生化复习资料：酵母单杂交技术
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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基因工程 酵母单杂交技术的原理及应用
酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上，20世纪90年年代中期又发展起来的--用于核酸和文库蛋白之间的研究。
在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGal4结合位点。
将已知的特定顺式作用原件构建到最基本启动子（Pmin）上游，把报告基因连接到Pmin下游。
编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够和顺式作用原件结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。
转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报告基因表达，若连接如3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效率。
优点：简单易行，无需分离纯化蛋白，酵母菌属于真真核生物，杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象克服了体外研究时蛋白通常处于非自然构象的缺点，因而灵敏性很高。
缺点：有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报道基因的转录，因而存在假阳性结果。
如果酵母表达的AD杂合蛋白对细胞有毒性或者融合蛋白在宿主细胞内不能稳定的表达，或者融合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于细胞核内，以及融合的GAL4-AD封闭了蛋白上与DNA作用的位点则都可能干扰AD杂合蛋白结合于靶元件的能力，从而产生假阴性的结果。
酵母单杂交系统应用：1. 鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因，目前对于酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面。
Chew et al（1999）应用酵母单杂交技术证实了在大鼠脑中存在的COUP-TFⅠ、EAR2和NURR1等蛋白质GRIK5基因的内含子结合蛋白。
2. 对DNA结合结构域进行分析如果能得到DNA结合结构域的结构信息,就可以用酵母单杂交技术对该结构进行分析.Mak et al（1996）运用此技术测试哺乳动物具有基本的螺旋- 环- 螺旋(bHLH)结构的转录因子,通过对肌调节因子4(MRF4)的研究，证实其具有转录活性。
酵母单杂交技术的原理及应用
在所有的生命活动中，蛋白质是最终的执行者和体现者，并且随着大量生物基因组测序的完成，越来越多的研究人员将重点转移到蛋白组的研究上［１］。
而酵母单杂交技术是新近发展起来的一种体外研究ＤＮＡ与蛋白质相互作用的技术。
众所周知，在生物体内ＤＮＡ与蛋白质间相互作用的表达调控机制是非常普遍的，且具有重要的生物学功能。
比如在基因转录和复制中都存在这种调控机制，因此目前酵母单杂交技术已经被广泛地应用于科学研究的各个领域。
１酵母单杂交技术的原理酵母单杂交技术最早是１９９３年由Ｗａｎｇ和Ｒｅｅｄ创立的［２］，其理论基础是：许多真核生物的转录激活因子均具有２个功能上独立的结构域———ＤＮＡ结合结构域（ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎＢＤ）和ＤＮＡ激活结构域（ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎＡＤ），前者特异结合于顺式作用元件上，后者实施基因表达调控功能［３－４］，因此ＤＮＡ结合结构域和ＤＮＡ激活结构域就可以分开使用，单独的结合结构域或转录激活结构域都不能启动下游报道基因的表达。
酵母单杂交技术就是利用此原理构建各种基因与转录激活域融合的融合蛋白，只要转录激活域所融合的蛋白能与特异的ＤＮＡ序列结合，也就是说它能够扮演转录因子结合结构域的功能，那么就会形成有功能的转录因子，从而实施基因表达调控，激活启动子下游报道基因的表达。
人们用于酵母单杂交系统的酵母ＧＡＬ４蛋白即是一种典型的转录因子。
２酵母单杂交技术的操作步骤在实验过程中，首先要将报告质粒、文库和融合表达质粒同时转入酵母报告株，若文库所表达的某些蛋白能与设定的特异ＤＮＡ序列相结合，则这些融合蛋白就具有转录因子的活性，能够激活与顺式作用元件相连的最小启动子，使下游报道基因得以表达，并使酵母细胞在相应的ＳＤ缺陷性培养基上生长，并能对３－ＡＴ产生抗性［５－６］，然后提取报道基因表达的克隆株的质粒，转入大肠杆菌进行测序就可以获得这些蛋白（即能与特异ＤＮＡ序列相结合的蛋白）的ＤＮＡ序列。
酵母单杂交的原理和应用
酵母单杂交的原理和应用原理酵母单杂交是一种将两个酵母菌株或菌株中的两个基因进行互换的技术。
通过将两个酵母菌株或对应的基因进行交叉杂交，可以产生两个新的酵母菌株，这两个新的酵母菌株中具有不同的基因组，但仍保留了原始酵母菌株的某些特性。
酵母单杂交的原理可以分为以下几个步骤：1.找到两个酵母菌株中的亲本菌株。
亲本菌株通常是胞垢酵母菌株，其特点是易于培养和操作。
2.分别制备两个酵母菌株的孢子悬液，并将其混合在一起。
孢子悬液中含有酵母菌的基因，通过混合可以实现互相交换。
3.将混合后的孢子悬液进行萃取和培养，以获得新的酵母菌株。
在酵母单杂交中，通过杂交两个不同的酵母菌株，可以产生大量的变异体，这些变异体可以用来研究酵母菌的基因功能、代谢途径等方面的问题。
应用酵母单杂交在生物科学研究中有着广泛的应用。
以下是一些常见的应用场景：1.基因功能研究：酵母单杂交可以用于研究酵母菌株中的某个基因在生物过程中的作用。
通过杂交产生的变异体可以用来观察该基因在细胞周期调控、基因表达调控等方面的功能。
2.蛋白质相互作用：酵母单杂交也可以用于研究蛋白质之间的相互作用。
通过将两种不同的蛋白质基因进行杂交，可以观察到是否有相互作用的情况。
这对于研究蛋白质的结构和功能起着关键的作用。
3.药物筛选：酵母单杂交可以用于筛选新的药物靶标。
通过杂交产生的酵母变异体，可以将其暴露在不同的药物中，观察其对药物的敏感性和影响，从而筛选出具有治疗潜力的药物。
4.基因组学研究：酵母单杂交可以用于研究酵母菌株中的基因组组成和结构。
通过杂交产生的菌株，可以用来进行基因组重组、基因定位及测序等工作，从而深入了解酵母菌的基因组特征。
总之，酵母单杂交作为一种强有力的研究工具，广泛应用于生物科学领域。
它可以帮助研究人员深入了解酵母菌的基因功能、蛋白质相互作用及药物筛选等方面的问题，为生物科学的发展做出贡献。
结论酵母单杂交是一种重要的实验技术，它通过交换酵母菌株中的基因，产生新的变异体。
酵母单杂交
酵母单杂交酵母单杂交技术最早是1993年由Li等从酵母双杂交技术发展而来，通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。
由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生化手段难以纯化的特定转录因子。
酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。
其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD) 组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。
理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。
(百度百科)酵母单杂交法酵母单杂交体系(yeast one-hybrid system)常用于研究DNA-蛋白质间的相互作用。
酵母单杂交体系可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核DNA-蛋白质间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。
也可用于分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用。
酵母单杂交原理：将已知的顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter，Pmin)上游，把报告基因连接到Pmin下游。
将待测转录因子的cDNA与酵母转录激活结构域(activation domain，AD)融合表达载体导入细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件结合，而激活Pmin启动子使报告基因表达。
酵母单杂交体系主要用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能蛋白编码基因，验证反式转录调控因子的DNA结合结构域，准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。
酵母单杂交技术
酵母单杂交技术1．酵母单杂交的基本原理酵母单杂交技术是1993年由酵母双杂交技术发展而来的，其基本原理为：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA 结合结构域(DNA—bindingdomain，BD)和转录激活结构域(activationdomain，AD)。
用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。
在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。
据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。
酵母单杂交原理示意图2．酵母单杂交技术的特点酵母单杂交体系自1993年由Wang和Reed创立以来，在生物学研究领域中已经显示出巨大的威力。
应用酵母单杂交体系已经验证了许多已知的DNA与蛋白质之间的相互作用，同时发现了新的DNA与蛋白质的相互作用，并由此找到了多种新的转录因子。
近来，已有应用酵母单杂交体系进行疾病诊断的研究报道。
随着酵母单杂交体系的不断发展和完善，它在科研、医疗等方面的应用将会越来越广泛。
采用酵母单杂交体系能在一个简单实验过程中，识别与DNA特异结合的蛋白质，同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列，而无需分离纯化蛋白，实验简单易行。
由于酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象，克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而具有很高的灵敏性。
目前，多种酵母单杂交体系的试剂盒和相应的cDNA文库已经商品化，为酵母单杂交体系的使用提供了有利的条件。
酵母单杂交技术原理和步骤
酵母单杂交技术原理和步骤酵母单杂交技术是一种重要的遗传学工具，用于研究酵母细胞的基因功能和相互作用。
它的原理是通过将两个不同的酵母细胞株进行融合，使它们的细胞核融合在一起，形成一个杂合细胞。
这种杂合细胞具有两个不同的基因组，可以用来研究基因的表达和相互作用。
酵母单杂交技术的步骤如下：1. 选择两个不同的酵母细胞株作为杂交体。
这两个细胞株通常具有不同的突变性状，以便研究特定基因的功能。
2. 将这两个细胞株培养在适当的培养基中，使它们处于良好的生长状态。
3. 将两个细胞株的细胞分别取出，进行预处理。
预处理的目的是使细胞在杂交过程中更容易融合。
4. 将两个预处理过的细胞混合在一起，并进行高温处理。
高温处理可以破坏细胞壁，促进细胞核的融合。
5. 经过高温处理后，将混合的细胞进行适当的稀释和培养，以分离和培养杂合细胞。
6. 对形成的杂合细胞进行筛选和鉴定，得到所需的杂合株。
这通常涉及使用特定的培养基和选择筛选剂，以选择具有特定基因型的杂合细胞。
通过酵母单杂交技术，我们可以研究基因的功能和相互作用。
例如，可以通过杂交两个突变株，观察它们的杂交后代的表型变化，从而推断出这两个基因在酵母细胞中的相互作用关系。
此外，还可以使用酵母单杂交技术来筛选和鉴定与特定基因相互作用的蛋白质，从而揭示基因调控网络的复杂性。
酵母单杂交技术是一种重要的遗传学工具，可以帮助我们研究酵母细胞的基因功能和相互作用。
通过融合不同的酵母细胞株，形成杂合细胞，我们可以研究基因的表达和相互作用，揭示基因调控网络的复杂性。
这种技术对于理解细胞生物学和疾病机制的研究具有重要意义。
酵母单杂交的原理及应用
酵母单杂交的原理及应用1. 引言酵母单杂交是一种基因工程技术，通过将不同的酵母菌株进行杂交，实现基因的转移和重组。
这种技术在生物医药领域和食品工业等多个领域有广泛的应用。
本文将介绍酵母单杂交的原理，以及其在生物学研究和应用领域的具体应用。
2. 酵母单杂交的原理酵母单杂交是基于两个重要的生物学现象：酵母菌的性别和重组。
酵母菌是一种真核生物，有两种性别：雄性和雌性。
酵母菌的重组是指在有性生殖过程中，两个父本酵母菌的基因经过交换，重新组合成新的基因。
酵母单杂交的原理如下： - 首先，选择两个具有不同性别的酵母菌株。
- 将这两个株种分别培养在不同的培养基中，分别生成没有交配伴侣的单倍体细胞。
- 利用化学或物理方法将两种单倍体细胞融合在一起，形成杂交细胞。
- 将杂交细胞培养在适宜的培养基中，使其进行有性生殖。
- 在有性生殖的过程中，两个亲本酵母的基因进行交换和重组，形成新的基因组。
重组的结果可能是基因突变、基因删除、基因重复等。
- 通过筛选和鉴定，筛选出具有特定性状的酵母单杂交子代。
3. 酵母单杂交的应用3.1 用于基因功能研究酵母单杂交可以用于揭示基因的功能和相互作用关系。
通过将感兴趣的基因与其他酵母菌基因进行单杂交，可以确定该基因的功能和参与的生物过程。
此外，酵母单杂交也可以用于酵母基因组的大规模互作网络研究，帮助科学家理解复杂的生物调节网络。
3.2 用于疾病研究与药物筛选许多疾病与基因突变有关，通过酵母单杂交可以研究基因突变对蛋白质功能的影响，从而揭示疾病机制。
此外，酵母单杂交还可以用于药物筛选。
通过将药物与酵母菌基因进行单杂交，可以评估药物对基因的作用和效果，为新药的发现提供线索。
3.3 用于产酵母菌株的改良与优化酵母单杂交可以用于改良和优化产酵母菌株的特性。
通过筛选和鉴定具有特定性状的酵母单杂交子代，可以选择出高产酵母菌株或改良后的酵母菌株。
这对于酿酒、发酵食品和酶工程等产业具有重要意义。
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酵母单杂交技术（Yeast One-hybrid method）一、原理酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA）。
该方法也是在细胞内（in vivo）分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。
将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin)上游，Pmin启动子下游连接报道基因。
进行c DNA 融合表达文库筛选时，编码目的转录因子的c DNA 融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子）与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报道基因表达。
根据报道基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。
二、实验步骤①构建报道子载体：将已知的特定顺式作用元件按同一方向随机串联到一个最小启动子（minimal promoter，Pmin）上游，其下游连有报道基因；②将构建好的报道子载体转化酵母细胞筛选合适的3-AT浓度；③提取总RNA，合成c DNA双链；④将报道子、c DNA和融合表达载体共转化到酵母中，在相应的缺陷性SD培养基上进行筛选阳性克隆；⑤对阳性克隆进行鉴定，去除假阳性克隆；⑥对所获得的阳性克隆进行测序，为进一步分析打下基础。
如可进一步分析DNA确切的结合位点。
三、图片分析1、选择YM4271[ pHISi3NF4] 克隆株重复进行3-AT 梯度试验，在没有3-AT的SD/-His平板上生长状态很好，在15mM 3-AT存在下被明显抑制，而在30mM 3-AT存在下完全不能生长。
故选择15mM为筛库实验的3-AT工作浓度。
2、经9天培养，在SD/-Leu/-His/ +15mM[3-AT]选择培养基上共长出351个大小不同的阳性候选克隆。
取100个菌落划线于30mM 3-AT和60mM[3-AT]平板，仅有1个克隆被淘汰。
证实15mM[3-AT]的选择是正确的。
挑取阳性候选克隆菌落提取酵母质粒并转化E .coli Top 10F'后，酶切鉴定，共得到31个初筛阳性克隆。
四、严谨性分析1、为了克服His3基因的渗漏表达对筛库实验结果的影响，我们选择克隆株重复进行3-AT 梯度试验。
菌株在没有3-AT的SD/-His平板上生长状态很好，在15mM 3-AT下被明显抑制，而在30mM 3-AT下完全不能生长。
故选择15mM为筛库实验的3-AT工作浓度。
2、存在假阴性结果。
Pull-downs的原理、步骤、图片分析、实验严谨性原理：用固相化的、已标记的诱饵蛋白或标签蛋白（GST-、 PolyHis-或生物素-），借助蛋白质之间的亲和性，如酶与底物( 谷胱甘肽与谷胱甘肽转移酶) 或抗原与抗体(Myc蛋白与其抗体) 、细菌受体与血清蛋白、多聚组氨酸与金属离子等的亲和性，从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。
用以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。
步骤：Step1：从裂解液中固定化融合标记的“诱饵蛋白”Step2：洗脱未结合蛋白Step3：结合“猎物蛋白”到固定化的“诱饵蛋白”Step4：洗脱未结合蛋白Step5：洗脱蛋白质-蛋白质混合物Step6：通过SDS-PAGE或Western分析蛋白与蛋白的相互作用图片分析：图5是利用GST-Pull down技术检测HEK293T细胞中Daam1的活性，GST-RhoA融合蛋白起到“诱饵蛋白”的作用，“诱饵蛋白”能结合到带有谷胱甘肽的琼脂糖球珠上，带有活性Daam1的细胞裂解液经过琼脂糖球珠时会和GST-RhoA结合，进而挂在琼脂糖球珠上，经过洗脱去除其它杂蛋白，再经过高强度的洗脱把GST-RhoA+Daam1洗脱下来进行Western鉴定活性Daam1的存在。
第一行代表有活性的Daam1；第二行代表总的Daam1；GST列无条带表示：GST并不能与Daam1结合，从而排出假阳性的可能性。
GST-RhoA融合蛋白可以与Daam1结合，Western显示出条带，证实了Daam与GST相互作用。
加入GTPγS是为了活化RhoA，从而使其结合更多的Daam1进而提高整个系统的灵敏性和准确性。
实验严谨性分析：如果无GST条带，实验缺乏对照，如果Daam1也于GST结合，会对实验结果造成假阳性的结果。
如果无total Daam1条带缺乏内参对照。
备注：（文献中其他图）图1对于构建的表达载体插入的目的基因进行RCR鉴定，表明目的基因片段的存在。
图2 是对于编码RhoA的目的基因序列进行测序进而证实该基因正确的存在。
图3为GST-RhoA融合蛋白在大肠杆菌中的表达，通过考马斯亮蓝染色证实重组质粒在大肠杆菌中成功表达。
其中IPTG起到诱导RhoA蛋白表达的作用。
图4是对于重组蛋白GST-RhoA进行Western特异性检测，证实GST-RhoA在大肠杆菌中特异性、高水平表达。
表达载体构建1.获取目的基因从genebank中查询到海参溶菌酶基因（EF036468）原始序列，其247-684位是该序列的保守开放性阅读框（ORF）如下图：2.引物设计上游引物可从保守序列，即第247位开始选取连续的15-20个碱基，下游引物则从684位反向选取碱基（注意应为3的倍数，以避免移码导致阅读框的改变），估算两个引物的GC含量及Tm。
Tm可按以下公式估算：Tm=4（G+C）+2（A+T）。
一般Tm以55-80摄氏度之间为宜，GC含量在40%-60%之间。
引物的5端可以进行修饰，而3端不可修饰，这是因为DNA的合成是从5端向3端进行的。
因此引物的3端碱基序列应尽量与模板互补配对，尤其是最后的5到6个核苷酸序列。
此外，由于天然的原核表达载体上只有一个启动序列，为保证目的基因后的报告基因能正常表达，故引物的3端必须去除终止密码子，避免重组载体的蛋白表达停止。
5端可根据需要选择合适的酶切位点进行修饰编辑（目的基因应不含有该酶切位点）。
为了确保其酶切的特异性，可加入保护碱基，但要注意引物的长度不能过大，而使退火温度过高。
保护碱基的添加有专门的保护碱基对应表，可根据不同的酶切位点选择合适的保护碱基。
其他注意事项包括避免出现大量重复碱基、3端最后5个碱基不能出现多于2个G或C、避免出现同源二聚体、错配等等，引物设计完之后可进行Blast比对。
无误后引物合成。
3.PCR扩增目的基因4.琼脂糖凝胶电泳跑出条带后胶回收。
5.提取质粒6.对质粒和目的基因进行酶切和连接注意将目的基因连接在启动子/启动序列之后7. 鉴定一般包括：重组质粒的测序、双酶切的鉴定等。
酶活测定—分光光度法12、3、4、注意事项：一、 合适的底物，辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度1、 底物：对待测酶有较高的特异性；Km 值小，以使Vmax 时的底物浓度低，降低试剂成本，防止出现底物难溶现象；底物浓度合适，多数酶Km 在10-3—10-5 mol/L ，底物浓度最好为Km 的20—100倍，一般不可低于10倍2、辅因子、活化剂的种类和浓度：如辅酶、辅基、离子以及其他加速酶反应的物质3、变构剂的种类和浓度：边沟没的反应速度和底物浓度呈S形曲线，变构剂分为变构激活剂和变构抑制剂，影响变构酶和底物的作用速度，不同浓度的变构剂改变曲线的形状，测变构酶活性浓度时，一般在饱和浓度的变构剂的条件下进行二、选择酶最适反应系统1、缓冲体系的pH：最适pH时，V最大2、离子种类和强度3、温度4、其他影响酶活的因素：氧化剂，氧化酶蛋白中的甲硫氨酸、络氨酸、色氨酸残基使酶失活）；表面活性剂（Tween-80、Brig-35），抑制酶活；抑制剂三、确定反应时间选用产物生成与反应时间呈线性关系范围内的时间点为测定选用的时间四、酶液稀释度对酶活测定的影响稀释可能降低酶的稳定性，降低样品中原有抑制因素和辅因素的浓度，而且许多酶活力和稀释倍数成正比。
酶分子与底物分子的数量比列中有在适当的范围内时酶的活力与产物生成才成线性正比例关系。
稀释倍数过大影响酶的稳定性，A值过小结果偏低；稀释度低，吸光度太大，使结果大大偏低。
应使吸光值在0.2-0.5之间可得相对稳定的测定结果。
五、标准曲线制作时尽可能和样品在同一条件下反应，以减少系统误差。
吸光值和产物应为线性关系范围，酶样测定值在线性范围内。
六、显色剂的配制对酶活测定的影响显色剂的类型，其中各物质的配比、在反应中的添加量、显色时间七、对照系统设置对照体系，排除系统中非酶因素干扰，保证测定值的准确性。
离子交换层析分离纯化未知蛋白原理：离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。
由于是未知蛋白，蛋白质的电荷性质、等电点和分子量等都是未知的，因此离子交换剂的选择和与缓冲液pH值的选择都需要探究。
1、离子交换树脂的选择依据被分离物质的性质和分离目的，保证分离目的物与主要杂质对树脂的吸附力有足够的差异。
一般而言：酸性物质用阴离子交换剂分离，碱性物质用阳离子交换剂分离。
类型包括：阴、阳离子交换树脂、强离子交换树脂和弱离子交换树脂；层析时液相流速要适中，让蛋白有足够的时间吸附在树脂上；树脂吸附容量在10%-20%，一般选用强离子交换树脂，它能够提供更好的重现性。
2、缓冲液pH值的选择首先未知蛋白不能与缓冲液发生反应，其次是确定蛋白质等电点，最常用的方法是等电聚焦电泳。
通过氨基酸序列推测出的等电点常与表观等电点相差一个单位。
当蛋白质因不纯而不能进行等电聚焦电泳时，要确定溶液PH值得简单方法步骤如下：（1）在九个试管中各放入1ml阴性离子交换树脂（如DEAE Sepharose CL-6B）（2）用10ml 0.5mol/L，pH值为5.0的缓冲液润洗一号试管10次后；加入含10mmol/L NaCL的缓冲液平衡树脂。
二号试管以pH值为5.5的缓冲液同法处理；以后各试管所用缓冲液pH值依次增加0.5个单位。
（3）去掉多余缓冲液，保证各试管中缓冲液高出树脂量为1ml。
（4）向各试管中加入100ul蛋白质溶液。
（5）混匀试管中物质，放置几分钟。
（6）检测上清中是否存在目的蛋白。
（7）上清中不存在目的蛋白就是所需PH 。
3 装柱先把柱内装满起始缓冲液，用玻璃棒挤压海绵，赶尽气泡并把柱子垂直固定;将交换剂用起始缓冲液调稀搅匀后加入，柱内的交换剂应非常均匀地分布，不应出现节面和气泡，不能干柱，床面要平整，床高距柱顶2～3cm为宜。
4 平衡缓冲液平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。
平衡缓冲液的离子强度和pH值的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。
其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。