10％ EDTA、5％硝酸用于大鼠颞骨脱钙处理的效果对比观察
病理组织脱钙液传统组方的比较分析
病理组织脱钙液传统组方的比较分析赵宝忠;张毅;刘志兰【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2014(030)006【总页数】2页(P699-700)【关键词】组织脱钙;盐酸脱钙液;硝酸脱钙液【作者】赵宝忠;张毅;刘志兰【作者单位】天津市北辰区宜兴埠镇社区卫生服务中心,天津300402;天津医科大学药学院,天津300070;天津市第二医院检验科,天津300141【正文语种】中文【中图分类】R-33病理组织脱钙液传统组方种类繁多，组分剂量差异较大。
本文就相关溶质、溶剂、溶液的性质及对病理组织成分的作用，对各种传统组方质量进行比较分析(传统组方组分剂量的统一换算以100 ml溶液量计，组织钙盐以碳酸钙计)。
传统组方:(1)Ⅰ组方［1，2］:浓硝酸 5 ml，去离子水 95 ml;(2)Schaffer组方［3］:浓硝酸5 ～7.5 ml，去离子水 92.5 ～95 ml;(3)Ⅱ组方［1，2］:浓硝酸 10 ml，去离子水90 ml;(4)Ⅲ组方［2］:浓硝酸 4.8 ml，尿素 3 ～ 5 g，去离子水95 ml;(5)Clayden 组方［4］:浓硝酸5 ～10 ml，尿素0.1 g，去离子水90 ～95 ml;(6)Haug 组方［3］:浓硝酸 16.7 ml，邻苯三酚 1.7 g，去离子水83.3ml;(7)Ⅳ组方［4］:浓硝酸7.5 ～15 ml，37%甲醛5 ml，去离子水 80 ～87.5ml;(8)Alexander组方［3］:浓硝酸6.2 ml，37%甲醛4.5 ml，去离子水 89.3 ml;(9)Schridde 组方［3］:浓硝酸 16.7 ml，37% 甲醛 8.3 ml，去离子水 75 ml;(10)Ⅴ组方［2］:浓硝酸 4.3 ml，37% 甲醛 4.3 ml，甘油 4.3 ml，去离子水87 ml;(11)Thoma 组方［3］:浓硝酸 15.4 ml，37%甲醛 7.7 ml，95%乙醇 77 ml;(12)Perenyi组方［4］:浓硝酸 4 ml，浓铬酸 0.15 ml，30% 乙醇 96 ml。
不同脱钙液对钙化性主动脉瓣膜脱钙效果的比较
不同脱钙液对钙化性主动脉瓣膜脱钙效果的比较李灿波;李海清;叶晓峰;赵强【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2015(035)008【摘要】目的比较不同脱钙液对钙化性主动脉瓣膜标本的脱钙效果.方法选择6例主动脉瓣钙化患者的病变瓣膜标本,每个瓣膜等分成3份后随机分配到5％硝酸(硝酸组)、10％甲酸(甲酸组)、10％ EDTA(EDTA组)溶液中进行脱钙,观察和比较各组病理切片的苏木精-伊红染色(H-E染色)和免疫组织化学染色效果.结果 EDTA 组脱钙速度较慢,但显示瓣膜组织结构完整,形态清晰,脱钙及免疫组织化学染色效果最佳.硝酸组脱钙时间最短,也能获得良好的脱钙效果.甲酸组脱钙时间较短,但脱钙效果最差.结论在钙化性主动脉瓣的病理学研究中,EDTA脱钙液仍是脱钙的最佳选择.而在考虑时间因素的情况下,硝酸脱钙液则是良好的替代.甲酸脱钙液由于对钙化瓣膜的脱钙效果较差,不推荐使用.【总页数】4页(P1234-1237)【作者】李灿波;李海清;叶晓峰;赵强【作者单位】上海交通大学医学院附属瑞金医院心脏外科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院心脏外科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院心脏外科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院心脏外科,上海200025【正文语种】中文【中图分类】R542.52【相关文献】1.三种不同脱钙液在骨组织石蜡切片中的应用比较 [J], 杜洪;金荣2.临床病理检验中不同骨组织脱钙液效果的比较 [J], 李玉莲;徐晓艳3.不同脱钙条件下三种脱钙液脱钙效果的比较 [J], 陈敬文;张伟;王天娲;程俊;罗金风4.不同成份脱钙液对骨组织脱钙效果的比较 [J], 祁宏枝; 罗添友; 唐涛5.三种脱钙液对狗牙齿及牙槽骨脱钙效果的比较 [J], 于洪藻;李玉林;张丽红;王成坤;蔡家骏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
不同的脱钙液在骨组织制片中的比较应用
不同的脱钙液在骨组织制片中的比较应用【摘要】目的比较不同的脱钙液对骨组织的脱钙能力的差异，探讨其对HE染色的影响。
方法选取50例手术切除的新鲜骨标本，运用4种常用的脱钙液(14%硝酸、10%盐酸、20%甲盐酸和EDTA脱钙液)进行脱钙，比较其脱钙效果和对HE染色的影响。
结果不同的脱钙液对骨组织的脱钙能力、HE染色效果影响有显著区别。
结论14%硝酸脱钙能力最强，用时间最短，染色的效果最差；10%盐酸对骨组织的损伤小，HE染色的效果最好，但用时较长；20%甲盐酸脱钙能力和HE染色效果都介于10%盐酸和EDTA脱钙液之间；EDTA脱钙液脱钙用时最长, 对骨组织的损伤最小。
【Abstract】Objective To investigate the different ability of four different decalcifying solutions to decalcify and their influence of HE stain and immunohistochemistry. Methods 50 cases of fresh human bone example are selected. The bones had been decalcified with four kinds of decalcifying solution (including 14% nitric acid, 10% hydrochloric acid, 20% a hydrochloric acid and EDTA). Results Different decalcifying solutions had the different decalcified ability and the influence of HE stain and immunohistochemistry. Conclusion 14% nitric acid can decalcify strongly and rapidly. But its deficiency is the infection of HE coloration and immunohistochemistry. 10% hydrochloric acid doesn’t destroy the tissue and has the best influence for HE stain. The effect of 20% a hydrochloric acid and HE stain between 10% hydrochloric acid and EDTA decalcifying acid. EDTA can decalcify for a long , have the minimum damage for bone tissue.【Key words】Decalcifying solution; HE stain; Bone tissue骨组织是一种坚硬的结缔组织，由骨细胞和骨基质组成，骨基质内含大量无机盐，主要是羟磷灰石-磷酸钙和碳酸钙。
不同浓度和pH值EDTA脱钙液对下颌骨免疫组化结果的影响
不同浓度和pH值EDTA脱钙液对下颌骨免疫组化结果的影响沈溪明;何欣欣;吴东霞;陈耿标;王林【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2014(030)006【总页数】3页(P696-698)【关键词】EDTA;脱钙液;下颌骨;免疫组织化学【作者】沈溪明;何欣欣;吴东霞;陈耿标;王林【作者单位】中山大学附属第二医院病理科,广州510120;中山大学附属第二医院病理科,广州510120;中山大学附属第二医院病理科,广州510120;中山大学附属第二医院病理科,广州510120;中山大学附属第二医院病理科,广州510120【正文语种】中文【中图分类】R446.6传统骨组织脱钙常采用酸性液体，但易导致组织结构难以保持完整，影响病理学进一步诊断。
骨组织用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)作为脱钙液进行脱钙，能使骨组织中的蛋白抗原保持完好，组织细胞结构保持完整清晰。
已有大量文献报道肯定了EDTA脱钙液的作用，但对EDTA脱钙液的适宜浓度和pH值报道不一［1，2］。
本文旨在探讨不同浓度和pH值EDTA脱钙液对下颌骨组织HE形态和免疫组化结果的影响。
1.1 材料随机选取25例中山大学附属第二医院病理科下颌骨标本，常规经10%中性福尔马林固定24 h。
随机分为5组:10%EDTA(pH 9.01)为A组，15%EDTA(pH 11.0)为B组，10%EDTA(pH 11.0)为C组，15%EDTA(pH 9.01)为D组，14%硝酸脱钙液为硝酸组，组织标本组切割为1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm 大小。
1.2 脱钙液的配制使用100 ml双蒸水将10 g EDTA配成浓度为10%EDTA，双蒸水100 ml+15 g EDTA配成浓度15%EDTA，分别加入 1 mmol/L NaOH 和 1 mmol/L HCl，将pH调至9.01和11.0。
14%硝酸脱钙液:86 ml双蒸水+14 ml 浓硝酸。
不同脱钙液对牙齿牙周联合石蜡切片HE染色的影响
不同脱钙液对牙齿牙周联合石蜡切片HE染色的影响【摘要】目的探讨不同脱钙液对牙齿牙周联合切片HE染色质量的影响。
方法选用10%乙二胺四乙酸钠(EDTA)、复合酸(Plank-Rychlo脱钙液)和5%硝酸3种不同的脱钙液,分成A、B、C 3组用于犬和大鼠牙齿牙周组织联合石蜡切片脱钙,通过记录脱钙时间,观察HE染色效果,评价室温下(20℃～28℃)不同脱钙液对切片制作的影响。
结果A组脱钙液所制切片染色效果良好,但脱钙速度缓慢,所需时间较长;B组脱钙液脱钙速度快,所制切片染色好;C组脱钙液所制切片的染色强度和对比度均不如前两种脱钙液。
结论在制作牙齿牙周联合切片时,EDTA 脱钙液和Plank-Rychlo脱钙液所制切片均能取得良好的染色效果,但EDTA脱钙液脱钙周期过长;Plank-Rychlo脱钙液脱钙均匀,速度快,更适合于临床速检工作;硝酸脱钙液组染色效果较差。
【关键词】脱钙;牙齿;牙周组织;石蜡切片;HE染色【Abstract】Objective To investigate the effect of different decalcifying fluid on HE color of teeth and periodontal tissue united sections.Methods 10%EDTA decalcifying fluid, mixed acid(Plank-Rychlo)and 5% nitric acid were divided into three groups: group A, group B and Group C, which were used to decalcify the united paraffin sections of tooth and periodontal tissue from dogs and rats. The effect of three kinds of decalcifying fluid on manufacture of united sections was evaluated at room temperature(20℃~28℃)by decalcification time and HE staining quality.Results Group A had a good effect of HE staining, but its decalcification time was too long. Group B had either high speed decalcification or high staining quality.Group C was the last choice with the regard of poor staining intensity and contrast.ConclusionEDTA decalcifying fluid and Plank-Rychlo decalcifying fluid can get a favorable staining effect, but has a long decalcification period,Plank-Rychlo decalcifying fluid is more suited to clinical quick examination due to well-distributed and high speed decalcification. Nitric acid decalcifying fluid has a poor staining effect.【Key words】Decalcification;Tooth;Periodontal tissue;Paraffin section;Hematoxylin/eosin staining在涉及口腔组织病理的研究中,需要制作牙齿牙周组织联合切片进行诊断、观察和对比分析,但由于牙齿是全身硬度最高的组织,特别是牙釉质,其无机物成分羟基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2] 含量占97%,硬度与石英相似;牙本质、牙骨质及牙槽骨坚硬致密、易碎难切,而牙髓、牙龈、牙周膜等软组织在切片过程中易受挤压、牵拉、分离变形甚至脱落。
不同脱钙液对大鼠骨髓切片染色的影响
不同脱钙液对大鼠骨髓切片染色的影响高甜;李慧强;吴晓红【期刊名称】《畜牧与饲料科学》【年(卷),期】2013(034)001【摘要】[目的]探讨不同脱钙液对Wistar大鼠胸骨骨髓切片染色效果的影响.[方法]取正常Wistar大鼠胸骨,采用10％中性福尔马林溶液充分固定,经流水冲洗后,分别浸入甲酸氯化铝脱钙液(A组)、5％甲酸脱钙液(B组)、5％硝酸脱钙液(C组)中进行充分脱钙后,再经流水冲洗,制作石蜡切片,HE染色,显微镜观察并评价其效果.[结果]①制片时间:5％甲酸组＞甲酸氯化铝脱钙液＞5％硝酸组；②HE染色效果:甲酸氯化铝脱钙液与5％甲酸组无显著差异,优于5％硝酸组.[结论]采用甲酸氯化铝脱钙液方法制作的大鼠胸骨骨髓切片,骨髓组织结构完整,细胞形态清晰,耗时较短,能够满足组织学评价的要求.【总页数】2页(P16-17)【作者】高甜;李慧强;吴晓红【作者单位】内蒙古医科大学蒙医药研究院,内蒙古呼和浩特010110;内蒙古医科大学药学院,内蒙古呼和浩特010110;内蒙古医科大学药学院,内蒙古呼和浩特010110【正文语种】中文【中图分类】R361【相关文献】1.不同固定液对大鼠脾石蜡切片HE染色标本的影响 [J], 孙海梅;尚宏伟;张立新;季风清;周德山2.不同脱钙液对牙齿牙周联合石蜡切片HE染色的影响 [J], 潘利锋;吴旭;夏建军;毛成毅3.不同脱钙液对食蟹猴骨髓组织切片HE染色效果的影响 [J], 英永;王韶艳;王凤乾;屈卉锦;邱波;胡建廷4.不同脱钙液对骨髓组织切片HE染色效果的对比研究 [J], 兰淼;巩丽;李艳红;张伟;朱少君;姚丽;韩秀娟;张力5.不同脱钙液对兔膝关节组织切片染色的影响 [J], 英永;王韶艳;王凤乾;胡建廷;李艳;屈卉锦;李莉;邱波因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
脱钙液在微波辐射下对骨组织作用效果及免疫组织化学染色的影响.
脱钙液在微波辐射下对骨组织作用效果及免疫组织化学染色的影响中华病理学杂志/990220 骨组织脱钙常规多采用酸性液体(如硝酸、盐酸、甲酸等)进行脱钙，一般需较长时间，组织细胞结构很难保持完整清晰，有些甚至破坏组织结构很严重，从而影响病理学的诊断和研究。
骨组织中的蛋白抗原得不到很好的保存，有时甚至丢失。
为此我们对9例骨组织用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)作为脱钙液，利用微波辐射脱钙[1，2]并进行免疫组织化学方法定位，观察骨组织结构改变和蛋白抗原保存情况，得到较满意的结果。
一、材料与方法1.材料：9例骨组织为我科活检标本(骨肉瘤3例，肋骨2例，胫骨2例，股骨2例)，其组织大小为1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm；微波炉为浙江临安生产的YWY781B型；EDTA为进口分装，购于北京化学试剂公司；免疫组化试剂为福州迈新生物技术开发公司赠。
2.脱钙液配制：A液：EDTA10 g，PBS缓冲液(pH 7.2)100 ml，加NaOH搅拌溶解后，用1 mol/L HCl调pH至7.2，再加甲醛15 ml。
B液：甲酸15 ml，甲醛10 ml，蒸馏水75 ml。
C液：硝酸5 ml，甲醛10 ml，蒸馏水85 ml。
D液：甲酸10 ml，硝酸3 ml，盐酸5 ml，冰醋酸2 ml，甲醛10 ml，蒸馏水70 ml。
3.脱钙方法：本实验9例骨组织各分两组，即微波脱钙组和室温脱钙组。
微波组：将骨组织放入平底小烧杯内，分别装有上述各种脱钙液，表面加一层液体石蜡[3]，以微波4档间歇脱钙，每次辐射1分钟，每次辐射之间都将烧杯移至室温冷却5分钟，以保证每次的微波辐射脱钙液的温度不至于太高。
室温组：每隔4小时更换一次脱钙液。
以大头针能刺进骨密质为完成脱钙标准。
4.免疫组织化学方法：组织脱钙后经常规组织处理切片，枸橼酸微波恢复抗原后，应用SP法进行免疫组织化学反应[4]，检测骨组织中骨形成蛋白(BMP单抗)和波形蛋白(Vimentin单抗)。
骨组织标本快速水浴脱钙法
骨组织标本快速水浴脱钙法
王利民
【期刊名称】《沈阳部队医药》
【年(卷),期】1996(000)006
【摘要】在病理检查中,骨组织标本需脱钙处理.通常用10%硝酸脱钙,需3天以上,而且每天要更换脱钙液.我科改用水浴加温方法,1天即可完成脱钙.现介绍如下.1 脱钙液的配制取浓硝酸5ml,加入10%甲醛液95 ml,配成硝酸甲醛液备用.
【总页数】1页(P555-555)
【作者】王利民
【作者单位】第213医院 116100
【正文语种】中文
【中图分类】R446.8
【相关文献】
1.骨组织石蜡包埋后脱钙不理想快速补充脱钙法 [J], 年丰
2.骨组织标本脱钙法的改进 [J], 吴璠;吴鹏
3.实用的快速骨组织脱钙法 [J], 黎飚;方晓燕;黄永秩;蓝爱荣
4.改良快速骨组织脱钙法在笼养蛋鸡骨质疏松症病理诊断中的应用 [J], 吕文亭;王鹏;杨永红;马利芹
5.改良快速骨组织脱钙法在骨肿瘤临床病理诊断中的价值 [J], 吕飞飞[1];张强[1]因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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10％ EDTA、5％硝酸用于大鼠颞骨脱钙处理的效果对比观察卓洋;王巧;杨聪颖;陈昊;李爱民【摘要】目的观察并比较10％乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和5％硝酸脱钙处理大鼠颞骨的效果.方法 SD大鼠10只,随机分为EDTA组和硝酸组,取出大鼠颞骨后分别置于10％ EDTA、5％硝酸脱钙液中进行脱钙处理.观察两组脱钙效果,记录脱钙时间,采用甲苯胺蓝染色进行颞骨组织形态学观察,采用免疫荧光双标染色检测α-tubulin蛋白、水通道蛋白1(AQPl).结果两组取材过程中,颅骨硬度适当,颞骨可轻松切下,无砂砾感,切下的颞骨无松散及组织脱落.硝酸组脱钙所需时间分别为(11.20±0.83)d、(26.20 ±2.38) min,两组相比,P＜0.05.EDTA组颞骨整体形态保持完好,蜗管、镫骨肌、岩动脉、神经元、雪旺细胞、郎飞结、神经干可清晰辨识;硝酸组颞骨整体结构保存较理想,神经元形态保持尚可,但存在骨质染色不均、雪旺细胞崩解、轴突肿胀、郎飞结消失现象.EDTA组颞骨脱钙后AQP1、α-tubulin蛋白定位准确,组织区分度高;硝酸组由于细胞膜中AQP1遭受破坏、位于微管内的α-tubulin蛋白漏出细胞,荧光消减明显,组织形态保持较差.结论 10％ EDTA和5％硝酸用于大鼠颞骨脱钙处理效果均较好,两种脱钙液均适用于普通病理及结构观察,若用于蛋白定量及定性方面研究,应首选10％ EDTA.【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2016(056)031【总页数】3页(P43-45)【关键词】骨脱钙技术;乙二胺四乙酸二钠;硝酸;颞骨【作者】卓洋;王巧;杨聪颖;陈昊;李爱民【作者单位】徐州医学院附属连云港医院,江苏连云港222000;徐州医学院附属连云港医院,江苏连云港222000;徐州医学院附属连云港医院,江苏连云港222000;徐州医学院附属连云港医院,江苏连云港222000;徐州医学院附属连云港医院,江苏连云港222000【正文语种】中文【中图分类】R446.6颞骨参与构成头颅的侧部与颅底，其中穿行面神经、脑膜中动脉及分支，颞骨同时容纳听觉器官及其附属结构，颞骨骨折可造成上述结构损伤，引起相应并发症[1]。
既往研究主要通过打开颞骨获取目标组织[2]，此法简便快速，可获取目标组织进行单独研究，但易造成组织结构破坏(尤其是血管、神经等柔软且难以取材的组织)。
骨脱钙技术成熟，为病理常规技术，但多用于单纯的骨组织病理诊断。
目前病理科常用的脱钙液包括10%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和5%硝酸等，但不同性质的脱钙液对脱钙后颞骨内部组织形态及蛋白定位、含量的影响少有报道。
2015年6～10月，我们分别采用10% EDTA和5%硝酸对大鼠整个颅骨进行脱钙处理，观察并比较脱钙后颞骨内结构及蛋白定位、含量变化，为后期研究提供参考。
1.1 实验动物与材料正常成年健康雄性SD大鼠10只，体质量200～250 g，随机分为EDTA组及硝酸组各5只。
4%、10%多聚甲醛，0.25%甲苯胺蓝染液，0.5%冰醋酸溶液，梯度乙醇，二甲苯，兔抗大鼠水通道蛋白1(AQP1)一抗，小鼠抗大鼠α-tubulin蛋白一抗，CY3标记山羊抗兔二抗，Fitc标记山羊抗小鼠二抗，山羊血清工作液，DAPI工作液。
Leica RM2235超薄切片机，奥林巴斯荧光显微镜。
1.2 颅骨的取材及固定两组大鼠以10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉，剑突下剪开皮肤、暴露心脏，生理盐水于左心室内灌注至大鼠四爪及双肺颜色变白，换用新鲜配制的4%多聚甲醛经左心室灌注、固定，灌注成功的标志为大鼠全身僵硬，所灌注的大脑色白、质硬。
于颈枕交界处将大鼠断头，锐性清除头颅皮肤、外耳、肌肉等附属组织，暴露出完整颅骨；自枕骨大孔处向前去除顶骨，掀起大脑，剪断颅神经，去除大脑；将颅骨置于10%多聚甲醛溶液内，4 ℃冰箱内固定4 h，0.9%生理盐水冲洗后进行脱钙处理。
1.3 脱钙液配制及颅骨脱钙方法EDTA脱钙液：EDTA 10 g加入100 mL的双蒸水中，加入NaOH(1 mmol/L)将pH调至9.0。
硝酸脱钙液：将浓硝酸5 mL缓慢加入95 mL的双蒸水中。
EDTA组和硝酸组分别采用10% EDTA、5%硝酸脱钙液进行脱钙处理。
将固定好的头颅标本置于相当于10倍颅骨体积的脱钙液中。
加盖放入4 ℃冰箱，定期更换脱钙液，观察脱钙情况，以切片机刀片切割颅骨柔软且无砂砾感为脱钙终点。
1.4 颞骨石蜡切片的制备取两组脱钙完全后的头颅以蒸馏水冲洗10 min，去除标本中的脱钙液，将大鼠头颅置于头颅模具中，分别沿头颅正中及双眼眶后缘连线取出颞骨。
常规脱水、透明、包埋，沿矢状位做厚度10 μm连续切片，制备好的石蜡切片置于70 ℃烤箱中烘烤4 h，常规脱蜡及梯度乙醇水化后分别进行甲苯胺蓝染色及免疫荧光双标染色。
1.5 颅骨组织形态观察采用甲苯胺蓝染色法。
将标本置于37 ℃的0.25%甲苯胺蓝染缸内3 min，流水洗去浮色，0.5%冰醋酸溶液1 min，梯度乙醇脱水5 s，二甲苯透明30 s，封片，显微镜下拍照。
1.6 颅骨组织中AQP1、α-tubulin蛋白检测采用免疫荧光双标染色。
将标本以0.01 mol/L PBS浸洗5 min×3次，浸入抗原修复液中，100 ℃水浴锅内水浴10 min；0.01 mol/L PBS浸洗5 min×3次；加入山羊血清工作液37 ℃封闭60 min，倾去，不洗；加入AQP1(1∶500)及α-tubulin(1∶1 000)一抗，湿盒，4 ℃过夜；恢复室温，0.01 mol/L PBS浸洗5 min×5次；加入CY3(1∶1 000)及Fitc(1∶500)标记的二抗，湿盒，避光，37 ℃ 120 min；恢复室温，0.01 mol/L PBS浸洗5 min×5次；DAPI复染，湿盒，避光，室温5 min；0.01 mol/L PBS浸洗5 min×3次；防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察并拍照。
AQP1、α-tubulin蛋白分别定位于细胞膜及细胞质，镜下选取膝状神经节为目标结构，分别使用红色、绿色通道观察膝状神经节中2种蛋白的荧光强度，将荧光信号通过摄像机转换为数字图像，在计算机上使用Image J软件测算两种荧光的平均荧光强度，代表目的蛋白相对表达量。
1.7 统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行分析。
计量资料比较采用独立t检验。
P<0.05为差异有统计学意义。
两组取材过程中，颅骨硬度适当，颞骨可轻松切下，无砂砾感，切下的颞骨无松散及组织脱落。
EDTA组、硝酸组脱钙所需时间分别为(11.20±0.83)d、(26.20±2.38)min，两组相比，P<0.05。
EDTA组甲苯胺蓝染色均一，颞骨整体形态保持完好，蜗管、镫骨肌、岩动脉、神经元、雪旺细胞、郎飞结、神经干可清晰辨识。
硝酸组颞骨整体结构保存较理想，神经元形态保持尚可，但存在骨质染色不均、雪旺细胞崩解、轴突肿胀、郎飞结消失现象。
详见图1。
EDTA组荧光清晰明亮，背景干净，边缘清楚，AQP1、α-tubulin蛋白定位准确，组织区分度高，硝酸组三种荧光都存在消减，尤其是红色荧光最为严重，绿色荧光晕染，边缘模糊，组织形态保持较差。
EDTA组、硝酸组绿色荧光强度分别为30.23±7.32、17.56±6.58，红色荧光强度分别为42.84±8.24、12.85±4.11，蓝色荧光强度分别为35.69±6.58、20.47±5.75，两组相比，P均<0.05。
详见图2。
骨组织中富含钙盐，硬度较高，直接切片难度较大。
目前通行的方法是使用脱钙法将其中的钙盐去除，待骨质变软后进行切片。
脱钙技术是目前最常用的骨组织处理方法，主要用于质硬的骨组织或含有骨组织的肿瘤的预处理[3]。
脱钙液的选择对于后期制片及诊断具有重要意义。
脱钙试剂大致可分为酸性脱钙液(硝酸、盐酸、硫酸、甲酸等)及钙络合剂(EDTA、柠檬酸钠)两种[4～6]。
酸性脱钙液能与钙盐迅速反应，由于所选酸性脱钙液溶剂浓度及骨质质地不同，至脱钙终点所需的时间也存在差异，在数分钟至数小时不等[5，7]。
酸性脱钙液中的酸与钙盐反应迅速，可实现快速脱钙，且酸性脱钙液具有配置简单、对反应条件要求不高等优势，能够满足常规病理尤其是快速病理的需求。
近年来，酸性脱钙液出现许多改进，如将两种或两种以上的脱钙液进行混合，或化学脱钙和物理方法结合等[8,9]，但其基本化学反应本质并没有发生改变，仍为酸性溶液与钙盐反应。
蛋白质及核酸与酸性脱钙液进行化学反应可出现不可逆的变性，可能对后期分子定位及定量评价造成影响；另外，酸与钙盐的反应为分解反应，期间产生的小气泡及热量易造成组织结构变形、破坏，难以做到原位观察[10]。
因此，酸性脱钙液的适用范围仅限于普通染色进行大体形态学观察，若进行分子或细胞结构(细胞膜、细胞核)研究，则需要寻找一种对抗原亲和力高且对组织形态影响小的脱钙方法。
络合剂能与骨质中的钙离子进行螯合反应，形成可溶的非离子螯合物从而实现脱钙目的。
与酸性脱钙液最大的不同之处在于，上述螯合反应在中性条件下进行，过程温和，不产生气泡，对蛋白质亲和性较高[11]。
但螯合反应进行缓慢，其最大的缺点在于脱钙周期较长(需两周至一个月)，在脱钙过程中需不断更换脱钙液且每天判断脱钙终点才能获得良好的脱钙效果[12]。
在涉及动物模型的研究中，常常需对蛋白进行原位标记和观察，在处理组织过程中，保持组织形态及抗原完整显得尤为重要。
颞骨内骨质不均一，结构精细，包含神经、肌肉、血管等不同质地的组织[13]。
脱钙前对颞骨进行取材将不可避免地挤压、震动颞骨，造成其内部结构移位、碎裂，取材也难以做到精确。
因此我们在颞骨取材前对大鼠整个头颅骨进行脱钙处理，保证颞骨内结构完整。
脱钙前清除颅骨附着的骨膜、肌肉等附属组织，有利于颅骨与脱钙液接触，加快脱钙进程，保证脱钙效果。
另外，由于大鼠头颅骨之间结合疏松，骨质较软，清除颅骨附着组织时应避免牵拉和挤压而造成颅骨结构破坏，宜使用锋利的剪刀、刀片小心修剪，避免暴力牵拉。
由于EDTA脱钙周期较长，我们在脱钙前使用多聚甲醛对大鼠颅骨进行固定，可进一步保护颞骨内蛋白质，最大限度保存蛋白质的抗原性[14]。
我们利用颞骨解剖学特点，选择定位于细胞膜内的AQP1[15]及定位于胞质内的α-tubulin[16]作为目标蛋白，实现对颞骨内不同组织结构蛋白表达的观察。
我们发现，两组取材过程中，颅骨硬度适当，颞骨可轻松切下，无砂砾感，切下的颞骨无松散及组织脱落。