实验六细胞计数及活力测定
实验6 细胞计数及活力测定
【实验原理】
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。
用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。
【实验目的】
1．练习进行细胞计数，并用细胞计数法绘制生长曲线，以了解培养细胞的生长发育特性。
2．掌握测定细胞活力的方法。
【仪器、材料与试剂】
1．仪器：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计）。
2．材料：细胞悬液。
3．试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇
【操作步骤】
1．细胞计数
①将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。
②将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。
③静置3分钟。
④镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
2．细胞活力
①将细胞悬液以0.5ml加入试管中。
②加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。
③吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。
④镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。
死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外，活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。
3．MTT法测细胞相对数和相对活力
活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。
①细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。
②沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。
③37℃下保温2小时。
④加入4—5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。
⑤1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。
注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。
附：
1．0.4%台盼兰染液配制：台盼兰0.4克加双蒸水至100 ml。
2．MTT配制：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4℃下保存。
3、酸化异丙醇配制：异丙醇中加入HCl使最终达0.04mol/L。
【注意事项】
1．细胞计数时的注意事项
①消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液。否则会影响细胞计数结果。
②取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤应注意这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。
③镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计数。如细胞团占10%以上，说明消化不充分。
④细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。
⑤在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液时，加液量不要溢出盖片，也不要过少或带气泡。
⑥在计数过程中，对大方格的边缘压线细胞应按数上不数下，数左不数右的原则进行计数。
2．MTT法的原理是测定细胞线粒体琥珀酸脱酶的活性，反映的是细胞代谢和增殖活力，而非绝对的细胞数量。
【实验报告】
1．根据实验结果，画出生长曲线。
2．试述用MTT法测定细胞生长曲线的过程及注意事项。
【思考题】
1．细胞接种的密度与细胞生长曲线的测量结果之间有什么关系？
2．为什么细胞计数时，细胞悬液逸出槽外时要重做？
实验一红细胞计数
实验一红细胞计数 一、实验目的： 掌握红细胞计数原理及技术。 二、实验原理： 用等渗稀释液将血液稀释一定倍数，充入计数池中，于显微镜下计数一定体积内的红细胞数，经过换算示得每升血液内的红细胞数。 三、实验器材及试剂： 显微镜、血红蛋白吸管、计数板、盖玻片、生理盐水。 四、实验操作： 1、取试管1支，加稀释液3.98ml或1.99ml。 2、用清洁干燥的微量吸管准确吸取末梢血10微升。 3、擦去管尖外部余血、轻轻注入红细胞稀释液底部，再吸取上层稀释液清洗吸管2-3次，立即摇匀。 4、将计数池与盖玻片用软布料擦净，将盖玻片覆盖于计数池上。 5、用吸管吸取混匀的红细胞悬液，充入计数池中。 6、静止2-3分钟，待经红细胞下沉后，用高倍镜或低倍镜计数中央大方格内四角和正中五个中方格内的红细胞数。 五、计算 N(五个中方格内RBC数)×5×10×106×200=N×1012个/升 ×5：表示5个中方格内RBC数换算为1个大方格内RBC数 × 10：1个大方格容积、0.1ul、换算为1ul内RBC数 × 106：1ul换算为1升内红细胞数 × 200：稀释倍数 六、正常参考值 正常参考值：成年男性：4.00-5.50×1012/升 成年女性：3.50-5.00×1012/升 新生儿： 6.00-7.00×1012/升 实验二血红蛋白测定 一、实验目的： 掌握氰化高铁血红蛋白比色法原理及技术。 二、实验原理： 血液在血红蛋白转化液中溶血后，除SHb外各种血红蛋白可被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白，再与CNˉ结合生成稳定的棕红色氰化高铁血红蛋（HicN）。 HicN最大吸收峰540nm，最小吸收波谷504nm，在特定的条件下，毫摩尔消光系数为44L.mmol-1 .cm-1 ，因此根据标本的吸光度，即求得血红蛋白浓度。 三、实验操作： 1、取指血20ul，加到5ml血红蛋白转化液中，混匀，静止5分钟。 2、用分光光度计比色，波长540nm，以蒸馏水或空白转化液调零，测定吸光度。 3、用血红蛋白浓度为50g/L、100g/L、150g/L、200g/L在721型分光光度计上测定吸光度分别为0.13，0.27，0.405，0.54. 四、计算:血红蛋白（g/L）=测定管吸光度×367.7
细胞计数
每代细胞的生长过程： ①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。持续 10分钟一4小时 ②贴壁期：细胞附着于底物上，细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。 ③潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。 ④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 ⑤停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度抑制 细胞是否处于对数生长期并不是以数量来定的，一般接种数量多，潜伏期相对会缩短一些，反之，潜伏期会稍长。并且不同细胞潜伏期是不一样的，故建议最好在实验以前做一下生 长曲线 细胞生长状况的观察 1.细胞计数 （1）［概述］ 细胞计数法是细胞培养研究中的一项基本技术，它是了解培养细胞生长状态。测定培 养基、血清、药物等物质生物学作用的重要手段。常用的细胞计数有血球计数板计数 法和电子细胞计数仪计数法。 （2）［用品］ a）血球计数板，巴氏吸管。 b）0. 25%胰蛋白酶溶液，无血清培养液。 c）显微镜。 （3）［步骤］ a）准备计数板：用无水酒精或95%酒精清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻 拭干。 b) 制备细胞悬液：用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞，制成单个细 胞悬液。本法要求细胞密度不低于104/ml，若细胞数很少，应将悬液离心(1000rpm， 5 min)，重悬浮于少量培养液中。 c) 加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微 量细胞悬液，加样时不要溢出盖玻片也不能溢入两侧的玻璃槽内，如果产生上述情况 需对计数板冲洗和拭干后重新加样，加样量也不要过少或带气泡。 d) 计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。 e) 计算：将计算结果代入下式，得出细胞密度。
生理实验报告2红细胞计数
红细胞计数 一、实验目的： 学习、掌握应用稀释法计数红细胞的方法 二、实验原理： 1．血液中血细胞数很多，直接计数有一定难度，需要将血液稀释到一定倍数，然后用血细胞计数板计数。 2．在显微镜下计数一定容积的稀释血液中的红细胞，之后需要将其换算成每升血液中所含的红细胞数。 三、实验用品： 器具：显微镜、血细胞计数板、小试管、采血管、1mL和5mL移液管、玻璃棒、刺血针、干棉球 试剂：哺乳动物红细胞稀释液、蒸馏水、75%酒精 四、实验方法与步骤： 1．采血 2．稀释：用移液管取10微升血液，加至2mL红细胞稀释液中3．充池：将盖玻片的一边与计数池的纵线末端接触，然后缓慢放下，使盖玻片平放在计数室两侧的隆起上，醮少许红细胞稀释液靠近盖玻片乾元，靠毛细管作用将稀释液冲入计数池，于高倍镜下观察红细胞分布情况 4．静置计数板2~3min 待经红细胞下沉后，大方格四角以及中央取5个4×4中方格红细胞数，用高倍镜或低倍镜计数
5．计数，计算 注意事项： 1.保证计数板和盖玻片清洁；以防影响计数结果的准确性。 2.一次完成充池，如充池过少、过多、有气泡或出现任何碎片，应拭净计数板及盖玻片后重新操作。 3.充池后平放计数板，不能移动盖玻片。 4.计数板中细胞如果严重分布不均，应重新充池计数。 5.凡压线的细胞应按照数上不数下、数左不数右的原则，避免漏数或重复计数。 五、实验结果观察与记录以及分析： 1．结果计算：（53+113+76+60+64）/5=73.2 每16格平均73.2个红细胞,红细胞数： 73.2×25×200×10×1000000=3.66×10的12次方个／升 2．显微镜下图片 ①空白计数板： 低倍镜：
细胞增殖及细胞活力检测方法
细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，
所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。 图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书） 在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一
微生物大小与数量的测定实验报告
山东大学实验报告2017年11月27日 ________________________________________ _________________________ 科目：微生物学实验题目：微生物大小与数量的测定姓名：丁志康 一、目的要求 1.学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。 2.增强微生物细胞大小的感性认识。 3. 明确血细胞计数板计数的原理。 4. 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 二、基本原理 一）微生物大小的测定 1.微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物 大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测 微尺和镜台测微尺。 2.镜台测微尺是中央部分可有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格每 格长0.01mm（即10μm）。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于 矫正目镜测微尺每格的相对长度。 3.目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有 等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以 测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大 倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺 测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定大放 大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物 细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。 4.球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。如金黄色葡萄球菌直 径约为0.8μm，枯草芽孢杆菌大小为0.7~0.8×2~3μm。 二）微生物数量的测定 1.微生物数量的测定有多种方法，本次试验中使用显微镜直接计数法。显微镜直接 计数法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻 片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前 国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley 计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。 后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间 的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。（除 了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法， 此法一般用于牛乳的细菌学检查。)显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操
实验：计数法测定细胞生长曲线
实验内容：计数法测定细胞生长曲线 作者：王卫东实验日期：2001.10.24-2001.10.31 实验目的：学习细胞计数的方法；熟悉测定生长曲线的基本原理、方法，了解其应用。 实验原理：一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮后贴壁，随后度过长短不一的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期，在达到饱和密度后，细胞停止 生长，进入平顶期，然后退化衰老。典型的生长曲线即可分为潜伏期、 指数生长期、平顶期及退化衰老四个部分，其中的三个不同生长时相 （潜伏期、指数生长期和平顶期）是每个细胞系所共有的特征。通过 测定生长曲线，不仅可以了解培养细胞生物学特性的基本参数、测定 细胞绝对生长数、判断细胞活力，而且也可用于测定药物等外来因素 对细胞生长的影响。本实验采用计数法测定细胞生长曲线，通过连续 对细胞计数（通常为7d，一般应每次计数3瓶细胞取平均值），然后 以存活细胞数对培养时间作图，即得该种细胞的生长曲线。 仪器、材料和试剂： 培养箱、超净工作台、倒置显微镜、血球计数板 1、仪器：CO 2 2、材料：培养瓶、试管、吸管、移液管、废液缸、HeLa细胞、盖玻片、酒精灯 3、试剂：培养基（含小牛血清）、0.25%胰蛋白酶 实验步骤： 1、细胞悬液制备：取生长良好接近汇合的HeLa细胞，胰酶消化，再加新鲜培 养基制成细胞悬液后计数。 2、接种：根据细胞计数结果，按每瓶5×104个接种细胞（加3mL培养基，实际 接种每瓶5.9×104个）作传代培养（理论上应该每人接种21瓶细胞，每天取3瓶计数，但实际每人只接种7瓶）。 3、计数：24h后开始作细胞计数，以后每隔24h计数一次，连续计数7天。 4、绘图：根据计数结果，绘制HeLa细胞生长曲线。 结果与讨论： 1、细胞计数结果如下：
红白细胞计数实验报告
《实验诊断学》实验报告 实验一红细胞、白细胞计数 实验原理 一定量的血液经一定量等渗性稀释液稀释后，充入血细胞计数池中，于显微镜下计数一定体积内的红细胞数。用稀醋酸液将血液稀释并破坏红细胞，混匀后充入计数池中，于显微镜下计数一定体积内的白细胞数。根据稀释倍数和计数的容积，换算求得每升血液中的红细胞数量以及白细胞数量。 实验内容与步骤 实验材料： 显微镜、微量吸管、毛细吸管、改良Neubauer计数板、盖玻片、小试管、RBC稀释液、WBC 稀释液、正常人的全血、纱布 实验步骤： 1、红细胞计数准备： 加稀释液，用微量吸管吸取RBC稀释液蒸馏水2.0 ml加到小试管内。 取血，毛细吸管取血10 μl。 用纱布擦去管外的血，轻吹入试管底部，再清洗吸管2-3次，立即混匀。 2、白细胞计数准备： WBC稀释液: 冰醋酸3.0 mL（破坏红细胞） 蒸馏水97.0 mL 亚甲蓝（染色） 小试管加WBC稀释液0.38 mL。 采血，微量吸管取血20 μL。 擦去管外的血，轻吹入试管底部，再清洗吸管2-3次，立即混匀。 充池、观察： 将计数板及盖玻片檫净，将盖玻片覆盖在计数板上。 用滴管吸取混均的红细胞悬液充入上方计数室，静置3-5 min，高倍镜下计数；白细胞悬液充入下方计数室，静置2-3 min，低倍镜下计数。 观察计数，红细胞，高倍镜下计数中央大方格内四角的4个中方格和正中的1个中方格的红细胞，压线细胞的计数按照数上不数下，数左不数右的原则。计数时按照弓形的计数方式，以免漏数或多数。 用低倍镜计数出计数池内四角大方格中的白细胞总数。 实验结果 1、红细胞计数实验结果： 5个中方格内RBC的计数／个=24+27+32+22+25 根据计算公式： RBC/L＝5个中方格内RBC数×5×10×200×106 ＝5个中方格内RBC数/100×1012 推算得出RBC：1.3×1012／L 正常人群的红细胞计数参考区间： 人群红细胞计数（×1012／L）
红细胞计数、白细胞计数实验报告
一.实验原理 用等渗稀释液将血液稀释一定倍数，充入计数池后，在显微镜下计数一定体积内的红细胞数量，经换算求出每升血液中的红细胞数量。用白细胞稀释液将血液稀释一定的倍数，同时破坏溶解红细胞。将稀释的血液注入血红细胞计数板，在显微镜下计数一定体积内的白细胞数，经换算即可求出每升血液中的白细胞数量。 二.实验内容与步骤 1、红细胞计数 （1）器材：显微镜、微量吸管、改良Neubauer计数板 （2）试剂：RBC稀释液①Hayem 稀释液：NaCl, Na2SO4，HgCl2 ②枸橼酸钠甲醛盐水溶液:枸橼酸钠，甲醛，NaCl ③生理盐水或含1%甲醛的生理盐水：仅在急诊或无上述两种稀释液时临时使用 （3）标本：外周血或抗凝血（EDTA抗凝) （4）操作步骤：①小试管加RBC稀释液2.0 ml。 ②采血，取血10 μl。 ③擦去管外的血，轻吹入试管底部，再清洗吸管2~3次，立 即混匀。 ④混匀后充入计数室，静置3~5 min，高倍镜下计数（用高 倍镜依次计数中央大方格内4角和正中5个中方格内的红细
胞数。） 2、白细胞计数 （1）器材：显微镜、微量吸管、改良Neubauer计数板 （2）试剂：WBC稀释液：冰醋酸3.0 mL（破坏红细胞）；蒸馏水97.0 mL；亚甲蓝（染色） （3）标本：新鲜全血或末稍血 （4）操作步骤：①小试管加WBC稀释液0.38 mL。 ②采血，微量吸管取血20 μL。 ③擦去管外的血，轻吹入试管底部，再清洗吸管2~3次，立 即混匀。 ④混匀后充入计数室，静置2~3 min，低倍镜下计数（用低 倍镜计数出计数池内四角大方格中的白细胞总数。） 三.实验结果 表一红细胞计数表 RBC/L＝405/100×1012＝4.05×1012／L 表二白细胞计数表 WBC/L ＝112/20×109＝5.6×109／L 实验结果：RBC：4.05×1012／L WBC：5.6×109／L 四.讨论 1、从实验结果与正常范围比较，实验结果没有超出正常范围，提示被采血
细胞增殖及细胞活力检测方法
细胞增殖及细胞活力检 测方法 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA 链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。 Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。 采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。
实验报告-细胞复苏及细胞鉴别与计数
细胞生物学实验报告 实验二细胞复苏及细胞鉴别与计数 1引言 1.1 实验目的 1. 掌握无菌操作技术。掌握细胞复苏技术。 2. 掌握用血球计数板进行细胞计数的方法。 3. 学习死活细胞鉴别的方法。 4. 了解细胞污染的判定方法。 5. 了解细胞形态的多样性。 1.2 实验原理 1.细胞复苏：以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程，复苏时要快速融化，必须将冻存在-196℃液氮中的细胞在1分钟内快速融化至37℃，使细胞迅速通过最易受损的温度区间-5-0℃，使冻存时细胞外的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 2.细胞计数：采用血细胞计数板法，血细胞计数板由一块长约7.5cm，宽 3.5cm的厚玻璃制成，平台中部上下各有一个计数室，每个计数室分9大格，每格边长1mm，面积1mm2，盖上盖玻片后体积为0.1mm3。四角的大格划分为16个中方格，一般用作白细胞、血小板组织培养的细胞计数。中央的大方格则由双线划分为25个中方格，每个中方格面积为0.04mm2，盖上盖玻片后体积为0.004mm3，每个中方格又分成16个小方格，用于红细胞、微生物细胞的计数。细胞计数原则：细胞压线则计上不计下，计左不计右，镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。对每个试样重复计数3次，取其算数平均值。 2实验仪器、试剂及操作步骤 2.1 实验仪器 超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒 （头）、吸管筒（头）、废液缸、移液器、枪头等 2.2 实验试剂 DMEM培养基、血清、抗生素等 2.3 实验步骤 细胞复苏： 1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。 2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。 3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。 4.自液氮中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，立即投入40℃水浴锅中解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内 全部融化。 5.正确摆放超净台内的实验用品，点燃酒精灯，准备一次性滴管和移液管。 6.将冻存管放入离心机中800转/分钟离心10分钟。 7.小心将冻存管移入超净台中，用75％的酒精棉球擦拭冻存管外部，打开冻存管用巴氏吸管弃上清， 加1mL的DMEM培养基吹打细胞使之均匀，取90uL细胞悬液和10uL台盼蓝染液于小指管中进行活细胞染色计数。 8.剩余细胞悬液吸至一个细胞培养瓶中，在细胞培养瓶中补加4mL的DMEM培养基，将盖子拧好稍回转，
细胞活性测定
细胞活性测定方法 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。核酸染料有多种，如EB带有单个自由正电荷，能通过完整细胞膜。而PI，TO—PRO—1，TO-PRO-3等等带一个有四铵基团和两个或两个以上正电荷的染料是不能通过完整细胞膜进入细胞内的。因而吸收了这些多电荷染料的细胞被认为是非活性的。另外，一些酸性染料，如上面提到的台盼兰，曙红等都是膜非通透性。 代谢活性是另一重要指标，它通过细胞内的酶的活性来判定。使用细胞某种酶的底物，它能通过（或是不能通过）完整细胞膜，在细胞内被酶切而产生荧光性，膜不通透性产物，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。通过检测荧光强度就可知细胞代谢活性。FDA(fluorescein diacetate)和CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是常用的两种底物。前者虽然透过细胞膜的速度较慢，但它的产物基本不往外通透。后者经细胞内脱氢酶催化而具有荧光性，能提供细胞呼吸代谢系统活性和细胞膜完整性信息。 正常细胞的细胞膜两侧维持着一个胞内为负的膜电位为梯度，带正电的亲脂性染料，如Cyanines类能因电梯度而通过细胞的脂双层膜聚积在活细胞内，带负电的亲脂性染料如oxonols会被排除在外。不再维持着膜电位梯度的细胞里，则会吸收更多Oxonols类染料。 用流式细胞仪测量的方法优点是，灵敏，荧光强度精确定量，快速高通量的检测逐个细胞，可同时检测细胞的多个活性指标，提高可信度，结果具有统计意义。缺点是，实验较MTT等复杂，费用较高。 常用的细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。 1．MTT法 MTT：化学名：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害。
红细胞计数的注意事项
红细胞计数的注意事项：（1）计数和计算：在2ml红细胞稀释液中加血10μl，混匀后，充入计数池，静置3～5min后，在高倍镜下，计数中央大方格内4角和正中5个中方格内的红细胞数。计数时需遵循一定方向逐格进行，以免重复或遗漏，对压线细胞采用数左不数右、数上不数下的原则。（2）清洁：应保证计数板和盖玻片清洁。操作时，勿接触计数板表面，以防污染。使用后，依次用95%乙醇、蒸馏水棉球、清洁绸布擦净.（3）充池：需一次完成充池，如充池过少、过多或有气泡、继续充液，应重新操作，充池后不能移动盖玻片。红细胞在计数池中若分布不均，每个中方格间相差超过20个应重新充池，两次红细胞计数相差不得超过5%. （4）计数板：改良牛鲍计数板每年要鉴定1次，以免影响计数结果的准确性。（5）白细胞影响：通常白细胞总数较少，仅相当于红细胞的1/500～1/1000，对结果影响很小，可以忽略不计。但白细胞过高者（WBC>100×10 9/L），红细胞计数结果应进行校正。方法有两种：一是直接将患者红细胞数减去白细胞数，二是在高倍镜下观察勿将白细胞计入，白细胞体积常比红细胞略大，中央无凹陷，细胞核隐约可见，无黄绿色折光。（6）红细胞稀释液：传统稀释液（Hayem液）由NaCl（氯化钠，调节渗透压）、Na2S04·10H2O（结晶硫酸钠，提高比密防止细胞粘连）、HgCl2.（氯化高汞，防腐）和蒸馏水组成。枸橼酸钠稀释液由枸橼酸钠（抗凝和维持渗透压）、甲醛（防腐和固定红细胞）、氯化钠（调节渗透压）和蒸馏水组成。普通生理盐水或加1%甲醛生理盐水。 瑞士染色的注意事项：（1）血涂片干透后固定，否则细胞在染色过程中容易脱落。（2）冲洗时应以流水冲洗，不能先倒掉染液，以防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久，以防脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积，可滴加甲醇，然后立即用流水冲洗。（3）染色过淡可以复染，复染时应先加缓冲液，然后加染液。染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。（4）瑞氏染色Ⅰ液由瑞氏染料、甲醇（AR级以上）和甘油组成，Ⅱ液为磷酸盐缓冲液（pH6.4～pH6.8）。 血涂片的注意事项：（1）玻片的清洗：新玻片常有游离碱质,因此应用清洗液或10%盐酸浸泡24小时,然后再彻底清洗。用过的玻片可放入适量肥皂水或合成洗涤剂的清水中煮沸20分钟,再用热水将肥皂和血膜洗去,用自来水反复冲洗,必要时再置95%乙醇中浸泡1小时,然后擦干或烤干备用。使用玻片时只能手持玻片边缘,切勿触及玻片表面;,以保持玻片清洁,干燥,中性、无油腻。（2）细胞染色对氢离子浓度十分敏感,在染色过程中玻片必须化学清洁,配制瑞氏染液必须用优质甲醇,稀释染液必须用缓冲液,冲洗用水应近中性,否则各种细胞染色反应异常,致使细胞的识别困难,甚至造成错误。（3）一张良好的血片,要求厚薄适宜,头体尾分明,分布均匀,边缘整齐,两侧留有空隙。血片制好后最好立即固定染色,以免细胞溶解和发生退行性变。（4）血膜未干透,细胞尚未牢固附在玻片上,在染色过程中容易脱落,因此血膜必需充分干燥.（5）染色时间与染液浓度,室温高低,细胞多少有关.染液越淡,室温越低,细胞越多,所需染色时间越长或应适当增加染液量,因此染色时间应视具体情况而定.特别是更换新染料时必须经试染,摸索最佳染色条件.（6）染液不可过少,以防蒸发干燥染料沉着于血片上难冲洗干净.（7）冲洗时应用流水将染液冲去.不能先倒掉染液,以免染料沉着于血片上.（8）染色过深可用甲醇或酒精适当脱色,最好不复染,必须复染时,可将染液先稀释好再复染.（9）染色时应注意保护血膜尾部细胞,不能划掉.因为体积较大细胞常在此处出现.
细胞计数方法 细胞计数板法
细胞计数方法------细胞计数板法 实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。 具体操作： 1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。 2. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。 3. 计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算： 细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104个/ml (注：当细胞很多时，可在四个大格中选一定数目较平均的小格，由于每大格中有16个小格，然后对选定的小格计左侧和上方的细胞数，求出每小格的细胞数，取平均值m，m×16即每个大格的平均值。所以，细胞密度=m×16×104个/ml) 说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。 公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为： 1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3而1ml=1000ul=1000mm3 （注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。） ================================================ 细胞计数板的使用 一、血球计数板-基本构造 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
血液检查实验报告doc
血液检查实验报告 篇一：血型测定实验报告 血型测定实验报告 一、实验目的： 学习ABO型血的鉴定原理和方法。观察红细胞凝集现象，了解抗原抗体反应。 二、实验原理： 血型就是红细胞膜上特异抗原的类型。在ABO血型系统中，红细胞膜上抗原分A和B两种抗原，而血清抗体分抗A 和抗B两种抗体。A抗原加抗A抗体或B抗原加抗B抗体，则产生凝集现象。血型鉴定是将受试者的红细胞加入标准A 型血清（含有抗B抗体）与标准B型血清（含有抗A抗体）中，观察有无凝集现象，从而测知受试者红细胞膜上有无A 或/和B抗原。在ABO血型系统，根据红细胞膜上是否含A、B抗原而分为A、B、AB、O四型。（见表4-3-1-1）三消毒采血针；载玻片；消毒棉签；抗A、抗B血型定型试剂；75%乙醇；受检者血液四、实验步骤 （1）取双凹玻片一块，用干净纱布轻拭使之洁净，在玻片两端用腊笔标明A及B，并分别各滴入A及B标准血清一滴。 （2）细胞悬液制备从指尖或耳垂取血一滴，加入含1ml 生理盐水的小试管内，混匀，即得约5％红细胞悬液。采血
时应注意先用75％酒精消毒指尖或耳垂。 （3）用滴管吸取红细胞悬液，分别各滴一滴于玻片两端的血清上，注意勿使滴管与血清相接触。 （4）竹签两头分别混合，搅匀。 （5） 10～30min后观察结果。如有凝集反应可见到呈红色点状或小片状凝集块浮起。先用肉眼看有无凝集现象，肉眼不易分辨时，则在低倍显微镜下观察，如有凝集反应，可见红细胞聚集成团。 （6）判断血型根据被试者红细胞是否被A，B型标准血清所凝集，判断其血型。五、实验结果： 我们组本次实验中，载玻片1左边为抗B型定型试剂，呈淡红色，未发生凝聚；右边为抗A型定型试剂，血液在试剂中凝结，试剂较清亮。该受试者1血型为A。 载玻片2左右边的试剂内的血液皆不出现凝结现象，受试者2为O型血。 六、实验讨论： 1.实验中要分清牙签，不要用一牙签一端同时在抗A血清和抗B血清中搅拌，以免造成抗体试剂不纯。 2.实验中我们组发现15分钟后没有出现血凝现象，可用牙签轻轻搅拌一会儿，有些载玻片上就不现了血块，但有些经搅拌后仍不出现血凝现象，表示确实不含相应的抗原。篇二：血糖的测定实验报告
全自动细胞计数和活力分析系统
全自动细胞计数和活力分析系统： 中标产品必须逐条响应以下技术参数： 1.细胞直径范围：2μm -70μm 2.细胞浓度：5x104-1x107个/毫升 3.细胞存活率：0-100% 4.操作系统：Windows XP 5.具有自动取样装置 6.样品量：≤0.5 ml 7.有精确进样系统 8.分析时间周期（包括自动进样，作样，清洗全过程）：≤2.5 分钟 9.自动聚焦FIREWIRE CCD：≥1394 X 1040 10.可实时采集细胞图像 11.图形具有缩放功能 12.样品抽取及台盼蓝染料混合可变量 13.浓度高低可自动报警，废液过多可自动报警 14.符合21CFR PART 11 准则 15.有生物处理3D，旋转绘图 16.可将多重结果输出至EXCEL 文件 17.用户可自行定义非存活细胞分团选项 18.有提高圆度检测功能，可分离细胞碎片 19.可提供的数据：细胞存活率；总细胞数；存活细胞数；总细胞浓度；存活细胞 浓度；细胞的直径及分布；细胞的平均直径；细胞圆度及分布；细胞平均圆度； 细胞的生长速度；细胞倍增时间；细胞生长曲线
连续波长微孔板分光光度计 中标产品必须逐条响应以下参数： 常规参数 孔板类型：6-,12-,24,48,96和384-孔标准微孔板，大小128mm×86mm，最高0.8英寸。 可选配件：Take3TM微孔板适配器，可进行微量检测、BioCell TM、标准比色杯检测 软件：Gen5软件控制，兼容各种版本，包括中文软件 检测模式：终点法，动力学法，波长扫描发和孔域扫描法 检测性能 波长范围：200-999nm，可选1nm步进 波长准确性：＋/-2nm 波长重复性：＋/-0.2nm 吸收光检测范围：0-4 OD 吸收光分辨率：0.0001 带宽：5nm OD准确性：0-2 OD：+/-1% +/-0.010 OD 2-2.5OD：+/-3% +/-0.010 OD 重复性：0-2 OD：+/-1% +/-0.005 OD 0-2 OD：+/-3% +/-0.005 OD 线性：0-2 OD：+/-1% +/-0.010 OD 2-2.5 OD: +/-3% +/-0.010 OD 读板速度：96孔≤50秒（标准）；≤40秒（快速）；≤15秒（扫描） 384孔≤170秒（标准）；≤135秒（快速）；≤35秒（扫描） 物理参数 连接：USB串口连接电脑控制 化学兼容性：所有暴露表面均耐受0.5%次氯酸钠、70%乙醇或异丙醇进行消毒
白细胞计数实验报告(仅供参照)
白细胞计数和分类 目的：掌握血涂片制备的操作要领、瑞氏染色方法、正常外周血五种白细胞形态特点、 原理：各种白细胞必须经过染色，才易于区分其类别。常用者为瑞氏（Wright’s）染色法和姬姆萨(Giemsa)染色法。测定外周血液中各种白细胞的相对比值，以观察其数量、形态和质量变化，通过显微镜观察染色血涂片，计算血液中各类白细胞的百分率，称为白细胞分类计数。利用白细胞总数和各类白细胞的百分率，即可计算每mm3血液中各类白细胞的绝对值。 实验器材：香柏油、盖玻片、推片、采血针或注射器、小滴管、消毒棉球、瑞氏染液、pH6.4~6.8磷酸盐缓冲液、蒸馏水、计数板及专用盖片、针1ml 刻度移液管、1ml EP管、光学显微镜。20ul刻度移液管、推片 实验步骤 白细胞分类 1．血片制作： 取一滴血，滴于洁净无油脂的玻片一端。左手持玻片，右手再取边缘光滑的另一玻片作为推片。将推片边缘置于血滴前方，然后向后拉，当与血滴接触后，血即均匀附在二玻片之间。此后以二玻片约呈30—45度的角度平稳地向前推至玻片另一端。推时角度要一致，用力应均匀，即推出均匀的血膜（血膜不可过厚、过薄）。将制好的血涂片晾干，不可加热。 注：（1）良好涂片标准：１) 呈头、体、尾舌形 ２) 血膜厚薄适宜 ３) 两边留有空隙（2）涂片好坏与下列因素有关：1）血滴大小 2）推片与玻片之间角度 3）推片速度 2、血涂片的染色步骤： （1）用蜡笔在血膜两端各划一道线，以免染料外溢，置涂片于染色架上。（2）滴加瑞氏染液，共计七八滴数，以盖满血膜为度，静置1分钟。（3）再滴加等量的磷酸缓冲盐溶液，轻轻摇动，并轻吹液体使染色液与缓冲液混合均匀，静置15分钟。 （4）用清水冲洗。切勿先倾去染液再冲洗，否则沉淀物附于血膜上不宜出去。冲洗后斜置血涂片于空气中干燥。或先用滤纸吸取水分迅速干燥，即可镜检。 3、白细胞分类计数：先用低倍镜检查涂片及染色是否均匀。然后加一滴香柏油于血膜厚薄均匀处（一般在体尾交界处），在油镜下由此处开始按其形态特征进行分类计数，计数移动时避免重复。根据所见到的100个白细胞，记录各种白细胞所占的百分数。
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告-山东大学
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 【实验目的】 1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养； 2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用； 3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法； 4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数； 【实验原理】 1.细胞培养 细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。 细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体的状况；细胞培养得到的产物少。 培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。 2.细胞死活鉴定 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异： ①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。 ②代上的差异：活细胞中新代作用强，细胞的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。 3.血球计数板的使用
细胞计数及活力测定
细胞计数及活力测定 一、原理 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。 二、仪器、用品与试剂 1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计） 2、试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇 3、材料：细胞悬液 三、操作步骤 （一）细胞计数 1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 （二）细胞活力 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。 活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。 （三）MTT法测细胞相对数和相对活力 活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。 l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。 2、沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。 3、37℃下保温2小时。 4、加入4—5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。 5、1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。 注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。 附：1、0.4%台盼兰染液配制： 台盼兰0.4克加双蒸水至100 ml。