骨髓活检组织EBER原位杂交检测影响因素分析
EBER原位杂交检测中手工与BenchMark ULTRA自动化染色差异
工检测酶消化时间不容易把握、阳性信号强度较弱；切片过
①
厚，细胞重叠不利于观察，也更容易掉片。（４）结果判读：手
工检测使用 ＤＡＢ显色，苏木精复染，形态结构清晰，判读容
易；全自动检测 ＥＢＥＲ阳性部位显示为紫色（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ显
色），背景染色为核固红。核固红在细胞中的着色较均匀一 致，与组织形 态 对 比 度 略 显 不 够 ［２］。 （５）样 本 前 处 理：手 术
［４］ 《免疫组织化学检测技术共识》编写组，高 颖，庞 钧，等． 免疫组织化学检测 技 术 共 识 ［Ｊ］．中 华 病 理 学 杂 志，２０１９，４８ （２）：８７－９１．
３ 讨论
两种 ＥＢＥＲ原位杂交检测方法均适用于手术切除标本 和活检小组织。穿刺取样可能对组织形态和结构造成不可 逆影响，在组织形态和结构受到破坏的区域，细胞内的蛋白 质和核酸无法得到很好保存，导致这些区域出现非特异染色 或阳性染色信号减少。本组选取了 ４例 ５～６年前手术切除 样本，两种检测方式均能取得很好的检测结果。由此推断， 在 样 本 前 处 理 得 当 的 情 况 下，ＥＢＶ核 酸 能 够 在 常 规 石 蜡 样 本中有效保存较长时间不被降解，可选用 ５年内前处理良好 的蜡块进行 ＥＢＥＲ原位杂交。
针、手工试 剂 盒 为 ＤＮＡ探 针。ＤＮＡ探 针 的 特 点 是 特 异 性
③
高、形成的杂交体稳定、不产生自身粘连，不需灭活 ＲＮＡ酶，
但实验全程需佩戴口罩、手套，寡核苷酸探针的特点是特异
性高、杂交时间 短、特 异 性 和 敏 感 性 相 对 略 低。 （９）不 同 样
本类型建议选择不同的适合的检测方法。（１０）全自动免疫
的特异性、敏感性方面优于全自动检测，使用全自动检测存 在假阴性的风 险，我 们 需 评 估 全 自 动 检 测 带 来 的 假 阴 性 风 险，穿刺样本建议使用手工试剂盒检测。全自动免疫组化平
核酸原位杂交的影响因素
核酸原位杂交的影响因素
以核酸原位杂交的影响因素为题，我们需要了解什么是核酸原位杂交。
核酸原位杂交是一种分子生物学技术，用于检测细胞或组织中的特定核酸序列。
它可以用来确定基因的位置、表达和拷贝数目，以及检测病毒和细菌等微生物的存在。
1. 样本制备：样本制备是核酸原位杂交的关键步骤之一。
样本的处理和固定方法会影响到杂交的结果。
如果样本处理不当，可能会导致核酸的降解或失去活性，从而影响杂交的准确性。
2. 杂交条件：杂交条件包括温度、盐浓度、pH值等。
这些条件会影响到探针与目标核酸的结合情况。
如果杂交条件不合适，可能会导致探针与目标核酸结合不紧密，从而影响杂交的准确性。
3. 探针的选择：探针的选择是核酸原位杂交的另一个关键因素。
探针的长度、序列和标记方式都会影响到杂交的结果。
如果探针的序列与目标核酸不匹配，或者探针的标记方式不合适，可能会导致杂交的准确性下降。
4. 信号检测：信号检测是核酸原位杂交的最后一步。
信号的检测方法包括荧光显微镜、放射性计数等。
如果信号检测方法不合适，可能会导致信号的检测灵敏度不足，从而影响杂交的准确性。
核酸原位杂交的影响因素包括样本制备、杂交条件、探针的选择和
信号检测等。
在进行核酸原位杂交实验时，需要注意这些因素，以保证实验结果的准确性和可靠性。
EB病毒感染的核酸检测:标本类型的选择
EB病毒感染的核酸检测：标本类型的选择郭建巍【摘要】近年来的研究表明,EB病毒(epstein-barr virus,EBV)感染与多种疾病的发生有密切的关系.由于EB病毒独特的感染方式,其实验室诊断特别是核酸检测显得尤为重要.本文就EB病毒的生物学特性、感染方式、抗体产生,特别是核酸检测中标本类型的选择、标准化以及未来的检测方向等问题进行了述评和展望,以期为EB病毒感染相关疾病的诊断和预后评判提供更准确的核酸检测结果.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2016(008)003【总页数】5页(P145-149)【关键词】EB病毒;标本;血浆;外周血单个核细胞【作者】郭建巍【作者单位】海军总医院检验科,北京100048【正文语种】中文★通讯作者：郭建巍，E-mail：**************EB病毒（epstein-barr virus，EBV）即人类疱疹病毒Ⅳ型（human herpesvirus type 4），是一种常见的人类疱疹病毒。
EBV初次感染后就终生定居在B细胞中。
据文献报道，约90%以上的成人EB病毒血清学反应阳性，提示在儿童或青少年时感染过EB病毒［1］。
近年来大量研究证明，EBV与人群鼻咽癌、何杰金病、T/NK细胞淋巴瘤（T/Natural killer cell lymphoma）、Burkitt淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma）、乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤发生、发展相关，还与免疫抑制剂使用患者和多种免疫缺陷性疾病患者移植后淋巴细胞增殖性异常（post-transplant lymphoproliferative disorders，PTLD）、移植后平滑肌肿瘤、获得性免疫缺陷综合症（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）相关性淋巴瘤、多发性硬化、原发性中枢神经系统淋巴瘤或平滑肌肉瘤密切相关［2-7］。
EBER原位杂交用于骨髓涂片中检测EB病毒
２ ．朱德新 ， 江 ， 杜 兰和魁 ， ｘ连锁淋巴细胞异常增 生症一个 中 国 等．
人家系 的临床和基 因研究． 中华医学杂志， ０ ， ： ４ ４ ． ２ ７８ ２ ＿ ８ ０ ７ ４ ２ ３ 吴南海 ， 佐 ， ． 栾 店湘风． 无关脐 血移植 治疗 儿童噬血细胞综 合征．
中 国ｄ Ｊ 血 液 与肿 瘤 杂 志 ，０ ６，１ １５１ ８ ，Ｌ ２０ １ ：１－Ｉ ．
・
２ ０・ ２
中国小儿血液与肿瘤 杂志 ２ １ ００年 １ Ｏ月第 １ ５卷第 ５期
ＪＣ ｉａＰｄａ １ ｄＣｎ ｅ。Ｏ ｔ ｅ ０ ０ Ｖ ｌ ５， ｏ５ ｈｎ ｅ ｉｒ ｏ ａｃｒ ｃｏ ｒ １ ， ｏ １ Ｎ ． ｔＢ ｏ ｂ ２
解 ， 可能 与患儿就 诊及 时 ， 使用 大剂 量丙种 球 这 早期 蛋 白有关 。Ｍ Ｓ是慢 性 风湿 类疾 病 的严重 并 发症 ， Ａ 也是继 发 性 Ｈ Ｈ 的 一 种 ， ８发 病 ３个 月后 才 就 Ｌ 例 诊 ， 管确诊后 及 时给予 Ｈ Ｈ．４方 案 治 疗 ， 原 发 尽 Ｌ ０ 但
７ ．叶 璩 ． ，Ｌ 血细 胞 综 合 征 预 后 相 关 因 素 分 析 ． 国 小 儿 血 液 ， ｄ Ｊ噬 中
２０ １ ５ ５ ． ０ ５， ０： ４－ ６
免疫组化与原位杂交双标记技术检测EB病毒用于诊断鼻咽癌
免疫组化与原位杂交双标记技术检测EB病毒用于诊断鼻咽癌罗俭权;曾秀英;吕镜雄;陈春梅;程思锐;冯天斌【摘要】目的探析鼻咽癌诊断中检测EB病毒更为快速及更灵敏的方法.方法选择2014年4月至2016年8月广东省四会市人民医院收治的36例鼻咽癌患者,分别采用EB病毒一抗、地高辛标记的寡核苷酸EBER探针进行免疫组化和原位杂交双重标记染色,检测鼻咽癌细胞中EB病毒的表达情况.结果免疫组化后的阳性细胞的胞膜表现为红色,原位杂交后的阳性细胞胞核表现为蓝黑色,而双阳性细胞的核与膜呈蓝红色,不仅对比鲜明而且背景非常清晰,双染成功后细胞及组织结构表现完整.结论 EBER原位杂交双标记技术检测EB病毒主要是检测病毒基因,具有极高的特异性和灵敏度,比免疫组化方法更灵敏、快速,可以帮助临床进行鼻咽癌的分期诊断及判断治疗效果.【期刊名称】《实用检验医师杂志》【年(卷),期】2017(009)002【总页数】3页(P77-79)【关键词】鼻咽癌;病理诊断;双标记原位杂交;免疫组化【作者】罗俭权;曾秀英;吕镜雄;陈春梅;程思锐;冯天斌【作者单位】526200 广东肇庆,广东省四会市人民医院;526200 广东肇庆,广东省四会市人民医院;526200 广东肇庆,广东省四会市人民医院;526200 广东肇庆,广东省四会市人民医院;526200 广东肇庆,广东省四会市人民医院;526200 广东肇庆,广东省四会市人民医院【正文语种】中文鼻咽癌是一种在我国南方地区（如广州等）发病率非常高的恶性肿瘤，占鼻咽部恶性肿瘤的97%［1］。
鼻咽癌的治疗除手术外，中医药治疗对于提高患者的生存率有很好的作用［2］。
鼻咽癌又分为鳞状细胞癌和非角化鳞癌；非角化鳞癌又分为混合型癌、圆形细胞癌（未分化型癌）及梭形细胞癌（分化型非角化鳞癌）［3-4］。
我国南方地区发生的鼻咽癌95%属于非角化鳞癌。
鼻咽癌确诊前需活检病理诊断，应用较多的指标是细胞角蛋白（CK）免疫组化染色。
对原位杂交技术中多种影响因素的探讨
下壁导联 Ｒ波振幅≤２５ Ｖ伴Ｑ波， ．ｍ 在排除了右室肥大， 预
激综合征等其他疾病后则提示心肌梗死存在。 大量病理和实
验资料表明心肌梗死厚度不足 ５％， ０ 一般不产生病理性 Ｑ
波， 而仅引起 Ｑ Ｓ波群型的改变， Ｒ波丢失ｌ。第五，Ｔ Ｒ 如 ５ Ｊ Ｓ
Ｈ Ｖ６／ １ Ｐ Ｂ １ 型原位 杂交检 测试 剂盒 购 自北 京 ３１ ０ 医院分 子
性高， 稳定性高等优点， 但在实际操作中， 仍有多种影响因素
值得探讨。 通过挑选已知的人乳头瘤病毒（ Ｐ ）Ｂ １ 型原 Ｈ Ｖ ６ ／１
病理实验室， 探针为地高辛标记， Ｂ ／ ＣＰ 硝基蓝四氮唑 Ｎ ＴＢ Ｉ（
首先进行蛋白酶 Ｋ消化时间的探讨， 取每例切片 １ 张并 分为均等的 ３ ， 组 所有切片均按常规脱蜡至水，．ｍ ｌＬ盐 ０２ ｏ ／
／一 ４氯 ３吲哚磷酸盐） ５ 溴 一 一 底物显色， 细胞核染深蓝色颗粒为
阳性 。 １２ 实验方 法 ．
位杂交强阳性组织块， 并对其进行分组， 分别探讨各种因素
对原位杂交结果的影响。 １ 资料与方法 １１ 一般资料 ． 选用山西医科大学第二医院病理科的外阴、 宫颈活组织 检查标本中， 经原位杂交检测 Ｈ Ｖ Ｂ １ 型为强阳性的蜡块 Ｐ ６／１
顺序， Ｖ 呈 Ｒ 型， 或 ｓ 此时Ｖ 、 。Ｖ 不管Ｑ波多小， 它能够和
［ ３ 王红 宇． ３ 临床心 电系列检查 与诊断［ ． Ｍ］ 北京 ： 科技技
术 文 献 出版 分 社 ， ０ ７： ７ ２０ ８．
病理Ｑ波一样能够诊断心肌梗死。 。 Ｖ ～导联出现小Ｑ波： 或
后差， 可发生严重性室性心律失常， 而导致患者猝死。 缺血性
免疫组化与原位杂交双标记技术检测EB病毒用于诊断鼻咽癌的效果观察
免疫组化与原位杂交双标记技术检测EB病毒用于诊断鼻咽癌的效果观察1. 引言1.1 背景鼻咽癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，其病因尚不完全清楚。
已有研究表明埃波斯坦-巴尔病毒（EB病毒）可能与鼻咽癌的发展密切相关。
EB病毒是一种常见的人类病毒，感染后可引起多种疾病，包括淋巴瘤和鼻咽癌等。
检测EB病毒在鼻咽癌中的存在对于该疾病的诊断和治疗具有重要意义。
当前，免疫组化技术和原位杂交技术被广泛应用于肿瘤诊断和研究中。
免疫组化技术可以通过检测特定抗原的表达水平来判断肿瘤的类型和分级，而原位杂交技术则可以检测病毒的核酸序列，从而确定病毒的存在。
双标记技术结合了免疫组化和原位杂交技术的优势，可以同时检测抗原和核酸，提高了诊断的准确性和可靠性。
本研究旨在通过免疫组化和原位杂交双标记技术检测EB病毒在鼻咽癌中的存在，探讨其在鼻咽癌诊断中的应用以及对该疾病的诊断和治疗的意义。
通过对免疫组化与原位杂交双标记技术的应用效果进行观察和分析，为鼻咽癌的早期诊断和治疗提供更准确的依据。
1.2 研究目的本研究的目的是探讨免疫组化与原位杂交双标记技术在诊断鼻咽癌中的应用效果。
鼻咽癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，而EB病毒被认为是导致鼻咽癌发生的一个重要因素。
通过检测EB病毒在鼻咽组织中的存在情况，可以帮助早期诊断和治疗鼻咽癌。
免疫组化技术是一种通过特定抗体与靶分子结合的技术，可以帮助我们检测出EB病毒在组织中的表达情况。
而原位杂交技术则可以帮助我们检测出EB病毒的基因组在组织中的存在情况。
将两种技术结合起来进行双标记，不仅可以提高对EB病毒的检测灵敏度和准确性，同时也可以更加直观地观察病毒在组织中的分布情况。
通过本研究，我们旨在验证免疫组化与原位杂交双标记技术在鼻咽癌诊断中的准确性和可靠性，为临床提供更好的诊断方法，帮助医生更早地发现和治疗鼻咽癌，提高患者的生存率和生活质量。
1.3 意义鼻咽癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，其发病率逐年增加，给患者的生活质量和健康造成了严重威胁。
两种操作方法在EBER原位杂交染色中的比较与应用
1 标本来源 选取陕西省人民医院病理科 EBER 原位杂交阳
性病例 35 例，其中胃髓样癌 1 例，鼻咽癌 16 例， NK/T 细胞淋巴瘤 5 例，Burkitt 淋巴瘤 2 例，胃腺癌 2 例，弥漫大 B 细胞淋巴瘤 2 例，血管免疫母细胞 T
76
中国组织化学与细胞化学杂志
第 30 卷
细胞淋巴瘤 2 例，经典型霍奇金淋巴瘤 2 例，淋巴 区域滴加适量的 EBER 探针，加盖盖玻片，并密封
EB 病毒 ( Epstein-Barr virus，EBV) 越来越受到 人们的关注，这不仅因为它以潜伏感染的形式广泛
存在于健康人群，更重要的是它与越来越多的恶性 肿瘤关系密切 [1]。EB 病毒编码的小 RNA(Epstein– Barr virus-encoded small RNAs，EBER) 在被感染的 细胞核中以高拷贝数存在 [2]。因此，EBER 的相关 检测已经成为 EB 病毒最重要的检测手段。EBER 显 色原位杂交技术（chromogenic in situ hybridization， CISH）具有定位作用，能够确定病毒与组织和细胞
色时间约为 16h，每隔 20~30min 需要技术人员滴加
5 EBER 原位杂交全自动免疫组织化学染色机染色 各种试剂，且需要 37℃过夜孵育最少 14h，当天无
程序
法完成染色，与仪器组比较更加耗时耗力。
①脱蜡；②罗氏 CC1 缓冲液环境下细胞修复 60min；③加入 ISH Protease 3，消化 20min；④加
材料与方法
〔收稿日期〕2020-07-13 〔修回日期〕2021-02-10 〔基金项目〕陕西省自然科学基础研究计划（2019JM-548） 〔作者简介〕李真真，女（1984 年），汉族，主管技师
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骨髓活检组织EBER原位杂交检测影响因素分析Zheng Jie;Fang Qingquan;Tu Jinhua【摘要】目的探讨骨髓活检组织行EBV encoded RNA(EBER)原位杂交检测的影响因素,优化检测条件以期提高骨髓活检组织中EB病毒的检出率.方法收集35例EB病毒相关疾病的骨髓活检标本,通过对比实验,比较不同脱钙方法、不同蛋白酶K 消化条件、不同抗体孵育温度下的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测的切片质量、脱片率及染色质量情况.结果脱钙以运用改良EDTA脱钙液脱钙20～24h后流水冲洗30min～1h最佳;蛋白酶K消化时间为9min的组织切片脱片率低,杂交效果最好,阳性细胞着色深,定位准确;在37℃条件下进行抗体孵育杂交染色质量为佳.结论选取合适的脱钙方式,延长蛋白酶K消化时间,选择最佳抗体孵育温度,可降低脱片率,显著提高骨髓活检组织行EBER原位杂交检测的染色质量,为EBV相关疾病的诊断和鉴别诊断提供重要依据.【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》【年(卷),期】2019(028)002【总页数】5页(P162-166)【关键词】骨髓活检组织;EBER;原位杂交;影响因素【作者】Zheng Jie;Fang Qingquan;Tu Jinhua【作者单位】;;【正文语种】中文【中图分类】R329.3EBV encoded RNA（EBER）是Epstein-Barr virus（EBV，EB病毒）编码的小RNA，该病毒不仅广泛潜伏于健康人群，而且是一些非肿瘤疾病如传染性单核细胞增多症等的病因。
更重要的是，EB病毒与越来越多的肿瘤性疾病密切相关[1，2]。
EBER原位杂交法因其准确的定位、极高的特异性和灵敏性已成为公认的EB 病毒标准检测方法，并作为病理辅助诊断的重要依据之一在日常工作中应用越来越广泛。
由于原位杂交检测步骤多，容易受各种因素（如组织标本的预处理、标本类型、酶的消化程度、杂交后洗涤等）的影响。
在临床实际工作中对骨髓活检组织行EBER原位杂交检测时，常因组织脱片或者染色结果不稳定需要进行重复实验。
为此，本研究通过实验，从脱钙方法、蛋白酶K消化时间、抗体孵育温度三个影响因素进行优化，摸索较佳的检测条件。
材料与方法1 标本来源收集厦门大学附属第一医院病理科2014年5月—2018年5月间确诊为EB病毒相关疾病且标本类型为骨髓活检组织的病例35例。
其中NKT细胞淋巴瘤18例，EBV相关淋巴组织增殖性疾病17例。
所有标本均经l0%中性福尔马林固定不少于6h。
2 设备与试剂设备：原位杂交仪为Thermo BriteTM公司S500-24 型；试剂：原位杂交检测试剂盒购自福建泰普公司。
脱钙液的配置：①10%硝酸脱钙液：硝酸10ml加入90 ml蒸馏水；②强酸混合脱钙液配制方法：10%中性福尔马林500ml与95%乙醇500ml混合后，加入甲酸200ml，最后缓慢加入浓盐酸150ml；③ 改良EDTA脱钙液配制方法：250g乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）溶于1350ml磷酸盐缓冲液（PBS），待完全溶解后加入40%甲醛150ml，最后加入适量氢氧化钠（NaOH），将pH值调到7.0左右[3]。
3 方法3.1 脱钙方法及脱钙终点的判定将选取的35例标本每例分为三段，分别放入三种不同的脱钙液室温下进行脱钙：A组用10%硝酸脱钙液脱钙1～1.5h后取出流水冲洗30min；B组用强酸混合脱钙液脱钙2-3h后流水冲洗30min；C组用改良EDTA脱钙液脱钙20～24h后流水冲洗30min～1h。
骨髓组织浮起，以尖镊探测骨髓活检组织变软或大头针能轻松刺入组织视为脱钙完成[4]。
3.2 不同脱钙液脱钙后的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测①组织脱水与制片：将脱钙完成后的A、B、C三组骨髓活检标本放入自动脱水机中脱水、透明、浸蜡，包埋。
制片时将组织粘附于APES处理的防脱载玻片，厚度为3μm，60～70℃烤片1h，脱蜡。
②蛋白酶K消化：甩干切片，将组织周围液体用滤纸擦干，滴加蛋白酶K与PBS按1×25比例配制的酶工作液，室温孵育5min，蒸馏水洗1×1min。
③杂交:滴加20μl探针/切片，加盖玻片，原位杂交仪55℃变性 60～90min，37℃杂交 4～16h。
48℃ PBS 缓冲液浸泡，移去盖玻片后PBS继续浸泡洗涤3×5min。
④信号放大和显色: 每张切片分别滴加地高辛染色液试剂A, 37℃孵30min，37℃ PBS浸泡3×2min；试剂B室温孵育30min，PBS浸泡3×2min；试剂C室温30min，PBS浸泡3×2min，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。
比较A、B、C三组的脱片率、切片质量、杂交阳性信号的定位与强度、背景清晰度。
3.3 不同蛋白酶K消化时间的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测将C组用改良EDTA脱钙液脱钙的组织蜡块进行连续切片3片，厚度3μm，随机抽取组成D、E、F四组，分别进行5min、9min、13min间隔4min的梯度消化，其余操作步骤同C组，比较D、E、F三组的脱片率、杂交阳性信号的定位与强度、背景清晰度。
3.4 不同抗体孵育温度下的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测将C组改良EDTA脱钙液脱钙的组织蜡块进行连续切片2片，厚度3μm，蛋白酶K消化9min后，分两组进行对比实验。
G组：滴加试剂A置于37℃水浴箱孵育30min，滴加试剂B室温孵育20min，滴加试剂C室温孵育 30min；F组：试剂A孵育30min、试剂B孵育20min、试剂C 孵育30min均在37℃水浴箱中进行，比较G、F两组杂交阳性性号的定位与强度、背景清晰度。
4 EBER原位杂交的判读与染色质量评估标准细胞核棕黄色为阳性着色，胞浆和胞膜着色不能视为阳性，只有见核分裂时可以出现胞浆阳性着色[5]。
设定组织脱片率、切片质量、杂交阳性信号的位置与强度、背景是否清晰有无黄染四项为评价指标，评分标准为：①切片质量（100分）：切片时组织相对较软，基本能完整切片，不影响诊断，减1～10分；切片时感觉较硬，部分有沙粒感，切片不够平整，不影响诊断，减11～30分；切片时刀片磨损严重，肉眼可见明显刀痕，组织皱缩，无法制成完整切片，影响诊断，减31～100分。
②杂交阳性信号的定位与强度（100分）：阳性信号定位准确，着色较淡，低倍镜下可分辨，不影响诊断，减1～10分；阳性信号定位较准确，着色低倍镜下不易观察，需转换至高倍镜下仔细辨认，不影响诊断，减11～30分；阳性信号定位不准确，着色太弱，无法准确判读，减31～100分。
③背景清晰度（100分）：阳性与阴性细胞对比鲜明，杂交背景轻微黄染，不影响诊断，减1～10分；阳性与阴性细胞对比度不佳，杂交背景出现不同程度黄染，但仍可作出诊断，减11～31分，杂交背景黄染严重，影响诊断，减31～100分。
由2名经验丰富的病理医生阅片进行双盲评分，每项指标数据为评分的均值。
5 统计学分析应用SPSS 22.0 软件进行分析，计数资料采用率的比较，采用χ2 检验，计量资料采用均数±标准差(¯x±s)表示，用配对t检验进行两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果1 不同脱钙方式对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响A、B、C三组切片原位杂交染色质量结果比较见表1。
比较三组脱片率显示，A组（42.9%）的脱片率明显高于B（14.3%）、C（11.4%）两组的脱片率，差异有统计学意义（P均＜0.01）。
用三种脱钙液脱钙的骨髓活检组织基本均能完整切片，A组切片时部分会有沙粒感，肉眼可见明显刀痕，B、C两组切片时组织相对较软，更易切片。
杂交阳性信号定位与强度得分C组均显著高于A、B两组，A组原位杂交染色阳性细胞定位较模糊，信号弱甚至不显示，B组阳性细胞定位准确，可是阳性信号的强度不如C组。
三组背景染色均较清晰，差异无统计学意义。
比较A、B、C三组原位杂交染色质量（图1）可见用改良EDTA脱钙液脱钙的骨髓活检标本行原位杂交染色效果最好。
2 不同蛋白酶K消化时间对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响比较D、E、F三组脱片率，F组（42.9%）明显高于D组（8.6%）和E组（14.3%）（P＜0.01）。
D、E、F三组杂交阳性信号的定位与强度得分分别为67.5±2.5、82.5±1.2、81.5±1.0，D 组与 E、F 组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。
D、E、F三组背景清晰度指标得分为84.7±1.2、85.3±1.0、62.1±2.4，F组蛋白酶K消化时间长，背景出现不同程度黄染，与D、E组相比差别有统计学意义（P＜0.01）。
比较E、F三组原位杂交染色质量（图2）可见消化时间为9min组的切片，杂交效果最好，阳性细胞着色深，定位准确，背景干净，结果清晰易辨。
图1 不同脱钙方式对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响。
A，A组组织脱片严重，阳性细胞信号不显示；B，B组组织轻微脱片，阳性信号定位准确，信号较弱；C，C组组织无脱片情况，阳性信号定位准确，阳性信号强；比例尺，50μm。
Fig.1 Effect of different decalci fication methods on the in situ hybridization staining in bone marrow biopsy tissues. A, group A had severe tissue detachment from the slide and no positive cell signal was displayed; B, tissue in group B was slightly detached and the positive signal was accurately located but relatively weak; C, there was no detachment in the tissue sections of group C, and the positive signal was accurately located and strong; scale bar, 50μm3 不同抗体孵育温度对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响G、F组杂交阳性信号定位与强度得分分别为79.3±0.8、89.2±0.5，差异有统计学意义（P＜0.01），背景清晰度得分分别为89.2±0.5、82.2±0.5，差别无统计学意义。