下一代测序工作流程自动化
分析下一代DNA测序技术的优缺点并比较
分析下一代DNA测序技术的优缺点并比较近年来，基因测序技术取得了快速发展，其发展速度远高于摩尔定律规律。
第一代测序技术“链终止法”虽然技术成熟，但其高成本和低效率限制了其广泛应用。
随着第二代测序技术的出现，基因测序不断向着高通量、高准确度和低成本的方向发展。
本文将分析下一代DNA测序技术的优缺点并比较，希望为读者提供更多的技术资讯和了解。
一、下一代DNA测序技术的优点1. 高通量：下一代DNA测序技术具有高通量的特点，可同时对一个物种或个体的全基因组进行快速测序，达到高通量基因组测序的目标。
这种高通量使得科学家可以在较短时间内提取大量基因信息。
2. 快速速度：下一代DNA测序技术具有极高的速度，一晚上可以测序数千万条序列，并在几个小时内将结果生成和分析。
这种快速速度使得科学家可以在更短的时间里完成大量的测序工作，为基因组研究提供了更强大的工具。
3. 高准确度：下一代DNA测序技术具有很高的准确度，一般达到99.9%或更高。
这种高准确度使检测结果更加准确，从而更好地发现细微的变化或突变。
4. 低成本：下一代DNA测序技术的成本相对较低，能够快速进行测序并且价格低廉，使得大规模的测序在实践中得到了广泛的应用。
二、下一代DNA测序技术的缺点1. 数据分析困难：下一代DNA测序技术获得的数据量大，处理数据的复杂性也增加。
因此需要使用计算机等自动化工具进行数据分析，但是这些应用需要更高的计算能力和存储容量，而且也需要高水平的数据分析人员。
2. 测序误差率高：虽然下一代DNA测序技术具有很高的准确性，但由于基因数据量惊人，在处理过程中仍存在一定误差。
虽然这些误差比较小，但是在分析工作中仍然可能影响结果。
因此需要运用质量控制等手段来保持数据的准确性和可靠性。
3. 长序列难以获得：虽然下一代DNA测序技术能够产生大量序列，但其获得的序列长度均较短，通常只有较短的几百个碱基。
由于每个基因组都包含大量的重复序列和复杂序列，这些情况可能导致测序效率低，难以覆盖全部基因组情况。
下一代测序技术简介ppt课件
PPT学习交流
27
各个测序平台的特点总结
ABI SOLiD
1. 无以伦比的通量 目前SOLiD 3系统单次运行能产生50 GB的人基因组序列数据，相当于基因组的
PPT学习交流
15
Illumina测序原理 Illumina合成测序原理
PPT学习交流
16
Illumina测序流程
PPT学习交流
17
桥式PCR
PPT学习交流
18
合成法测序
PPT学习交流
19
数据读取
PPT学习交流
20
ABI SOLiD测序原理 ABI SOLiD连接测序原理
PPT学习交流
21
PPT学习交流
7p的PCR引物、20bp的测序引物及4bp（TCAG）的“key”碱基构成，其中B接头 的5’端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化步骤。
PPT学习交流
的颜色信息连起来，就得到由“0，1，2，3…”组成的SOLiD原始颜色序列。
PPT学习交流
26
各个测序平台的特点总结
Roche 454
454平台的突出优势是读长。目前454系统的序列读长已超过400 bp。虽然454平 台的测序成本比其他平台要高很多，不过对于那些需要长读长的应用，如从头拼 接和环境微生物组学，它仍是最理想的选择。
PPT学习交流
9
Roche 454测序步骤 四、emRCR
PCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用于 后续的步骤。
呼吸道疾病的病原体检测与鉴定技术
呼吸道疾病的病原体检测与鉴定技术随着呼吸道疾病在全球范围内的流行和威胁不断增加，对于准确、快速地确定病原体的检测与鉴定技术变得越来越重要。
病原体检测与鉴定技术是指通过分析病患的样本，确定其体内所携带的病原微生物的方法和技术。
本文将着重探讨呼吸道疾病的病原体检测与鉴定技术，包括传统方法和现代技术。
一、传统方法1. 细菌培养法细菌培养法是最早用于病原体检测与鉴定的方法之一。
它通过将样本在适宜培养基上进行培养，观察和鉴定生长的细菌。
这种方法虽然具有准确性较高的优势，但需要较长时间来等待细菌的生长，通常需要2-3天或更长的时间才能得到结果。
此外，细菌培养法对于不易培养的病原体无法应用，因此在呼吸道疾病的病原体检测中应用较少。
2. 核酸扩增技术（NAT）核酸扩增技术，包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR （qPCR），是一种常用的病原体检测与鉴定方法。
它们通过扩增和检测目标基因的特异性序列，来确定病原体的存在。
相对于传统细菌培养法，核酸扩增技术具有更高的灵敏度和更短的检测时间。
但是，核酸扩增技术对于操作人员技术要求较高，且在样品处理过程中容易出现污染，可能导致假阳性结果。
因此，在实际应用中需要科学严谨地操作。
二、现代技术1. 基因芯片技术基因芯片技术，也称为DNA芯片技术，是一种高通量的病原体检测与鉴定方法。
它通过将大量的寡核苷酸探针固定在玻璃或硅片上，同时与样本中的DNA进行杂交反应，从而检测和鉴定多种病原体。
基因芯片技术具有高度的自动化和高通量的优势，可以同时检测多种病原体，并且在检测过程中不需要特殊的操作技巧。
但是，由于芯片设计和制备的技术难度较大，以及较高的成本，使得该技术在一般实验室中应用较为有限。
2. 下一代测序技术下一代测序技术，也称为高通量测序技术，是近年来快速发展的一种病原体检测与鉴定方法。
它通过对待检样本中的DNA或RNA进行高通量测序，从而获得样本中所有的基因组序列信息，并通过比对分析确定其中的病原体。
基于下一代测序(ngs)的方法
基于下一代测序(ngs)的方法一、概述随着生物科技的不断发展，下一代测序(ngs)技术已经成为生物学和医学研究中不可或缺的工具。
ngs技术不仅在基因组学和转录组学研究中发挥作用，还在临床诊断、药物研发和农业领域得到了广泛应用。
本文将介绍ngs技术的原理、方法和应用，并对其在科研和生产中的重要意义进行探讨。
二、ngs技术的原理ngs技术是指通过一种高通量且快速的测序技术，能够将一整个基因组或基因的整个DNA序列迅速测序出来。
ngs技术的原理主要包括如下几个步骤：1. DNA样本准备：首先需要从生物体中提取DNA样本，然后进行纯化、裂解和浓缩处理，以得到适合测序的DNA片段。
2. 文库构建：将DNA片段与适当的测序引物连接，并进行适当的化学修饰和标记，形成测序文库。
3. 测序评台：ngs技术主要使用Illumina、Ion Torrent、PacBio等测序评台。
这些评台能够通过不同的测序方法，如Illumina的桥式扩增和PacBio的单分子实时测序，实现高通量的DNA测序。
4. 数据分析：测序后需要对产生的原始数据进行质量控制、序列比对、拼接、注释等一系列数据分析，最终得到DNA序列的组装和注释结果。
三、ngs技术的方法ngs技术主要包括以下几种方法：1. 全基因组测序(WGS)：通过对整个基因组的测序，可以获得生物体所有的基因型信息，包括基因突变、拷贝数变异、染色体结构变异等。
2. 转录组测序(RNA-seq)：通过对转录本的测序，可以获得生物体特定时期和组织中基因的转录水平信息，识别基因表达水平的变化和RNA剪接异构体。
3. DNA甲基化测序：通过对DNA甲基化位点进行测序，可以获得生物体中DNA甲基化的信息，揭示DNA甲基化与基因表达调控、疾病等之间的关系。
4. 蛋白质-DNA相互作用测序(ChIP-seq)：通过对转录因子、组蛋白与DNA相互作用的测序，可以获得生物体中蛋白质与DNA结合的信息，揭示基因表达的调控机制。
高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用
注意事项：
1. mNGS检测申请表：mNGS检测实验室应提供适临床使用的申请表。除患 者基本信息外，申请单应包括标本类型、拟诊、现病史、既往史、流行病学 史、关注的病原体、抗菌药物使用史等。另外，申请表中应列出不同测序项 目及适用范围供医生选择。
2.靶向基因测序：基于高通量测序技术的病原微生物检测，除无偏倚的 mNGS外，还包括原核生物的16S rRNA基因、真菌（5S rRNA基因两端的 ITS1、ITS2及25-28S rRNA基因中的D1及D2区等）以及特定病原微生物靶基 因等。如怀疑沙眼衣原体可选momp（主要外膜蛋白基因），怀疑结核分枝 杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）可选rpoB等靶向基因测序。
高通量宏基因组测序技术检测 病原微生物的临床应用
一、概述
快速准确的微生物鉴定技术始终是临床微生物关注的焦点。传统微生物检 验，诸如形态学、培养、抗原抗体及靶向核酸检测等方法在解决疑难及未知 病原微生物上存在局限性。
新型宏基因组下一代测序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS） 技术直接针对样本中所有核酸进行无偏性测序，结合病原微生物数据库及特 定算法，检测样本中含有的可能病原微生物序列。
8. 提高测序深度：mNGS常规数据量对耐药和毒力基因检测有局限性，因其 得到的微生物序列数不足样本总序列的5%，特异性序列覆盖度不到微生物 基因组1%，在这种情况下进行耐药基因、毒力岛基因、转录组及代谢通路 分析几乎不可能。目前，有以下几种做法可提高测序深度：（1）在常规测 序深度下已明确了病原微生物，再提高测序数据量至可覆盖该物种基因组 80%，但花费巨大不适合普及。（2）在宏基因组基础上叠加固定的若干种 耐药基因进行靶向测序。（3）研发降低人源核酸比例的创新方法，获得更 多微生物测序数据量。
二代自动化测序仪工作的基本原理
二代自动化测序仪工作的基本原理
二代自动化测序仪工作的基本原理包括以下几个步骤：
1. 文库构建：首先需要将待测样品的DNA（或RNA）进行处理，并通过反转录和PCR等技术构建出文库。
文库中包含了待测样品中DNA（或RNA）的片段，每个片段都带有特定序列，以便在测序过程中进行识别和定位。
2. 模板制备：将文库中的DNA片段进行扩增，以产生大量的DNA模板。
这通常通过PCR技术完成。
3. 测序循环：将DNA模板固定在测序仪的载体上，形成DNA团簇。
接着，利用碱基扩增技术，将其中一种碱基（如A、T、C或G）的昏暗其余更多地出现在同一位置，形成"密集区"。
接下来，通过导入测序仪的碱基固定位于测序仪的平板上，使它们与DNA团簇中的DNA片段相互匹配。
4. 图像捕捉与信号分析：测序仪会拍摄DNA团簇的图像，记录下碱基的顺序及其对应的荧光信号。
然后通过图像处理和信号分析，确定每个碱基对应的信号，从而得到DNA片段的序列信息。
5. 数据处理与序列重建：对得到的图像和信号进行数据处理，如去除噪声和校正，然后利用计算算法来重建DNA片段的完整序列。
通过以上步骤，二代自动化测序仪可以高通量、快速和准确地获取DNA（或RNA）的序列信息，从而广泛应用于基因组学、转录组学、表观基因组学等领域的研究和应用。
研究生-测序
4. 转录组和表达谱分析: 对细胞内所有mRNA进 行测序, 分析mRNA序列数量判断基因表达, 分 析同一基因的不同转录本以及基因突变
5. 小RNA研究: Solexa/SOLiD测定片段30-50 bp正 好涵盖小RNA (18-40 nt) 范围, 已采用Solexa技 术发现新的小RNA
40,000,000 1,280,000,000
59
Cost per run Total cost
$
48 $
6,800 $
9,300
$15,000,000 $ 2,448,000 $ 544,922
第一代
第二代
第二代测序的三种技术
1. Roche 454 GS FLX: 焦磷酸测序 (pyrosequencing), 乳液PCR (emulsion PCR)
第三代测序（单分子测序）技术： Pacific Biosciences (2011?) SMRT sequencing etc… Many…
第一代测序技术 Sanger法
原理： 1. DNA polymerase作用下的引物延伸 2. 特异性的链终止 3. 可区别单碱基长度的变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳（PAGE）
2. Illumina Solexa GA: reversible terminator 以上为基于合成的测序(sequencing by synthesis,
SBS) 技术 3. Appled Biosystems SOLiD: 基于连接的测序
(sequencing-by-ligation), 乳液PCR
第二代测序的基本流程
基因组二代测序数据的自动化分析流程
01 一、引言
目录
02 二、流程介绍
03 三、数据分析
04 四、结果解释
05 五、注意事项
一、引言
一、引言
基因组二代测序技术是一种高灵敏度、高分辨率的DNA测序技术，能够快速地 检测基因组的变异和表达。随着二代测序技术的不断发展，产生的数据量也越来 越大，因此需要一种自动化分析流程来高效地处理和解析这些数据。自动化分析 流程包括数据预处理、序列比对、变异检测、基因注释等多个步骤，可以大大提 高分析效率，减少人工操作成本，降低错误率，促进数据标准化和可重复性。
3、参数设置：自动化分析工具通常有很多可调整的参数。正确的参数设置可 以提高分析的准确性，因此需要对参数进行仔细的调整和优化。
谢谢观看
三、数据分析
此外，可视化也是数据分析中重要的一环。通过将数据以图表、图像等形式 展示出来，可以更直观地观察数据的特征和分布，更好地发现和理解数据中的模 式和趋势。常用的可视化工具包括R、Python等编程语言的绘图库，如ggplot2、 Matplotlib等。
四、结果解释
四、结果解释
自动化分析结果的解释是整个流程中至关重要的一步。结果的解释需要结合 实际实验条件、生物背景知识和文献报道来进行。例如，对于基因变异的结果， 需要了解变异的类型、位置及其可能的影响；对于基因表达结果，需要了解表达 量的变化及其与疾病或表型特征的关系等。
3、代码实现
3、代码实现
自动化分析流程通常由一系列脚本和程序组成，实现各个步骤的自动化运行。 例如，可以使用Python或Shell脚本调用不同的软件工具，进行数据预处理、比 对、变异检测和基因注释等步骤。还可以使用一些现有的集成工具，如Galaxy、 AnnoBin等，以便更方便地进行自动化分析。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
下一代测序（NGS）彻底改变了基因组学研究领域，使全基因组测序比以往任何时候都更有效率。
然而，典型的NGS工作流程是鲜有革新的，因为它面临许多手动操作步骤和来自成本、通量以及结果变异性的诸多挑战。
传统的样品制备和数据分析方法非常耗时，并更易出错。
针对这些挑战，自动化技术为此提供了相应的解决方案，并通过减少样品间变异提高了最终数据的精准度。
然而，为您的NGS工作流程选择适合的自动化设备是一个复杂的过程。
为了给您的实验室配备最佳的自动化整合系统，首先要对以下的四个因素进行评估，然后再作出决定：
• 自动化将如何影响您的实验流程？
• 您可选的自动化方案有哪些？
• 需要多少培训？
• 您的自动化解决方案是否需要扩展，以满足未来的需求？
杂交(DNA + RNA)磁珠预洗Ilumina 文库构建
杂交选择和靶向捕获
DNA 样品簇扩增和测序
Picogreen 质量控制步骤杂交
（DNA + RNA ）
磁珠预洗Ilumina 文库构建
杂交选择和靶向捕获
DNA 样品簇扩增和测序
Picogreen 质量控制步骤
图3，高通量PCR纯化自动化工作流程
您是否在纯化时使用真空泵和离心过滤？图3描述了一个中高通
进一步加速：靶标富集技术
量的自动化工作流程图。
基于磁珠技术的靶标富集方法，比如SureSelect靶标富集
试剂盒和SureSelect人全外显子试剂盒，能使您仅对感兴
趣的基因片段测序，提高了几个数量级的实验效率。
这些操
作很容易实现和高度扩展，凸显出Bravo自动化液体处理
平台的速度和精度的优势。
如果您的实验室需要更高的通量，您可考虑增加一个更全面的自动化系统。
安捷伦BenchCel 微孔板工作站是一个灵活的、可扩展的、通量可媲美大型系统的紧凑桌面式平台。
由市面上最灵活和调度高效的安捷伦VWorks 软件控制，BenchCel 工作站可用于复杂的和简单的应用流程，比起传统的手动操作方法能提供更长的无人值守时间和更大的通量。
对于超高通量、高生产率的实验室，您可能需要放弃桌面型系统。
安捷伦独立的BioCel 自动化系统基于一个易于定位的直驱机械臂(DDR)。
这种高度灵活的系统能与安捷伦其它自动化模块，或第三方设备组合形成定制系统，以满足您实验室的需要。
自动化方案的选择
想一想您实验室的整个工作流程。
有各种不同的自动化解决方案——从垂直移液工作站到BenchCel 工作站再到BioCel 系统，可以满足不同的通量需求。
自动化将提高实验数据的准确性和一致性——您是否需要一个完全无人值守的自动化解决方案？安捷伦拥有一系列的自动化设备可供选择，以适应不同实验室的需要。
安捷伦的Bravo 自动液体处理平台具有宽量程的高精度移液性能、兼容不同类型微孔板的灵活性以及独特的开放式设计，易于整合到其他的自动化工作流程中。
结合Bravo 自动化液体处理平台可以大大减少样品制备和检查下一代测序文库质量所花费的时间，并通过减少样本间变异提高了数据质量。
图4.
桌面型选择：
A ．Bravo 自动化液体处理平台
B ．BenchCel 微孔板操作工作站独立的高通量系统：C. BioCel
系统
A
B
C
需要多少培训？
像Bravo自动化液体处理平台一样的单个设备操作起来非常简单和直接。
但是，如果您有多个自动化设备（如机器人，液体处理器，读板机，洗板机和其他），您需要考虑精通这众多设备所需的时间。
软件和设备菜单容易理解吗？所有的自动化设备是否会一起相互配合工作？
图5. 安捷伦VWorks：最强大和灵
活的工业自动化控制软件，执行工
作流程不可或缺的重要组成部分安捷伦VWorks自动化控制软件是整合您的自动化设备的核心。
直观的图形用户界面简化了新操作程序的创建、连接和设备设置、程序运行，并进行操作进展的监测。
您实验室中有了这样一个可扩展的动态软件意味着当您扩展成复杂的设备网络时可以减少培
训成本并最大化生产效率。
您的自动化解决方案是否需要扩展，以满足未来的需求？
您现在的需要是什么，一年之后又会是什么？安捷伦自动化解决方案的设计具备可扩展性，通过VWorks 自动化控制软件能轻易的运行10台仪器就像是运行一台一样。
Bravo 自动化液体处理平台和BenchCel 工作站均是专门针对扩展性而设计的。
A. Bravo 自动化液体处理平台：多功能的设计
开放式设计便于在层流罩中使用
快速更换式移液头
夹钳使自动化更灵活
快速，小巧，安静的操作，Bravo 自动化液体处理平台具有一流的精度和
准确度，并且在台板底部没有电子元件可根据您的工作流程需要进行扩展。
BenchCel 工作站既适用于复杂应用又适用于简单应用，与传统的手动操作相比能提供更长的无人值守时间和更高的通量
扩展成 BioCel 处理更多板（侧顶视图）。
新的直驱机械臂给BioCel 系统带来速度和精准度，既价格适中，又易于扩展。
采用模块化小室、各种可选罩和环境控制部件，BioCel 系统根据您的工作需要量身定做，并提供比任何整合系统都长的无人值守时间和更高的通量
C. BioCel 系统：最高通量和完全的无人值守
图 6.
满足不同通量的需求：
A. Bravo 自动化液体处理平台
B. BenchCel 微孔板工作站
C. BioCel 系统
B. BenchCel 工作站：高容量的体现
• 减少样品处理时间• 降低样品间差异
• 和手动方法相比增加了产量
• 每个技术员的处理量从12 个样品提高到了96个样品
生命科学中的实例应用：Broad 研究所
Broad 研究所是世界领先的基因组研究机构之一。
在评估了三家制造商的液体处理系统后，考虑到其精小尺寸和加载枪头便利的因素，该研究所最后选择了Bravo 自动化液体处理平台。
使用一个靶向富集的自动化工作流程（图7），每台测序仪的测序能力从每年大约1000个提高到每年超过10000个，同时还获得了许多其他的益处，包括：
图7. Broad 研究所中富集文库的建立流程示图
用二维条码样品管中记录样品文库标记用Covaris 进行文库剪切
Bravo 上双面SPRI 文库片段大小选择
文库建立和纯化——输出：富集的样本富集文库标记
PCR 富集，管板转移，
qPCR 定量
基于定量PCR 数据的文库标准化
标准化文库标记
Flowcells 的建立
更多信息，请访问：
/lifesciences/automation:cn 查找当地的安捷伦客户中心：
/chem/contactus:cn
安捷伦客户服务中心：
免费专线：800-820-3278 400-820-3278（手机用户）联系我们：customer-cn@
在线询价：/chem/quote:cn 安捷伦科技大学：
/university 浏览和订阅Access Agilent 电子期刊：/chem/accessagilent:cn
本资料仅供研究参考，不可用于诊断。
本资料中涉及的信息、说明和指标，如有变更，恕不另行通知。
安捷伦对本资料中出现的错误，以及由于提供或使用本资料所造成的相关损失不承担责任。
© 安捷伦科技（中国）有限公司，2010中国印刷2010 年6月10日5990-5876CHCN
选择安捷伦
在安捷伦，我们充分理解上述四个关键因素的重要性，并且我们已经将每一点作为我们自动化解决方案平台设计的核心目标。
我们从一开始就以通过ISO 认证的质量标准要求来开发测试我们所有的自动化解决方案流程。
除了经过验证的机器和兼容的耗材和配件，我们还提供您需要的专业知识，以确保您的工作得到最佳结果。
安捷伦自动化解决方案都是由知识渊博的科学家作技术支持，他们可以为您的特殊应用提供有针对的支持和服务。
当您准备自动化您的下一代测序，请考虑安捷伦的自动化产品。
如果您有任何关于您实验室自动化最佳选择的问题，请与您的安捷伦代表谈谈如何简化并加快您的NGS 工作流程。
应用手册
了解自动化如何应用在下一代测序实验室中。
1. 在安捷伦Bravo 自动化液体处理平台上应用Agencourt AMPure 纯化试剂盒进行下一代测序样品制备的自动化纯化(5990-4942EN)
2. Stratagene Absolutely RNA 96 孔板微量提取试剂盒与Bravo 自动化液体处理平台联合应用(5990-3558CHCN)
3. 在安捷伦Bravo 自动化液体处理平台上实现全自动化的定量聚合酶链反应分析（5990-4522EN ）
4. 在Bravo 自动化液体处理平台上实现CGH/CNV 工作流程自动化(5990-4660EN)。