上
4. 回收率高：＞80%
5. 同时检测单细胞(single)内多种信息：膜、浆、核
●分选仪主要厂商
1. 美国BD公司(Beckton Dickinson)
▲1973年第一台问世：FACS I（Fluorescence Activated Cell Sorter）
▲1980年中国第一台：FACS II
▲市场占有率：全球75%，中国70%
2. 贝克曼库尔特公司（Beckman Coulte）
中国30%，目前呈逐年上升趋势
●分选仪内部结构
一、光学系统
1.激发光源：激光器
▲气体：氩离子（488nm）、氦氖（633nm）、氪离子
（647nm）、氪氩（568nm）
▲染料：如氩离子激光泵浦的Rhodamin 6G水溶液染料，激
发出550-650nm可变波长激光
▲半导体：价格低、结构简单、寿命长，但功率较低。
现
已广泛应用。
如：BD的FACS Calibur、Aria已
采用固体激光器
2.光收集系统
滤光片
Trigons and Octagon
二、液流系统
1.流动室：仪器核心部件，被测样品在此与激光相交
2.液流驱动系统（压力泵）：空气泵+压力传感器
FACS Aria 液流系统流程图
三、电子系统
1.光电转换器:将光信号转换为电信号
光电二极管：光灵敏度低，测定强信号（FSC）
光电倍增管（PMT）：放大电信号,光灵敏度高，测
定弱信号（SSC、FL1、FL2、FL3、FL4）前置放大电路：输出电脉冲信号
模数转换电路：将模拟的峰值转换为数字化信号
2.数据处理系统：计算机系统数据采集、分析
电脉冲定量
脉冲高度分析和数字转换
四、分选系统(电荷式)
●分选原理（电荷式）
●流式细胞仪信号检测
1.散射光信号（FSC、SSC）：物理或固有参数
2.荧光信号：自发荧光+ 特异荧光
●流式细胞术操作流程：
●分选范围及用途
范围：
▲普通细胞分选
▲干祖细胞分选
▲染色体分选
▲性别选择（精子分选）
▲胎儿红细胞产前诊断
▲单克隆细胞分选
▲成分分选
用途：
▲形态学研究
▲纯化细胞传代培养
▲分子生物学研究（FISH、PCR）
▲细胞功能研究
第二部分分选技术应用
▲细胞生物学
▲免疫学
▲遗传学
▲药理学
▲肿瘤学
▲血液学
▲病理学
▲临床检验
▲植物学
▲海洋生物学
▲食品
▲制药工业
▲农业畜牧业
GFP转染细胞分选
基因转染细胞分选
人外周血CD4+、CD8+、非T淋巴细胞分选小鼠胸腺基质细胞分选
人CD4+CD25+ T淋巴细胞分选
CD4+T细胞功能亚群分选(5标)
增殖期淋巴细胞分选
❖与细胞膜结合
❖细胞分裂后，染料平均分配到两个子细胞中❖CFSE (FL1)
❖PTIR271(FL2)
二路分选纯度验证
四路分选纯度验证
Post-Sort。