蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白前期准备
(1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点,标签等注意点。
(２）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理. （３）透析Buffer得选择可参考文献。
蛋白复性
包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊得生物大分子,它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性得结构称为包涵体（Iｎclｕsiｏn Bｏｄｉes，ＩB)。
在Ｅ、coｌi中累积得重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白就是丧失生物活性得不可溶得错误折叠蛋白得聚集体.
包涵体得处理一般包括这么几步:包涵体得洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中,那么通常有两个选择可以考虑：（1)退一步,优化表达条件；(2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性.这里主要考虑第二种方案。
包涵体得洗涤
破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量得减少,加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目得物质得提取。
洗涤Bufｆeｒ:50mM Tｒiｓ-HＣl（pH8、0）,2mM EDTA，２mＭD ＴT，１5０mＭＮaCl, 1% Triｔon X—1０0, 1mg/ml Leupeｐｔin, 1mg/ml Ｐepstatｉn，1ｍＭTCEP.
超声时用40－６０ml裂解液,因为我们得超声仪很适合用１0０ml小烧杯，装４0—60mｌ裂解液，这样能让超声头离液面不高不低，不会洒出来、菌多就延长超声时间（全程冰浴）.
包涵体得溶解
１、对于尿素与盐酸胍得选择：
尿素与盐酸胍属中强度变性剂,易经透析与超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强得可逆性变性作用，所需浓度尿素8-1０Ｍ，盐酸胍6—8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为７0－90％,尿素在作用时间较长或温度较高时会裂
解形成氰酸盐,对重组蛋白质得氨基进行共价修饰,但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低,蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解得包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
盐酸胍溶解能力达95％以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质得共价修饰。
但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀与对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。
2、去垢剂：
温与去垢剂TrｉtonＸ—１０0洗涤去除膜碎片与膜蛋白。
如强得阴离子去垢剂ＳＤS，可以破坏蛋白内得疏水键,可以增溶几乎所有得蛋白。
问题就是由于ＳDS无法彻底得去除而不允许在制药过程中使用。
包涵体得复性
1复性：
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性得完全伸展状态恢复到正常得折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。
２复性得效率：
复性就是一个非常复杂得过程,蛋白质得复性效率在20％左右.影响复性
效率得因素有蛋白质得复性浓度，变性剂得起始浓度与去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂与其她添加剂得存在与否等。
４、复性中常采用得方法有:
稀释复性:直接加入水或缓冲液,放置过夜,缺点就是体积增加较大,变性剂稀释速度太快,不易控制。
透析复性：好处就是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，缺点就是易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
超滤复性：在生产中较多得使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点就是不适合样品量较少得情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆得变性。
柱上复性：就是最近研究较多并成功得在生产中应用得一种复性方法，常用于复性得层析方法有ＳEＣ、HIC等。
复性得具体方法还要根据前期试验及筛选来确定!
包涵体得复性还要注意以下几点：
1、首先要获得较高纯度得包涵体.
2、包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。
3、复性前后均要离心
4、复性不能太快、
5、纯化得最佳条件要摸索与结合相关文献。
6、变性蛋白得浓度
浓度不要太高，一般０、4-0、5ｍg/ml 左右较适宜,若浓度高了，可稀释至适宜浓度。
有些蛋白可能更低,此时需要结合文献与实践,确定最佳浓度。
要结合透析前后得浓度,如果透析液加入甘油,这需要结合浓缩比（10％甘油可浓缩２0%左右).
复性Buffer得选择
包涵体复性液配方
对于包涵体复性,一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始,到２M左右时结束。
对于盐酸胍而言,可以从4M开始，到1、5M 时复性过程已经结束。
Ｔris 系统与PＢS系统都没有明确得规定，这些需要您在实验过程中不断试验，确定合适得缓冲系统；复性过程主要就是注意以下几个问题：
（1）最适pH值范围为8、0-9、０之间；(有时需要过酸或过碱性)
(2)温度适宜选择4℃；
(3)复性过程蛋白浓度不宜过大；(小于0、5mg/ｍl为宜)
（4）复性时间一般为2４—36小时;
(5)低分子化合物如L-Aｒg有助于增加复性中间产物得溶解度；脲、盐酸胍等,在非变性浓度下就是很有效得促进剂，都可阻止蛋白聚集;Trｉs对蛋白质复性有促进作用。
(6)氧化还原体系,如GSH/GSSG、DTT／GSSＧ等.常用得氧化方法有：空气氧化法:在碱性条件下通空气,或者加入二价铜离子，能够取得更好得效果，缺点就是不易控制氧化还原电势.
氧化还原电对（redox）:常采用ＧＳSG/GSＨ(1:５-１：１0)，通过调整两者得比例来控制较精确得氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如ＤTT,如:5 mM GＳSG/2 mM DTＴ＝ＧＳH/GＳSG(1、３３/1)。
（7)复性过程得添加剂：
１、共溶剂：如PEG６０0０-200０0,据说可以可逆得修饰折叠中间体得疏水集团,此外由于阻止了蛋白质分子间得相互接触得机会,也可能对复性效率得提高起作用。
一般得使用浓度在0、1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、0、4—０、６M Ｌ—Arg：促进蛋白溶解，(成功得应用于很多蛋白如ｔ-PＡ得复性中，也可以抑制二聚体得形成。
)
3、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会,一般使用浓度在5%—30%.
４、一定得盐浓度，可能就是为了降低某些带电集团间得斥力，有利于蛋白质得折叠.
5、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须得辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等(如分子伴侣等）很多时候对蛋白质正确得折叠就是有利得。
，MｇＣl2等特殊得金属离子，可参与蛋白质得正确６、特殊离子:如CaCl
２
折叠,促进活性得作用。
（此时勿加入ＥDTA。
)
例如复性Buffer：
５0ｍM Tris—HCl（pH８、0)，10mＭCａＣl2,0、4 M L—Arg, ２mM ＧSH ／０、4mM GSSG,10％甘油。
透析buffer：
5０mM Tris-HCｌ(ｐＨ8、0),1０ｍＭCaＣl2，2mM ＤＴＴ，1０％甘油.
复性中蛋白析出！
出现蛋白析出,肯定就是条件变化太剧烈。
复性应该采取复性液浓度与pH值逐渐变化得方法，例如根据包涵体得溶液成分，每隔１个pＨ或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。
此外透析时必须浓度极低,条件温与，使蛋白质能够正确折叠。
(１）蛋白析出最大得可能性：蛋白浓度太高,建议稀释以后再复性;
（２）透析得盐浓度（比如ｕrea）要平缓降低:8M—6M—2Ｍ—ＰBS；
（3）若加变性剂(尿素可加到２Ｍ，盐酸胍可加到1—1、5M);
(4）另外可将甘油浓度增加（范围可在≤30%），且在复性样品中也可加适量甘油；
(5）如果还不行，可以换新得复性缓冲液；
(６)纯度不够!出现纯化得目标蛋白纯度不够时，可以先过分子筛再复性；
带有二硫键蛋白得复性!
如果蛋白中存在两个以上得半胱氨酸,立即形成正确得二硫键就是不可能得。
随着二硫键得数目增加(分子间与分子内得），可能得组合数目也在剧烈上升（3个二硫键就就是15种可能组合，４个对应１05,5个对应９45等等）。
如果二硫键就是正确折叠所必须得话，应该在溶解时加入一种还原性试剂（如1-１0ｍM DＴT）。
这种还原性试剂能够被复性用二硫化物置换试剂所取代。
加入二硫化物置换试剂（如氧化型＋还
原型谷胱甘肽)就是为了提供氧化还原作用力。
这些试剂同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体。
这些二硫键得形成或断裂反应就是可逆得，直到最有利得蛋白二硫键形成,这种平衡才会被破坏.这个过程被称作氧化型折叠.。
变性蛋白的复性
SDS-PAGE、凝胶排阻色谱、IEF、HPLC、CE
Edman分析、CE
单克隆抗体（亲和配基落） SDS-PAGE、免疫分析
氨基酸取代
氨基酸分析、肽谱、CE、Edman分析、质谱
微生物（细菌、酵母、真菌） 微生物学检查
支原体
微生物学检查
病毒
微生物学检查
六、产品的保存
防止变性，降解，保护其活性中心。
６．加20％PEG4000至终浓度为0.2％，加50mM的 氧化型谷胱甘肽至终浓度为１mM,加100mM的还原 型谷胱甘肽至终浓度为２mM,静置30min至２h（亦 可４℃复性过夜）。 ７. 以PBS（pH8.0)或TE（pH8.0)透析，取出-20℃保 存备用。
8 .检验复性是否成功。 Buffer A配方：
分子量，等电点，二硫键。 稀释复性方案如下： 8M尿素变性，37度2h。
50mM Tris pH8.0 ，50mM Nacl， 1mM EDTA ，1% Gly，10%甘油复性， 1/100稀释复性，1%蛋白，室温过夜， 16h。 DEAE柱富集，新胶上柱后，用0.5M NaoH，8M urea，洗脱蛋白。
在重复生产发酵中，工程菌表达稳定； 始终能排除外源微生物污染。
生产用细胞库：生产基因工程产品应有种子批系 统，并证明种子批不含有致癌因子，无细菌、病 毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立 生产用工作细胞库。
原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙 述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存 与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。
⒋须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在 宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；
⒌提供插入基因与表达载体两侧端控制区内 的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中启 动与控制基因在宿主细胞中表达的方法及 水平等。
蛋白质复性
在吸附型色谱复性中，蛋白质通过与介质发
生较强的吸附作用来抑制凝集。
反胶团中的蛋白质复性
利用反胶团溶解变性蛋白质，可将变性 蛋白质彼此分隔开，阻止分子间相互作用，
提高复性收率。
• 包含体的概念；包含体的形成原因及体 内抑制方法。 • 包含体分离纯化；包含体溶解方法。 • 蛋白质复性方法。
二、包含体的分离纯化和溶解
1 包含体的分离纯化
分离：包含体通常位于细胞质中，通过采用机械破碎 细胞的方法或者化学破碎（加变性剂）或者溶菌酶与机械 法结合的方法破碎细胞后，采用离心分离或者膜分离，即 可得到粗包含体沉淀物。
纯化：粗包含体中有质粒DNA、脂多糖和其他蛋白质存 在，会加速聚集体的生成，复性率降低。相反，纯化了的包 含体复性收率可大幅度提高。经常采用的包含体分离纯化过 程包括差速离心和反复洗涤。
③高表达的蛋白肽链来不及形成正常的折叠构像而
导致错误的二硫键连接，或者是高表达时细胞内氧化还
原条件不同而生成不同的二硫键连接；
④蛋白溶解需要与其他成分结合或经其他成分诱导。 但产生的蛋白量过多，所需其他成分相对不足，如折叠 酶和一些后修饰酶及分子伴侣等，蛋白质就不能溶解。
2、包含体的性质
具有很多优势： •以大肠杆菌为宿主，过表达形成的高密度蛋白质聚集 体，利于大规模生产目标蛋白； •目的产物含量高，利于分离纯化； •对蛋白酶不敏感，不易水解； •可避免具有毒害或杀伤作用的目的产物对宿主的伤害。
色谱复性
以凝胶过滤色谱为代表的非吸附性色谱复性；吸附性 色谱（金属鳌和色谱、亲合色谱、离子交换色谱、疏水相 互作用色谱）复性；固定化辅助因子复性（将某些对蛋白 质复性有辅助作用的分子固定在凝胶介质表面，用该固定
化凝胶介质辅助蛋白质复性的方法）
蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白质复性方法及其注意事项蛋白前期准备（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。
（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。
（3）透析Buffer的选择可参考文献。
蛋白复性包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。
包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。
这里主要考虑第二种方案。
包涵体的洗涤破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。
超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。
包涵体的溶解1、对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
蛋白质的复性
流加稀释复性 复性液中蛋白质初始浓度=0.边流加、边 复性。故变性蛋白质浓度始终保持在较低 水平，有利于提高复性收率，且终浓度较 高。
蛋白质复性的影响因素
浓度
增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行
温度
蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（＞40℃） 蛋白质的聚集将十分严重
pH值
通常复性在弱碱性条件下（pH8）进行，但要注意避免 与蛋白的pI值相近
疏水键的相互 作用强度
蛋白质复性
包涵体形成的机制： U←→I←→N U：指完全去折叠的状态， I：指折叠中间体（也称融球态 molten globule state） N：指天然的成熟的状态
蛋白质复性
Mitraki和King提出了以下包涵体的形成模型：
IPf为可溶的、部分折叠的早期中间体 IPm未可形成单体的中间体 IPf*为形成包涵体的形式
第五章 蛋白质的复性
蛋白质的复性
为什么要进行蛋白质的复性？
外源基因导入E.coli等宿主细胞并表达蛋白质产 物（ r-干扰素，白细胞介素-2，人生长激素等） 时，相当多的产物形成了包涵体，而没有蛋白质 的活性。所以要进行蛋白质的复性。 1.什么是包涵体？ 2.为什么选择原核表达系统（特别是 E.coli ）？
蛋白质复性
包含体复性的方法 影响复性蛋白产率的因素： (1) 复性蛋白的浓度,为防止蛋白质分子间发生聚 集,复性蛋白的浓度要尽量稀,一般控制在25-75 ug/mL为好. (2) 复性缓冲液要保持适当的氧化还原条件.一般 GSSG（氧化型谷胱甘肽）和GSH之比为1为好. (3) 复性缓冲液的pH要通过实验来确定最适值. (4) 复性溶液中要加入适当的labilizing 试剂,如L 精氨酸,可提高复性产率.
蛋白质复性ppt课件
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
复性有关理论
“动力学假说”与“热力学假说”并不互相否
定，而是互相补充与修正，对不同蛋白质而言，二 者在蛋白质多肽链折叠过程中所起的作用大小不同， 各有特点。总体上，蛋白质的折叠遵循“热力学假 说”，从高能态向低能态转变的过程又受动力学控 制。一些小分子单结构域蛋白质的折叠过程相对简 单些；热力学控制下能容易地进行可逆的变性、复 性；结构比较复杂的蛋白质，特别是涉及S-S键重排， 脯氨酰顺反异构限速步骤的折叠反应，总体上受热 力学控制，但折叠途径即动力学控制比较重要。
蛋白质的再折叠是依据最小能量原则进行的，假 设蛋白质的天然构象是能量最小的构象，变性态蛋白 质分子会自发的向这个最小能量状态转变。这就是 “热力学假说”。
该理论认为：蛋白质天然构象形成具有协同性， 其能量差别足以区别天然构象和其它构象。大部分蛋 白质的天然构象应是能量最小构象。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
复性有关理论
两个理论都认同：蛋白质的折叠是蛋白质自身分
子内作用的结果，是由于暴露在溶液中的疏水侧链的 疏水作用而互相靠近，形成了具有特定三维空间结构 的蛋白质分子。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
蛋白复性
包涵体的变性及复性1、用1×Binding Buffer作裂解液，超声波破碎后，获得的包涵体；2、包涵体用含0.3%SKL（十二烷基肌氨酸钠）的1×Binding Buffer溶解，室温静置至完全溶解；3、充分溶解后，，加入用1×Binding Buffer配制的0.2%PEG2000和0.1mM GSSG：1mM GSH，0.1mM Arg，5-10% Glycerol），最后用1×Binding Buffer稀释蛋白至原菌液体积，调整pH（具体值视蛋白情况定，避开pI），装入透析袋中；4、用20倍体积的1×Binding Buffer进行4℃透析复性，每2h换一次，6次换液后，离心收集蛋白液；5、按可溶性蛋白纯化，注意保持低温环境，防止蛋白降解。
注意：透析液中的添加剂的浓度要在实验中摸索，每种蛋白的要求可能不同。
复性过程的添加剂：1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。
一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。
3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。
有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。
不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。
5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5%-30%。
蛋白复原实验报告
本实验通过观察蛋白质变性及复性的现象，了解了蛋白质的性质。实验结果表明，蛋白质在一定条件下会发生变性，失去原有的生物活性，但在一定条件下可以复性，恢复原有的生物活性。蛋白质具有可溶性、变性和复性的特性，可用于生物制品的生产和应用。
五、实验结果与分析
1. 蛋白质变性实验
鸡蛋清蛋白溶液在加入硫酸铵后，出现白色沉淀，说明蛋白质变性。牛血清白蛋白溶液在加入氯化钠后，出现白色沉淀，说明蛋白质变性。
2. 蛋白质复性实验
鸡蛋清蛋白溶液在加入氢氧化钠后，白色沉淀逐渐消失，溶液变澄清，说明蛋白质复性。牛血清白蛋白溶液在加入蒸馏水后，白色沉淀逐渐消失，溶液变澄清，说明蛋白质复性。
3. 蛋白质鉴定实验
（1）取两支试管，分别加入等量的鸡蛋清蛋白溶液和牛血清白蛋白溶液。
（2）向第一支试管中加入碘液，观察颜色变化。
（3）向第二支试管中加入双缩脲试剂，观察颜色变化。
（4）取两支试管，分别加入等量的鸡蛋清蛋白溶液和牛血清白蛋白溶液。
（5）向第一支试管中加入酚酞指示剂，观察颜色变化。
（6）向第二支试管中加入酚酞指示剂，观察颜色变化。
三、实验材料
1. 蛋白质溶液：鸡蛋清蛋白溶液、牛血清白蛋白溶液。
2. 变性剂：硫酸铵、氯化钠。
3. 复性剂：蒸馏水、氢氧化钠。
4. 试剂：碘液、双缩脲试剂、酚酞指示剂。
5. 仪器：烧杯、试管、酒精灯、移液器、显微镜等。
四、实验步骤1. 蛋白质来自性实验（1）取两支试管，分别加入等量的鸡蛋清蛋白溶液和牛血清白蛋白溶液。
3. 蛋白质鉴定实验
鸡蛋清蛋白溶液加入碘液后，溶液变蓝，说明含有蛋白质。牛血清白蛋白溶液加入碘液后，溶液变蓝，说明含有蛋白质。鸡蛋清蛋白溶液加入双缩脲试剂后，溶液变紫，说明含有蛋白质。牛血清白蛋白溶液加入双缩脲试剂后，溶液变紫，说明含有蛋白质。鸡蛋清蛋白溶液加入酚酞指示剂后，溶液变红，说明含有蛋白质。牛血清白蛋白溶液加入酚酞指示剂后，溶液变红，说明含有蛋白质。
第3章(2) 蛋白质变性与复性
包涵体
在E.coli细胞质内高水平表达的外源蛋白质， 尤其是来自真核生物的蛋白质聚集，会形成不溶 性、无生物活性的聚合物---包涵体。
E.coli包涵体
大肠杆菌中的胰乳酶原包含体电镜照片
包涵体
包涵体形成原因：
• 使用高计量基因和强启动子；
• 大肠杆菌细胞质环境条件，如pH、离子强度、高还原 电位，不同于外源蛋白质正确折叠为最终构象条件；
• 破碎细胞，可耐受较高温度和破碎条件；
• 离心沉淀包涵体，离心力较低，除去碎片；
• 洗涤包涵体，包涵体的目的蛋白质含量为80% 左右， 含有酯类，蛋白，可用含低浓度的变性剂，如尿素、 盐酸胍、Triton X-100反复洗涤，黏度高时可用溶菌 酶、稀NaOH溶液洗涤，获得较纯的包涵体。
• 目标产物的复原
变性蛋白质在脱离变性剂的环境发生聚集，产生沉淀。
• 在蛋白质复性的同时可使目的蛋白质与杂蛋白质分离，
层析（色谱）复性的一般操作
洗涤液 洗脱液
色谱法复性过程的示意图
凝胶过滤复性
凝胶过滤色谱是以溶液中分子的流体力学 体积大小进行混合物分离的技术。物料在色谱 柱中的保留体积不会超出色谱柱中的溶剂的总 体积，保留时间短，溶质峰相对较窄，容易检 出，灵敏度高。能够把握间隔进料的时间，进 行色谱柱的连续使用，提高使用效率。 蛋白质分子大，先从柱子上洗脱，变性剂分子 小，最后流出色谱柱。达到复性目的。
谷胱甘肽等使S- S键断裂。
包涵体的溶解
温度一般25℃~30℃，以促进溶解。
在细胞质内形成的包涵体，可采用原位溶 解法。即在发酵结束时向培养基中加入变性剂 和还原剂，在碱性条件下进行包涵体原位溶解 （增加细胞膜的通透性，使包涵体溶解出来）， 再采用双水相萃取除去细胞碎片，获得包涵体 溶解液。
名词解释蛋白质的复性
名词解释蛋白质的复性蛋白质的复性：现象与意义在生物化学领域中，蛋白质的复性是一个广泛而重要的研究课题。
复性是指蛋白质经历一系列空间结构和功能的调整，重建其原有的三维结构以及所能发挥的功能。
本文将探讨蛋白质复性的现象、机制以及其在生物体内的意义。
1. 蛋白质的复性现象复性是蛋白质遭受外部环境的一系列不良条件（如高温、极酸或极碱性条件、化学变性剂等）后，通过一定机制修复并重获原有结构与功能的过程。
在这个过程中，蛋白质的一级、二级和三级结构受到损伤，导致其失去正常功能。
蛋白质的复性可以发生在细胞内部和细胞外部。
在细胞内，复性通常由分子伴侣和分子伴侣系统促进，如分子伴侣热休克蛋白HSP70、HSP90等。
这些分子伴侣通过与蛋白质相互作用，引导失去结构的蛋白质重新折叠成正确的形式，并防止其在复性过程中发生聚集。
2. 蛋白质的复性机制复性过程涉及多个事件和步骤，其中最为关键的是解聚和折叠。
解聚是指复性过程中产生的不正常和不稳定的蛋白质聚集体分解为单体。
这个步骤由分子伴侣和其他调节蛋白质负责。
折叠是指蛋白质通过一系列无序到有序的结构变化，重新将其折叠成正确的三维构象。
折叠的过程中，分子伴侣系统与其他辅助蛋白质（如折叠辅助酶和蛋白激酶等）相互作用，协助和促进正确的二级和三级结构的形成。
此外，糖基化也被认为是蛋白质复性的关键机制之一。
在糖基化过程中，糖链与特定氨基酸残基结合，形成糖蛋白复合物。
这种复合物不仅能帮助维持蛋白质的稳定性，还可促进正确的折叠。
3. 蛋白质复性的意义蛋白质的复性在维持生物体内正常的生理功能中起着至关重要的作用。
在细胞内，复性可以防止异常蛋白质的聚集和沉积，减轻内环境的毒性。
此外，蛋白质复性还与许多重要的生物过程密切相关。
例如，蛋白质折叠失常与多种神经性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病相关。
了解复性过程可以帮助我们深入了解这些疾病的发生机制，并为研发相关的治疗方法提供新的思路。
另外，蛋白质复性也对生物技术领域具有重要意义。
色谱法使蛋白质复性的流程
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