从人组织样本制备单细胞悬液文献美天旎官方网站客户反
gentleMACS实验操作步骤中文
gentleMACS™操作步骤1.背景信息在许多实验中，需要用到单细胞悬液，如用MACS®技术分选细胞时，要想获得高纯度和回收率的话，单细胞悬液就很重要。
德国美天旎生物技术有限公司开发的gentleMACS™分离器能够提供优化的程序，用于从不同的组织中获取单细胞悬液。
这些组织包括小鼠脾脏，肝脏，肺脏，脑组织等。
使用C管，能够在一个密闭的系统中进行全自动的组织分离，可以保证组织操作的无菌，以及能够同时处理2个组织样本。
2. 分离小鼠脾脏的操作步骤2.1 需要的试剂和仪器●gentleMACS 分离器●gentleMACS C 管(# 130-093-237)●细胞滤器，如30 μm n尼龙滤网（Pre-Separation Filters# 130-041-407)●缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含0.5% 牛血清白蛋白(BSA), 和2 mMEDTA (不推荐使用含Ca2+ or Mg2+的缓冲液)2.2 步骤▲如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。
▲一只小鼠脾脏的重量约为80–120 mg (BALB母鼠, 6–7 周龄).1. 将小鼠脾脏转移到gentleMACS C 管中，按照脾脏的数量加入缓冲液:1–2 个小鼠脾脏: 3 mL3–4个小鼠脾脏: 6 mL5–6 个小鼠脾脏: 9 mL2. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上▲注意: 必须确保组织块在转子区域3. 开机，选择合适的分离程序：1–2 个小鼠脾脏: m_spleen_01.3–6个小鼠脾脏: m_spleen_04.4. 运行gentleMACS 程序m_spleen_01. 或m_spleen_04.5. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管6. (可选) 以300×g 室温下离心2分钟。
7. 去除分离的组织块，将细胞悬液通过一个预分选滤器（1-2个脾脏），该预分选滤器放置于15mL管子中。
美天旎公司磁珠分选产品
美天旎公司磁珠分选产品标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]美天旎公司MACS(磁珠分选)相关产品一、MACS微珠（MicroBeads）MACS微珠是一种与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒，用于目的细胞或者去除细胞的磁性标记。
微珠直径约有50nm，比细胞小200多倍，体积为细胞的百万分之一，光学显微镜下不可见。
微珠由多聚糖和氧化铁组成，无毒性，对细胞无损伤，可以生物降解。
MACS微珠与流式细胞仪兼容，不会影响细胞的光散射特性；磁性标记只占用2 0－30％的结合位点，不影响细胞的荧光抗体标记。
此外，MACS微珠可以最大限度地避免细胞活化；无需解离磁珠，可以直接进行后续实验：如流式细胞仪分析或分选、细胞培养、分子生物学研究、回输给人或者动物。
MACS微珠主要有三种：直标微珠、间标微珠、多选微珠。
其中间标微珠有抗免疫球蛋白微珠、抗生物素微珠或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠。
多选微珠是专门为分选细胞亚群而研制的一种微珠。
这种微珠通过特殊的方式与抗体偶联，在第一次阳性分选完成后，与细胞结合的多选微珠可以被解离试剂剪切下来，阳性分选的细胞可以进行再次阳性分选或者去除分选。
MACS技术分选的CD8阳性T细胞（箭头所示为磁性结合在细胞表面的微珠）二、MACS分选柱（Separation Column）MACS分选柱是一类填充有不同规格铁珠的塑料容器，铁珠表面有亲水包被，因此不会损伤细胞。
在磁场外MACS分选柱不带有磁性，但是当置于一个永久性磁场—MACS分选器中时，分选柱内的铁珠可以使分选器的磁场增强1000倍，足以滞留仅标记有极少量微珠的目的细胞；磁性标记细胞从分选柱中通过时可以受到均匀的磁力作用，从而提高分选纯度和回收率。
手动操作在30分钟内可完成，自动分选仅需分钟，得到的细胞可立即用于后续实验。
此外，大多数MACS分选柱都是无菌包装，一次性使用，可以满足细胞培养所需的无菌条件。
miltenyi biotec(德国美天旎生物公司)CD133相关专利产品
CD133是近年在干细胞领域研究较为活跃的细胞膜糖蛋白之一,常表达于未成熟的造血干细胞或祖细胞,新近有报道认为它在脑肿瘤、前列腺癌、小鼠的Lewis肺癌、B16黑色素瘤的干细胞中均有表达,已被认为是这些肿瘤干细胞的标志之一。
miltenyi biotec（德国美天旎）拥有CD133全系列的全球专利。
美天旎部分CD133：一.CD133的分子结构人CD133抗原为5次跨膜糖蛋白，目前发现的同源性抗原有CD133_1和CD133_2，其基因分别定位在人类的4号和2号染色体上，分析CD133的基因结构发现，CD133_1基因至少含有27个外显子，CD133_2基因比CD133_1基因少1个27 bp的4号外显子。
CD133_1抗原cDNA全长为3 794 bp，其中5′端有37 bp的非翻译区，3′端有1 159 bp的UTR，中间为2 598 bp的开放阅读框，编码865个氨基酸的蛋白。
转录起始密码子ATG位于38bp 处，ATG之后还有一编码19个氨基酸的信号肽序列,终止密码子位于第2 763位,第3 906核苷酸处有一长20 bp的polyA序列。
CD133_1与CD133_2的相对分子质量分别为120 KD 和112 KD，CD133_2由含856个氨基酸的肽链组成，比CD133_1少9个位于E1区的氨基酸[2]。
在发现人CD133的同年，在小鼠中也发现了CD133_1的同源性抗原并命名为Prominin_1，二者具有60％的相似结构，之后，成功克隆出Prominin_2，与Prominin_1和人CD133分别有29％和26％的相似结构，认为是Prominin_1的同源性抗原。
CD133的功能目前尚不清楚，存在于C端的酪氨酸暗示它可能是通过酪氨酸残基磷酸化作用而发挥级联效应的生长因子受体。
二. CD133阳性的肿瘤干细胞利用某些干细胞标志物与肿瘤细胞标志物相结合的方法确定肿瘤干细胞特异性的标志物，是当前肿瘤干细胞筛选的主要手段。
美天旎流式
流式细胞仪 Flow Cytometer
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、 光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体 技术为一体的一种高科技仪器。
流式细胞仪的发展及商品化
1934 Moldavanl: First try ( 固定式细胞分析-流动式)； 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流 式细胞仪-FACS Ⅰ。 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
如：Annexin V； 如：BudU掺入染色； 如：CFSE； 如：aldefluor；
流式细胞术临床应用（主要血液科、检验科）
淋巴细胞亚型分析(CD3/CD4/CD8/CD19/CD16CD56)； 白血病免疫分型； 白血病微小残留病灶MRD检测； 多发性骨髓瘤MM的检测； 骨髓增生异常综合征MDS的检测； 血红蛋白尿PNH的检测； 造血干细胞移植CD34干细胞检测； 强直性脊柱炎HLA-B27的检测； „„
一、流式细胞术基本原理
流式细胞术（flow cytometry，FCM）： ―细胞在流动的过程中检测细胞的各项指标。
美天旎临床产品解决方案
德国美天旎临床解决方案
美天旎的完整解决平台–细胞治疗的首选工具
MACS GMP Antibodies CliniMACS and Reagents MACS GMP Antigens MACS GMP Cytokines MACS GMP Media MACS culture bag
细胞治疗领域介绍 3
自身免疫病 - 自体干细胞移植
主要适应症-CD34分选
1. 严重系统性硬化 2. 系统性红斑狼疮 3. 克隆氏病
严重的自身免疫病疾病用SCT治疗是必须的。
重要的临床试验 - ASTIS和ASSIST
ASTIS（系统性硬化）
入选150例患者已经完成，2010年10月完成最后一例入选 2011年发表安全性检测报告 2012年发表有效性报告
肿瘤，感染和耐受包括下列产品
细胞因子捕获系统（IFN-r）用于分离AgT CD8用于富集TIL
CD56,CD3,CD19用于富集NK细胞
CD14用于富集MoDC细胞 CD1c,CD304用于富集BDC，分别为MDC和PDC
CD25用于富集Treg细胞，有时也用CD8,CD19
预防复发，减轻感染，帮助抑制，支持免疫重建，从GVT中分离GvHD
CD45R去除系统：去除naiveT细胞，预防GvHD Treg细胞：CD25，减轻免疫耐受，预防GvHD，也可结合TexMACS GMP Treg
medium和GMP ExpAct Treg kit扩增Treg细胞。
DC疫苗和CCS：CD14，预防移植后的感染
CliniMACS® 富集管道系统
临床用
科研用（临床前期）
DC细胞解决方案
单核细胞诱导DC研究工具——全套解决方案Mo-DCs、Monocyte Derived Macrophage（MDM）的研究工具——美天旎为您的研究提供全套解决方案1、样本制备——成功实验的良好开端• 专门用于去除细胞团块的预选滤器，单细胞悬液的保证，高质量分选的开始。
Product Order Nop re-Separation Filters,30 μm #130-041-4072、细胞分选——MACS技术，细胞分选的金标准• 高纯度、高得率的细胞分选；• 50nm磁珠、无毒、可生物降解；• 与下游实验相兼容，e.g.流式检测、细胞培养、分子分析等。
Product Order NoCD14 MicroBeads, human #130-050-201CD14 MicroBeads, human –lyophilized# 130-097-052 Monocyte Isolation Kit II,human# 130-091-153 Pan Monocyte Isolation Kit,human# 130-096-5373、细胞分析——精确流式检测的理想试剂• Vio-Dye系列流式抗体，亮度高，补偿小，特异性高，多色流式检测的新选择；• 传统荧光素系列流式抗体，特异性高，亮度高，性价比高，流式检测的理想试剂。
Mo-DCs 检测相关流式抗体，试剂盒Product Order NoMo-DC Differentiation Inspector #130-093-567CD14，Human（FITC，APC，PE，PerCP，VioBlue，VioGreen，PE-Vio770，APC-Vio770，PerCP-Vio700）CD209，Human（FITC，APC，PE）CD83，Human（PE，APC）CD86，Human（FITC，APC，PE，APC-Vio770，PerCP-Vio700）CD80，Human（PE,APC）HLA-DR，Human（FITC,APC,PE, VioBlue, PerCP）4、细胞培养——品质高，种类全，可定制细胞因子•从科研到临床，提供科研级、优质级和GMP级细胞因子可供选择；•包装大小灵活，可顾客定制。
如何处理成理想的单细胞悬液
有了美天旎，我反手就是一批理想的单细胞悬液！对大家来说，实体组织处理成单细胞悬液最难的是什么？目前，把实体组织样本处理成单细胞悬液，最长用的两大方法：物理法：简单粗暴！可以用剪刀剪、昂贵的研磨器磨，但是在实际工作过程中，我们会发现这种方法目前并不是万能的，有些组织（比如：骨骼神经皮肤等）还是需要配合酶消化。
酶消化法：就涉及到选择什么酶，用多少浓度，消化多少时间，如何中止等等细节，考虑这些问题也耗费了我们大量的时间和精力。
但是有了美天旎全自动组织处理器，情况就不一样了！仪器全称是：GentleMACS Octo Dissociator with Heaters中文名称是：全自动八通道加热组织处理器使用Gentle能够能够温和、高效的解离实体组织，如肝脏、肺脏、脑、肿瘤、拟胚体、骨骼肌、神经组织、脐带、皮肤等，得到完美的单细胞悬液！50多种程序供您选择！#样本制备#小助手一：组织解离试剂盒预先滴定好浓度的酶溶液及酶解时间，即用型组织解离试剂盒让您的实验更高效、可重复性更高；同时，酶溶液已经实验验证，可以很好地保护细胞表面抗原，因此得到的单细胞活力高、表位完整，不影响下游流式等实验。
现有肿瘤组织解离试剂盒、新生鼠心脏解离试剂盒、骨骼肌、皮肤、脑、神经球等近30种组织解离试剂盒，常见组织均可找到相应的解离试剂盒。
#样本制备#小助手二：细胞滤器用于去除组织解离后的细胞团块和碎片；三种规格（30µm，70µm和100µm）；有排气槽的设计，因此不会出现液体俘获和溢出，适用于不同规格的试管和分选柱。
#样本制备#小助手三：混悬仪✧自带充电电池，运行不依附电源插头，能独立的运行于各种环境中：既能使用在普通的实验台上，也能穿梭于冰箱与孵箱之间（2 –42℃）！✧使用灵活：配有不同的试管架，可放置不同规格的管子：0.5 –50 mL。
✧转速可调：机器自设三种旋转速度，间隔时间亦可调，可以温和、缓慢的旋转，有利于脆弱样本的混悬。
MACS技术介绍
高功率，水 冷
需要调整 488nm、 633nm、 407nm 模拟 否 7
数据处理模 式 脱机补偿 最多检测FL
分选速度
300/sec
no
70000/sec
10000/sec
MACS分选与 FACS分选比较 MACS优势1
• 快速 》FACS分选时间: 》MACS® 分选时间: （FACS Aria） (autoMACS™ 分选仪) 每秒钟获取70 000 细胞 平均每秒钟处理107 细胞 108 cells => 2 3 min 108 cells => 5 min 109 cells => 4 h 109 cells => 5 min （没有包括操作人员调节 （无需调节机器） 机器时间） • 操作简单、无需专人操作，可随时使用 • 分选后细胞活性好 • 无菌分选：仪器小巧，可以进操净台，耐受紫外线照射， 消毒方便，耗材为无菌性包装
• 在没有直接标记微珠可选时
• 使用自备抗体或配体的磁性分选中
• 分选或去除用多个抗体混合物标记的多种细胞
• 分选稀有细胞和抗原弱表达的细胞
• 分选标记蛋白质
MACS分选柱
填充有磁性铁珠，有亲水 包被，对细胞柔和。
在分选器中产生高梯度 磁场，滞留带有微珠磁 性标记的细胞
MACS分选柱
• 能进行完全的清洗 • 单独无菌包装，便于 无菌条件使用 • 可用于分选多种细胞 及亚细胞物质、 细菌、病毒、mRNA 和蛋白质
美天旎中国
• 2001年设立中国代表处，目前美天旎中国总部位于上海， 在北京、广州设有办事处。 • 美天旎中国目前有近15名员工，分属销售与产品推广部， 市场与技术服务部，客服与物流部。 • 美天旎中国合作伙伴 总进口商:中仪英斯泰克进出口公司 代理商： 上海强智生物技术有限公司 上海优宁维生物科技有限公司 北京利文商贸有限公司
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美天旎官方网站：产品说明书 参 考 文 献 ： Walker, L et al. Human MAIT and CD8αα cells develop from a pool of type-17 precommitted CD8+ T cells. (2011) Blood.
客户没有得到完全的单细胞悬液， 但获得的心肌组织块比手动方法更 小，细胞回收率更高。客户最终购 买设备。
目的细胞 单个核细胞
星形胶质细胞 和小胶质细胞
宫颈组织
客户反馈方案：从人的宫颈外植 白细胞 体制备单细胞悬液
蜕膜组织（子 客户反馈方案：从人的蜕膜组织 NK 细胞
宫内膜）
中分离单核细胞
牙髓 拟胚体 肠道组织
心脏 淋巴结 肺脏
客户反馈方案：从人的牙髓中分 CD44 细胞 离 CD44+ MSCs
产品说明书：拟胚体解离试剂盒 拟胚体
1 小时后，再次运行 brain_01 程
序，HBSS 清洗。
Demo 反馈：运行 program C， 心脏前体细胞
然后胰酶消化 15 分钟，再次运行
pro结果较不
理想）
Demo 反馈：1 个淋巴结加入 3 淋巴细胞
mL PBS 中 ， 运 行 程 序
参考文献：通过内窥镜取活检样 肠 道 固 有层 单
本，分离肠道固有层单个核细胞 个核细胞
（LPMCs）。将活检组织放入 1
mM DDT 溶液中，在室温摇床中
孵育 15 分钟，用 HBSS 洗 3 次
后，加入胶原酶 A/DNA 酶溶液，
然后放入 gentleMACS 管中，运
行 brain_01 程序。37°C 摇床孵育
DC 细胞 白细胞，成纤维 细胞
from Human Lung and Bone Marrow.
(2011) J. Cyst. Fibros.
参考文献：Derycke, L et al. IL-17A as
a regulator of neutrophil survival in
nasal polyp disease of patients with
and without cystic fibrosis. (2011)
J.Cyst. Fibros.
美天旎官方网站：客户反馈方案
颈部组织
鼻息肉和鼻甲 胎盘 视网膜 唾液腺 皮肤
脾脏 滑膜 胸腺
颈部组织
鼻息肉和鼻甲 胎盘
Demo 反馈：采用“人肿瘤解离试 剂盒”的标准方案 2.2.3 部分-包 括 gentleMACS 程 序 及顺 序 ： h_tumor_01 ； h_tumor_01 ； h_tumor_01；
从人组织样本制备单细胞悬液
样本
方法
脂肪组织
客户反馈方案：从人的脂肪组织
中分离单核细胞
脑组织
产品说明书：神经组织解离试剂
盒
乳腺
Demo 反馈：采用“人肿瘤解离试
剂盒”的标准方案 2.2.3 部分-包
括 gentleMACS 程 序 及顺 序 ：
h_tumor_01 ； h_tumor_01 ；
h_tumor_01；
Demo 反馈：每个 C 管最多处理 4g 组织（解离前先剪成小块）； 运行程序 m_lung_01；胶原酶 II 消 化 45 分 钟 ； 运 行 程 序 m_lung_02。 Demo 反 馈 ： 运 行 程 序 m_spleen_02；0.1%胰酶消化 30 分钟。 Demo 反馈：5 ml 缓冲液；500 mg 组织；运行 2 次 program C 程序。 Demo 反馈：采用 gentleMACS 酶 解离脾脏和肝脏的方案。也试验 了不含胶原酶处理的方案。
回收细胞数显著增多，结果重复性 更好（与传统研磨方法相比）。客户 最终购买设备。
参 考 文 献 ： Ricciardi, M et al.
Comparison
of
Epithelial
Differentiation and Immune
Regulatory
Properties
of
Mesenchymal Stromal Cells Derived
分泌细胞因子 的 T 细胞和 DC 细胞
CD34+ 造 血 干 细胞
客户反馈方案 Demo 反馈：采用“人肿瘤解离试 剂盒”的标准方案 2.2.3 部分-包 括 gentleMACS 程 序 及顺 序 ： h_tumor_01 ； h_tumor_01 ； h_tumor_01；
Demo 反馈：m_liver_01 客 户 报 告 ： Effector memory T helper cells secrete IFN-γ upon stimulation with cytokines: a role in chronic inflammation
m_spleen_01。
客户反馈方案
间充质干细胞
鼻粘膜
客户反馈方案：将人的鼻黏膜解 离得到单细胞悬液
评价
文献 美天旎官方网站：客户反馈方案
美天旎官方网站：产品说明书、科学海 报 该组织较坚硬，解离后仍有部分组 美天旎官方网站：产品说明书 织块。为了进一步增加细胞回收量， 并减少对已解离细胞的应激压力， 可以静置样本 15-30 秒，使组织块 沉降下来，移去 4ml 上清（其中已 包含大多数细胞），然后将剩余的组 织运行程序 m_imptumor_01，将得 到的细胞悬液与之前的上清混合。 参考文献：Wheeler, L et al. Inhibition of HIV transmission in human cervicovaginal explants and humanized mice using CD4 aptamersiRNA chimeras. (2011) J. Clin. Invest. 美天旎官方网站：客户反馈方案 参考文献：Vacca, P et al. Crosstalk between decidual NK and CD14+ myelomonocytic cells results in induction of Tregs and immunosuppression. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. 美天旎官方网站：客户反馈方案 美天旎官方网站：客户反馈方案