骨组织脱钙技术及其应用
骨的煅烧和骨的脱钙实验
骨的煅烧和骨的脱钙实验骨骼是人体重要的组成部分，它不仅是身体的支撑系统，还有储存钙质、造血等重要功能。
骨骼中含有大量的有机和无机成分，其中有机成分主要是胶原蛋白，无机成分主要是磷酸钙。
骨的煅烧和骨的脱钙实验是研究骨骼组成的常用方法。
一、骨的煅烧实验骨的煅烧实验是一种通过高温处理来研究骨骼组成的方法。
该实验的原理是将骨骼样品加热至高温，使有机物质被分解，从而得到无机物质的残留物。
该残留物主要由磷酸钙和少量的其他无机盐组成。
该实验的步骤如下：1. 取骨骼样品，去除软组织，洗净并晾干。
2. 将样品放入炉中，加热至800℃左右，保持一定时间。
3. 取出样品，冷却后得到煅烧后的骨骼样品。
4. 对样品进行质量分析和化学分析。
通过煅烧实验得到的残留物主要是磷酸钙，因此可以通过测定残留物的重量和磷酸钙的含量来计算出煅烧前骨骼中磷酸钙的含量。
二、骨的脱钙实验骨的脱钙实验是一种通过化学方法去除骨骼中的钙质，从而研究骨骼有机成分的方法。
该实验的原理是将骨骼样品加入强酸中，使钙质溶解，从而得到有机物质的残留物。
该残留物主要由胶原蛋白等有机成分组成。
该实验的步骤如下：1. 取骨骼样品，去除软组织，洗净并晾干。
2. 将样品放入强酸中，如盐酸或硝酸，使钙质溶解。
3. 取出样品，冲洗干净，晾干。
4. 对样品进行质量分析和化学分析。
通过脱钙实验得到的残留物主要是胶原蛋白等有机成分，因此可以通过测定残留物的重量和有机成分的含量来计算出脱钙前骨骼中有机成分的含量。
总结骨的煅烧和骨的脱钙实验是研究骨骼组成的重要方法。
通过这些实验可以得到骨骼中有机和无机成分的含量，从而更深入地了解骨骼的构成和作用。
这些实验不仅可以用于医学研究，也可以应用于材料科学、地质学等领域的研究。
新型超声组织处理仪在骨组织快速脱钙及制片技术中的应用
新型超声组织处理仪在骨组织快速脱钙及制片技术中的应用韩福兰;黄勋福;吴燕杏;曾敏
【期刊名称】《现代医院》
【年(卷),期】2013(013)012
【摘要】目的探讨新型超声组织处理仪(JYCL-2)在骨组织快速脱钙及快速石蜡制片技术中的应用.方法用10％～ 15％甲酸甲醛脱钙液配合该仪器的超声波技术结合水浴加温,加快骨组织脱钙;用BT生物组织处理剂和BT生物环保透明剂加快组织脱水、透明、浸蜡速度.结果本方法能够使骨组织快速脱钙并快速制出石蜡切片,用这些切片制作常规HE、免疫组化及组织化学染色,细胞组织结构完好,质量优良,与常规骨组织脱钙制作切片的质量无明显差别.结论用JYCL-2超声波对骨组织脱钙及脱水时间明显缩短,脱钙及染色效果良好.
【总页数】3页(P62-64)
【作者】韩福兰;黄勋福;吴燕杏;曾敏
【作者单位】佛山市中医院广东佛山528000;佛山市中医院广东佛山528000;佛山市中医院广东佛山528000;佛山市中医院广东佛山528000
【正文语种】中文
【相关文献】
1.新型超声组织处理仪在病理快速石蜡制片技术中的应用 [J], 梁英杰;罗灿峤;林汉良
2.改良快速骨组织脱钙法在临床骨肿瘤病理诊断中的应用 [J], 邓志勇;顾静凤;周静;李海;陈芳;丁敏;姚丽倩;陈金珍;张阳;徐松;郑晓娟
3.Von Ebner氏脱钙液利用超声微波技术在骨组织脱钙中的研究与分析 [J], 曹留炳;仲爱芳
4.改良快速骨组织脱钙法在笼养蛋鸡骨质疏松症病理诊断中的应用 [J], 吕文亭;王鹏;杨永红;马利芹
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骨组织的脱钙及其免疫组织化学技术的探讨
３ ．骨 组 织 的 快 速 脱 钙 方 法
仁 ，胞 浆 嗜酸 性 ，有突 起 ，电 镜 下 可 见 微 绒 毛 。破 骨 细 胞
含 有丰 富 的酸 性磷 酸 酶 和胶 原 酶 。骨 细 胞 间质 由有 机 质 和 无 机质 两种 成 分 紧密 结 合 而成 。无 机 质 是 骨 盐 （ 要 是 羟 主 基 磷灰 石 ） 。有机 质包 括骨 胶纤 维和 无定 形 的有 机 质 。骨 胶 纤维 即骨 中的胶 原纤 维 ，构成 骨 胶 原 纤 维 的 蛋 白质 为 Ｉ型
Ｃ ）技术是 用 已知的标 记的特异性 抗体 或抗 原对组 织 内相应 Ｓ 抗 原或抗 体进 行定 性 、定 位 或定 量 检 测 ，经 组 织化 学 反 应 ， 使标 记 于特异 性 抗 体 的 酶 、金 属 及 荧 光 素 等 呈 现 出某 种 颜 色 ，并 借助于 光镜 、荧 光显微镜 及 电子显微 镜等 观 察所 显示 的颜 色 和变化 ，从 而 了解抗原 或抗 体结 合部 位 和含 量 的一 门
面 ：一是 组织 块过 大 ，固定剂 未能充 分浸透使 组 织 中心 部位 的抗原溶 解 、弥散 或丢失 ；二 是福尔 马林 固定 时间 过长 ，因
百－ 茎氨基 交联 而 降低 抗 原 性 ；三 是 固定 液 的 种类 、浓度 和 温 度对一些 特殊 抗原 有很 大的 破坏 作用 ，如 浓 度超 过 ２ 的醛 类 固定剂 、０ ４ 苯 二酮 等对 ５羟色胺抗 原保存 不利 ［ ］ ． 一 １ 。
骨 是构 成 人 体 骨骼 的 主要 器 官 ，它 由骨 组 织 、骨 膜
关节 和 关节 软骨 构 成 。骨组 织 由骨 细 胞 和 细 胞 间 质 （ 称 又 骨 间质 ）构成 。骨 的细 胞成 分 有 ：① 成 骨 细 胞 ，其 形 态 与 静止 及 活跃状 态 有关 ，呈梭 形 。成 骨 细 胞能 产 生骨 样 基 质 ， 由骨 样 基质 与其 周边 的成 骨 细 胞 构 成 骨 样 组 织 ，Ｈ ・ 染 Ｅ 色呈 粉 红色 。② 骨 细胞 ，位 于 骨 陷 窝 内 ，呈 小 梭 形 。骨 细 胞 可 分成 最年 轻 的骨 细 胞 、较成 熟 的骨 细胞 和成 熟 的骨 细 三种形 态 结构 ，他们 的功 能 随 细胞 的 年 龄 而 不 同 。③ 破 骨 细胞 ，为 多 核 巨 细 胞 ，可 有 １ 一 ２ Ｏ Ｏ个 核 ，核 淡 染 ，有 核
快速脱钙液在骨组织脱钙中的应用效果-病理学论文-基础医学论文-医学论文
快速脱钙液在骨组织脱钙中的应用效果-病理学论文-基础医学论文-医学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——含有骨质的肿瘤，钙化组织及骨髓穿刺组织都很坚硬，要想制成几微米的漂亮HE 切片是很困难的。
脱钙液是决定骨骼、牙齿、病理性钙化或骨化组织切片质量、染色效果的关键技术之一。
目前使用的脱钙液大多数是无机强酸类制剂，虽然脱钙效果好，但造成组织形态，特别是细胞结构的破坏。
因此，在本实验中我们选择了传统的脱钙液和快速脱钙液两种脱钙液进行比较，进而寻找一种更适合于骨组织脱钙的方法。
研究中发现快速脱钙液在不破坏组织结构及影响染色的同时，它可促进脱钙并加快脱钙速度，防止纤维性组织过度膨胀，并且保证了切片的质量，现报道如下。
1 材料与方法1．1 材料收集内蒙古医科大学附属医院2009 －2011 年手术切除的骨肿瘤、病变骨及骨髓穿刺病人标本共40 例。
根据标本的不同将骨组织取成体积为1．5cm 1．5 cm 0．5 cm 的薄片( 骨髓一般直径均为0．1 cm) ，放入10% 中性福尔马林固定24 h，用于脱钙实验。
1．2 普通脱钙液及脱钙方法与步骤普通脱钙液是5%的硝酸，即5 ml 硝酸加入95ml 蒸馏水配制而成。
具体脱钙步骤: ①先把大块骨组织标本切成小段，小块骨组织标本不用改刀，然后放入10%中性福尔马林中固定24 h 左右后再进行脱钙。
②将待脱钙的标本放入5% 硝酸脱钙液中，脱钙液不少于待脱钙标本总体积的10 倍。
③室温下进行脱钙: 骨髓穿刺标本需30 －60 min，肋骨、指趾骨需3 －6 d，皮质骨需要5 －7 d。
④脱钙后的组织经流水冲洗后进行取材、脱水、透明、常规石蜡包埋、制片。
1．3 快速脱钙液及脱钙方法与步骤快速脱钙液是由36% －38% 盐酸8 ml、冰醋酸5 ml、水杨酸10 g 、蒸馏水87 ml 混合而成。
用微波炉进行微波时，微波辐射可加速组织内部分子运动，加快脱钙速度，因标本在酸性溶液中滞留的时间短，所以对组织的损伤小。
骨组织电镜脱钙技术在免疫组化中的应用
骨组织电镜脱钙技术在免疫组化中的应用朱礼国，汤显斌，张健，赵伦华，程少华【关键词】骨组织［关键词］骨组织；电镜；脱钙骨组织的免疫组化一直是病理技术中的一大难题。
由于骨组织中60％以上为钙盐组成的羟基磷灰石结晶，因此骨组织固定、脱钙都是制备标本的重要环节。
一些强酸如盐酸、硝酸等虽能快速有效除去骨组织中的钙盐，但对其中的抗原蛋白也产生了致命性破坏［1，2］;近几年进展的微波辅助EDTA脱钙技术［3］，尽管可实现较好地爱惜组织抗原性且快速的成效，但操作程序复杂。
骨组织的电镜制片技术对组织固定与脱钙要求均远高于常规染色与免疫组化，其脱钙液与固定液均与其他方式有较大不同，本实验用该方式进行骨组织免疫组化，取得了较理想的成效，现报导如下。
1 材料与方式1．1 材料健康成年日本大耳白兔60只，体重±0．25)kg，雌雄不限，依如实验要求分为对照组与对照组；由武汉大学动物实验中心提供。
一抗为兔VEGF单克隆抗体，美国Neo Markers公司(Ab3，JH121)；二抗为鼠抗兔VEGF单克隆抗体，迈新公司(KIT9701SPMouse)试剂盒。
1．2 固定液配制固定液配方如下：多聚甲醛2 g，蒸馏水25 ml，lN氢氧化钠1滴~3滴，25％戊二醛10 ml，依次加入后加入0．2 mol磷酸缓冲液至50 ml［4］。
1．3 脱钙液配制脱钙液配方如下EDTA2 Na 40 g~50 g，蒸馏水500 ml， g NaOH 350 ml，再加蒸馏水至1 000 ml［4］。
1．4 组织处置程序实验终止后处死大白兔，取后腿骨，将股骨头沿正中冠状面劈开，然后将其截成0．5 cm×0．3 cm× cm大小骨片，生理盐水清洗后当即投入强冷后固定液中，4 ℃固定12 h~24 h；固定终止后骨片在0．2 mol磷酸缓冲液中充分漂洗后，投入脱钙液中，4 ℃下脱钙，每日检查脱钙情形，直至骨片脱钙完全为止，密质骨大约3周~4周，松质骨约7 d~10 d;脱钙终止后，骨片用蒸馏水冲洗20 min，然后进入常规脱水处置程序并包埋、切片。
骨骼脱钙实验报告
甜豌豆-“甜脆皮”“甜脆皮”属早熟矮秧食英品种，株高50―80厘米，全生育期90天，每株结英5―10个，每英5―6粒，茎蔓生，花白色，种子为园校形有皱呈黄绦色，百粒重18克左右，鲜英肉厚多汁，清脆香甜，品质超过荷兰豆，是一种新型绿色保健营养蔬菜，亩产青英约1500斤左右。
生育期间要求凉爽而湿润的气候，种子发芽适宜温度为6―12℃，最低1―2℃。
在高温高湿或低温高湿的条件下易烂籽。
苗期较耐寒，不耐高温，生长期间气温以15℃为宜，温度提高可促进早熟，开花后要求15―18℃，结英成熟期18―20℃，气温高于26℃影响品质及产量。
它为长日照作物，长日照可提早开花。
生育期间需水较多，种子膨胀发芽需吸收种于本身重量100―120％的水分，吐丝、开花及结英期，也需有充足的水分，宜种植于排水良好酌粘性土壤；pH值5.6―6.7，较耐脊薄。
栽培要点“甜脆皮”与荷兰豆及普通豌豆栽培管理措施相似，只要注意病虫害防治，精心管理，在苗全、苗杜的基础上夺丰收，可以取得较高的经济效益。
(一)种植方式不宜连作，可平作也可与生育期相似的大麦和春麦混播。
宜选用玉米水稻、曾薯病虫害少，草少的作物为前作。
(二)整地与播种播种前需深耕细耙；土壤疏松、有利于根系发育，有条件可施用充足的有机肥，播种时每亩10―20斤磷酸二铵作种肥，并投毒谷防地下害虫。
播种期因地区而易，华北、东北为春播，南方为冬播，一般在10月下旬至11月底播种，北方冬季可采用温室、塑料大棚种植。
播种方式：条播或穴播，行距30cm左右，穴播每穴2―3粒，穴距10cm。
播量每亩一般为20―30斤，若田间管理粗放。
可适当加大播量，播种深度3―5厘米，不宜过深，不得大于7厘米。
播种可晒种，选种或采用增产菌拌种，提高种子发芽率，使苗全苗壮。
(三)田间管理1、施肥：以基肥为主，重施磷钾肥，氮磷钟比例为1:0.28:0.93，一般吐丝期结合灌水每亩施尿素10―20斤，开花至结英喷微肥及磷酸二氢钾，浓度为500一1000倍，对改善籽粒品质及增产有明显效果。
骨组织脱钙方法
骨组织脱钙方法
一、化学脱钙法
化学脱钙法是一种常用的骨组织脱钙方法，通过使用酸性溶液或者强酸来溶解骨组织中的钙盐，从而去除骨组织中的钙离子。
常用的化学脱钙溶液包括盐酸、硝酸、硫酸等。
这种方法的优点是操作简单、脱钙效果好，但同时也存在一些缺点，如酸性溶液对骨组织本身有一定的损伤，且脱钙过程中会产生有毒气体，需要良好的通风设施。
二、酶解脱钙法
酶解脱钙法是一种较为温和的骨组织脱钙方法，通过使用酶制剂来分解骨组织中的胶原蛋白和钙盐，从而达到脱钙的目的。
常用的酶制剂包括胶原酶、弹性蛋白酶等。
酶解脱钙法的优点是操作简单、对骨组织损伤小、不产生有毒气体，但同时也存在一些缺点，如脱钙速度较慢，需要较长时间才能完成脱钙。
三、微波脱钙法
微波脱钙法是一种新型的骨组织脱钙方法，通过使用微波辐射来加速骨组织中的水分子运动，产生热量使骨组织内部的温度升高，从而加
速骨组织中的钙盐溶解和脱钙过程。
微波脱钙法的优点是脱钙效果好、速度快、对骨组织损伤小，但同时也存在一些缺点，如需要使用特殊的微波设备，且操作技术要求较高。
综上所述，不同的骨组织脱钙方法各有优缺点，应根据实际需求和实验条件选择适合的脱钙方法。
骨组织脱钙液介绍
骨组织脱钙液介绍骨组织脱钙液概述在病理实验制作切片时，我们会经常碰到一些含钙组织，而且钙十分坚硬。
由于组织中的钙和石蜡之间的密度不同，含钙的组织一般不能直接制作切片。
骨组织含钙量最多。
除了骨组织之外其它组织也可发生钙化，在组织中形成钙化区，所以需要经过脱钙过程。
脱钙是制作骨组织切片的重要环节，尤其是要进行免疫组织化学染色的骨组织。
为达到骨组织既充分脱钙，又保护骨组织的抗原不受破坏，需要对含钙的织固定之后再进行脱钙或采用固定兼有脱钙的液体处理，固定并脱钙。
然后再行常规制片。
用于脱钙的试剂很多，脱钙剂包括有机酸、无机酸、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid EDTA）除此之外还有电解脱钙法。
强有机酸，如硝酸和盐酸可用于密皮质骨的脱钙，在短时间内可除去大量的钙。
令人遗憾的是这些强酸对组织形态会产生不良影响，脱钙作用强对组织破坏性大。
细小的组织，例如，骨髓组织不推荐用强酸脱钙。
虽然可以使用各种附加剂，如缓冲液具有保护组织的作用，但也降低了脱钙速度。
因此，各种脱钙液的配方都围绕着脱钙速度和消除对组织的不良影响而设计。
在酸类脱钙液中醋酸和甲酸比较适合于骨髓组织脱钙。
甲酸是一种使用范围较广的脱钙剂。
甲酸脱钙 10% 浓度比较合适。
醋酸和甲酸的作用比较弱，脱钙速度比较慢，它们不适合密皮质骨的脱钙。
EDTA 是一种比较温和的脱钙剂（EDTA 不是酸）。
对组织的渗透性差，作用慢。
大剂量使用价格较贵。
电解脱钙对组织损害最小，因为它的脱钙速度太慢，所以，不适合常规使用。
不同的脱钙液对骨组织的脱钙作用不同，脱钙效果也不完全相同。
为了达到良好的脱钙效果，建议使用EDTA脱钙液，该脱钙液对组织损伤较小，缺点就是脱钙时间会比较长些，但脱钙时间也要根据组织块大小而定。
目前国内生产EDTA脱钙液的公司也很少，个人感觉上海舜百生物的EDTA脱钙液使用效果还不错，脱钙脱的比较彻底，而且对组织损伤很小，就是周期长了些。
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骨组织脱钙技术及其应用张绪斌;熊正文;张华东;解放军第【摘要】@@ 骨组织不同于一般的软组织,是一种坚硬的结缔组织,由粘多糖和一些胶原纤维样骨胶纤维构成的骨样组织和沉着于其中的无机盐(骨盐)形成的.【期刊名称】《医学理论与实践》【年(卷),期】2011(024)011【总页数】4页(P1264-1267)【关键词】骨组织;脱钙技术;应用【作者】张绪斌;熊正文;张华东;解放军第【作者单位】解放军第251医院,河北省张家口市,075000;解放军第251医院,河北省张家口市,075000;解放军第251医院,河北省张家口市,075000;解放军第251医院,河北省张家口市,075000【正文语种】中文【中图分类】R954.65;R392.1骨组织不同于一般的软组织,是一种坚硬的结缔组织,由粘多糖和一些胶原纤维样骨胶纤维构成的骨样组织和沉着于其中的无机盐(骨盐)形成的。
无机盐以羟基磷灰石结晶的形式存在,其中绝大部分为水合磷酸钙,此外还包括微量碳酸盐和柠檬酸盐等[1,2],因此骨和其他一些已钙化的组织在脱水、透明等制片前必须将组织中的钙盐用脱钙剂除去,才能制成4～5μm厚的切片。
目前,常用的脱钙剂主要有单纯酸类、混合酸类、螯合剂、离子交换树脂和电解脱钙等方法[3～6],尤其是近年来应用微波技术辅助脱钙明显缩短了脱钙时间,改善了HE、组织化学、免疫组织化学染色和原位杂交[7～11]。
现将骨组织的脱钙技术及应用等有关内容简介如下。
1 骨组织的组织学特点[1,2]骨组织由骨基质和骨细胞组成,骨基质是由有机物质和无机物质紧密结合而成,主要成分有:(1)胶原纤维:为Ⅰ型胶原;(2)粘蛋白:为胶原纤维间的无定型物质;(3)骨盐:主要是羟基磷灰石;(4)酶:包括碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和胶原酶等。
软骨基质是由软骨母细胞分泌丰富的蛋白多糖组成的,HE染色呈淡蓝色,A lcian蓝染色阳性(蓝色),甲苯胺蓝呈异染性反应(紫红色),软骨的胶原属Ⅱ型胶原。
骨及软骨的细胞成分有:(1)骨母细胞,其形态与静止及活跃状态有关,前者呈梭形;后者常为多边形或椭圆形。
胞体大、核偏位、胞浆丰富、嗜碱性。
骨母细胞能产生骨样基质,由骨样基质与其周边的骨母细胞构成了骨样组织,HE染色呈粉红;(2)骨细胞位于骨陷窝内,常呈小梭形;(3)软骨母细胞,胞体为卵圆形,常伴随软骨基质而存在;(4)破骨细胞(Osteoclast)为一种多核巨细胞,可有10～20个核,核淡染,有核仁,胞浆嗜酸有突起,电镜下可见微绒毛,破骨细胞含有丰富的酸性磷酸酶和胶原酶。
2 骨组织的固定由于骨组织致密、坚硬,并含有骨胶等成分,所以骨组织的固定、脱水、透明、包埋等都很困难。
不论是HE染色、组化染色,还是免疫组织化学染色都要求将组织及时固定,其目的是为了保存良好的组织形态结构、防止组织自溶,阻止内、外源性细胞内分解酶活性和保存某些特殊抗原[1,12]。
骨组织固定的方法主要有先固定后脱钙、固定脱钙同时进行和先脱钙后固定三种方式[13]。
常用的固定剂主要有福尔马林、多聚甲醛、戊二醛、丙酮、乙醇及碳化二亚铵等,它们都具有良好的固定作用。
固定不当对抗原性有很大的影响,主要表现在三个方面,一是组织过大固定时间不够,使组织中心部位的抗原溶解、弥散或丢失;二是在福尔马林固定时间过长,因醛-氨基交联而降低抗原性;三是固定液的种类、浓度和温度对一些特殊抗原有很大的破坏作用[1,12]。
离体组织应采用10%的福尔马林或4%多聚甲醛磷酸缓冲液(pH 7.4)及时浸泡固定,也可用120～150W 的微波(microwave,MW)辅助固定液、或生理盐水固定3～5m in,组织块的大小以1.2cm×0.8cm×0.2cm为好,需电镜检查的材料可加入0.05%～0.5%的戊二醛[2]。
3 骨组织的常用脱钙方法及脱钙液3.1 单纯酸类脱钙剂主要有甲酸、硝酸、盐酸、三氯乙酸和硫酸等,尤其是甲酸和硝酸在骨组织的脱钙中应用较其他单纯酸多[9,13]。
甲酸又称蚁酸,是一种良好的常规脱钙剂,其作用缓慢,对组织损害小,使用浓度5%～50%,浓度越高、脱钙时间越短,使用时应随时注意观察[9,13]。
通过对比5%、8%、10%和13%硝酸脱钙液的浓度,以8%～10%浓度的硝酸,脱钙效果最好。
8%硝酸室温下脱钙骨密质需要24～36h,骨松质需要12～24h,蜡块中的组织块及切片均呈淡黄色,阳性免疫组织化学染色极差,背景较深。
硝酸是临床病理活检中最实用的一种常规脱钙剂,脱钙迅速、完全可靠、作用强、时间短、效果好,但是对骨组织的破坏作用较大[13]。
采用低温MW-8%硝酸脱钙骨密质需要50～55min,骨松质需要30～35m in,其石蜡切片完整、HE染色对比好,IHCS标记阳性细胞比室温条件下硝酸脱钙的多、着色深、背景最淡[5,6,9]。
使用硝酸脱钙时由于亚硝酸形成使组织呈黄色而影响其后的染色,在室温条件下更明显,在纯硝酸中加入0.1%的尿素可防止变黄。
3.2 混合酸类脱钙剂混合酸类脱钙液是指两种酸类脱钙剂一起使用,或在单纯酸内加入另一种脱钙剂或少量的其他试剂所配制的脱钙液,这类脱钙液的特点是脱钙完全、快速,防止纤维组织过度膨胀,减少组织破坏及对染色的影响。
通过加入不同的化学成分可以弥补单纯酸类脱钙液的不足,所以混合酸类脱钙液越来越受到人们的欢迎。
常用的混合酸类脱钙液主要有甲酸-甲醛脱钙液、甲酸-柠檬酸钠液、Schm orl's液、Von Ebner氏液、Jenkins氏液、Plank-Rycho 氏液、Richman 氏液、Jy-Ⅰ 、Jy-Ⅱ氏液、Schcidde氏液等[9,13]。
3.3 螯合剂脱钙技术螯合剂属于有机化合物,因其可与金属离子结合而把它作为脱钙剂使用,如乙二胺四乙酸钠(EDTA)、柠檬酸钠等。
柠檬酸钠对组织损害较大、产生气泡、脱钙时间长,所以很少使用。
EDTA具有对组织破坏小、不产生气泡、不影响染色、pH值近中性等优点,所以使用较多。
在4%、7%、10%、13%和16%EDTA脱钙液浓度中,以10%、13%浓度的脱钙效果最好。
室温下使用EDTA 脱钙(20℃),骨密质需要 35～40d,骨松质需要30～35d,石蜡切片完整,HE染色对比好,IHCS阳性细胞数量多、着色深、背景淡。
低温MW-10%EDTA脱钙,骨密质需要9～10h,骨松质需要7～8h,石蜡切片、HE及IHCS比室温条件下脱钙好、时间明显缩短[1,10,14]。
3.4 离子交换树脂技术离子交换树脂脱钙是一种非常理想的脱钙技术,它能使脱钙液中的钙离子快速除去,确保骨组织中钙能充分地、通畅地溶出,以最大程度地提高脱钙液的效率,加速脱钙速度,缩短脱钙时间,为HE、组化和免疫组化染色提供有利条件。
其方法是将氨型磺化聚苯乙烯树脂铺在脱钙容器底部厚度约1.5cm,将脱钙组织放在树脂上面,加入有机酸(不可加入无机酸)脱钙液,脱钙液的用量为脱钙组织体积的20～30倍[13]。
3.5 电解脱钙技术电解脱钙是将两电极插入脱钙液中,使脱钙液内有电流通过,将脱钙液中的钙离子吸引到阴极而发生电离作用,加速脱钙过程、缩短脱钙时间,尤其是大量标本脱钙或是标本体积大时效果更好。
电解脱钙的原理是在容器内装脱钙液150m l,取一根铂金丝将标本缠绕数圈,放在容器一侧,铂金丝另一端连接电源正极,在容器另一侧,将一支钢片或炭精棒的下端插入电解脱钙液内,上端与电源负极相接,在正、负极之间隔置一块绝缘的有机玻璃或塑料板,以防电极接触而引起导电,将已装好的导电装置置于37～45℃恒温水浴箱中,接通电源即可脱钙。
此方法简便易行,染色效果好,一般数分钟至数小时即可完成脱钙[3]。
3.6 脱钙机脱钙技术近年来随着科学技术的不断发展,骨组织的脱钙技术也有了新的发展,利用超声波、电离等技术生产的脱钙机也应运而生,但由于经济状况和技术条件的限制,目前国内大部分实验室都还不具备这种设备。
脱钙机脱钙技术尚不十分完善,目前国外的脱钙机主要为加热恒温法、超声波法、电离法、真空负压法等,但这些方法都需要酸类脱钙剂参与,脱钙液对组织形态结构、抗原性的破坏,对染色的影响还是不可避免。
脱钙机加快了脱钙速度,缩短了脱钙时间,减少了长时间脱钙对组织形态结构、抗原性等的损害,使脱钙效果更好,解决了人工无法解决的许多技术难题[13]。
4 骨组织的低温-微波快速脱钙技术研究4.1 微波特性生物物理学持性与应用 MW是一种高频电磁波,频率为300～300 000MHz,波长1mm～1m,生物医学中常用的频率为 2 450、915、434MHz,目前微波炉所用频率为2 450MH z,波长12.5cm。
MW的透入深度与频率成反比,与波长成正比,频率高,波长短,其辐射方向性好,能量易于集中,但透入深度小;反之则方向性差,能量不易于集中,透入深度大。
MW与光波不同,属于非电离辐射,不能使键能最弱的氢键断裂。
当MW作用于生物体或介质时,因吸收MW而使温度升高,发生热效应。
MW不发生热传递,热效应产生的多少与生物体内的水分、介质中的极性分子或离子浓度等成正比。
MW产热的原理是排列混乱的极性分子、离子等在电场力的作用下使它们振动、运动、相互摩擦、碰撞,而产生热量,使组织细胞或介质的温度升高[2,15]。
自从MW首次用于固定动物实验材料获得成功,随后大量的研究结果证实,MW在常规制片、冰冻切片、组化、免疫组化、原杂交和电镜制片等领域均获得了十分好的效果[2,8,11,16]。
国内外文献对临床病理活体检查骨组织的脱钙及脱钙液有较多的研究,但对IHCS所用材料的研究较少,国外学者在内耳的免疫组化研究中使用EDTA脱钙获得了较好的效果,但所需时间长达3～4周,有的甚至需数月(4～7个月),很难满足临床活检病理诊断和研究的需要[10,17]。
4.2 骨组织的低温-微波快速脱钙技术研究根据MW热效应的原理,在对脱钙液的种类、脱钙温度等进行较深入研究的基础上,将MW与硝酸、EDTA等脱钙液相结合,创用的“低温MW-快速脱钙技术”,使脱钙组织的组织形态结构、抗原性均得到了很好的保存,而且脱钙时间显著缩短,在骨肿瘤和内耳等的IHCS中收到了很好的效果[1,11,17]。
研究结果显示[1,2,18,19]:(1)钙液的温度对IHCS结果有十分明显的影响,低温条件下脱钙对抗原性有很好的保护作用;(2)脱钙液的种类对抗原性无明显影响;(3)将低温微波技术与硝酸、甲酸和EDTA等脱钙方法结合,由于缩短了脱钙时间,使抗原性得到了很好的保存;(4)合理使用抗原修复技术可以使石蜡切片或冰冻切片的抗原性得到很好的恢复;(5)石蜡切片比冰冻切片能更好的保护组织形态结构。
4.3 低温MW-硝酸快速脱钙的方法[2,6,14] (1)取4～5个月龄豚鼠耳蜗、家兔的后腿骨及骨肿瘤等待脱钙的骨及脱化组织,大小为l.2cm×0.8cm×0.4cm,用10%福尔马林固定12h、流水冲洗0.5～1h。