蛋白质复性方法及其注意事项

蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白前期准备
(1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点,标签等注意点。

(２）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理. （３）透析Buffer得选择可参考文献。

蛋白复性
包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊得生物大分子,它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性得结构称为包涵体（Iｎclｕsiｏn Bｏｄｉes，ＩB)。

在Ｅ、coｌi中累积得重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白就是丧失生物活性得不可溶得错误折叠蛋白得聚集体.
包涵体得处理一般包括这么几步:包涵体得洗涤、溶解、纯化及复性。

如果过表达蛋白在包涵体中,那么通常有两个选择可以考虑：（1)退一步,优化表达条件；(2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性.这里主要考虑第二种方案。

包涵体得洗涤
破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量得减少,加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目得物质得提取。

洗涤Bufｆeｒ:50mM Tｒiｓ-HＣl（pH8、0）,2mM EDTA，２mＭD ＴT，１5０mＭＮaCl, 1% Triｔon X—1０0, 1mg/ml Leupeｐｔin, 1mg/ml Ｐepstatｉn，1ｍＭTCEP.
超声时用40－６０ml裂解液,因为我们得超声仪很适合用１0０ml小烧杯，装４0—60mｌ裂解液，这样能让超声头离液面不高不低，不会洒出来、菌多就延长超声时间（全程冰浴）.
包涵体得溶解
１、对于尿素与盐酸胍得选择：
尿素与盐酸胍属中强度变性剂,易经透析与超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强得可逆性变性作用，所需浓度尿素8-1０Ｍ，盐酸胍6—8M。

尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为７0－90％,尿素在作用时间较长或温度较高时会裂
解形成氰酸盐,对重组蛋白质得氨基进行共价修饰,但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低,蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解得包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。

盐酸胍溶解能力达95％以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质得共价修饰。

但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀与对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。

2、去垢剂：
温与去垢剂TrｉtonＸ—１０0洗涤去除膜碎片与膜蛋白。

如强得阴离子去垢剂ＳＤS，可以破坏蛋白内得疏水键,可以增溶几乎所有得蛋白。

问题就是由于ＳDS无法彻底得去除而不允许在制药过程中使用。

包涵体得复性
1复性：
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性得完全伸展状态恢复到正常得折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。

２复性得效率：
复性就是一个非常复杂得过程,蛋白质得复性效率在20％左右.影响复性
效率得因素有蛋白质得复性浓度，变性剂得起始浓度与去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂与其她添加剂得存在与否等。

４、复性中常采用得方法有:
稀释复性:直接加入水或缓冲液,放置过夜,缺点就是体积增加较大,变性剂稀释速度太快,不易控制。

透析复性：好处就是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，缺点就是易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。

超滤复性：在生产中较多得使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点就是不适合样品量较少得情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆得变性。

柱上复性：就是最近研究较多并成功得在生产中应用得一种复性方法，常用于复性得层析方法有ＳEＣ、HIC等。

复性得具体方法还要根据前期试验及筛选来确定!
包涵体得复性还要注意以下几点：
1、首先要获得较高纯度得包涵体.
2、包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。

3、复性前后均要离心
4、复性不能太快、
5、纯化得最佳条件要摸索与结合相关文献。

6、变性蛋白得浓度
浓度不要太高，一般０、4-0、5ｍg/ml 左右较适宜,若浓度高了，可稀释至适宜浓度。

有些蛋白可能更低,此时需要结合文献与实践,确定最佳浓度。

要结合透析前后得浓度,如果透析液加入甘油,这需要结合浓缩比（10％甘油可浓缩２0%左右).
复性Buffer得选择
包涵体复性液配方
对于包涵体复性,一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始,到２M左右时结束。

对于盐酸胍而言,可以从4M开始，到1、5M 时复性过程已经结束。

Ｔris 系统与PＢS系统都没有明确得规定，这些需要您在实验过程中不断试验，确定合适得缓冲系统；复性过程主要就是注意以下几个问题：
（1）最适pH值范围为8、0-9、０之间；(有时需要过酸或过碱性)
(2)温度适宜选择4℃；
(3)复性过程蛋白浓度不宜过大；(小于0、5mg/ｍl为宜)
（4）复性时间一般为2４—36小时;
(5)低分子化合物如L-Aｒg有助于增加复性中间产物得溶解度；脲、盐酸胍等,在非变性浓度下就是很有效得促进剂，都可阻止蛋白聚集;Trｉs对蛋白质复性有促进作用。

(6)氧化还原体系,如GSH/GSSG、DTT／GSSＧ等.常用得氧化方法有：空气氧化法:在碱性条件下通空气,或者加入二价铜离子，能够取得更好得效果，缺点就是不易控制氧化还原电势.
氧化还原电对（redox）:常采用ＧＳSG/GSＨ(1:５-１：１0)，通过调整两者得比例来控制较精确得氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如ＤTT,如:5 mM GＳSG/2 mM DTＴ＝ＧＳH/GＳSG(1、３３/1)。

（7)复性过程得添加剂：
１、共溶剂：如PEG６０0０-200０0,据说可以可逆得修饰折叠中间体得疏水集团,此外由于阻止了蛋白质分子间得相互接触得机会,也可能对复性效率得提高起作用。

一般得使用浓度在0、1%左右，具体条件可根据实验条件确定。

2、0、4—０、６M Ｌ—Arg：促进蛋白溶解，(成功得应用于很多蛋白如ｔ-PＡ得复性中，也可以抑制二聚体得形成。

)
3、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会,一般使用浓度在5%—30%.
４、一定得盐浓度，可能就是为了降低某些带电集团间得斥力，有利于蛋白质得折叠.
5、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须得辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等(如分子伴侣等）很多时候对蛋白质正确得折叠就是有利得。

，MｇＣl2等特殊得金属离子，可参与蛋白质得正确６、特殊离子:如CaCl
２
折叠,促进活性得作用。

（此时勿加入ＥDTA。

)
例如复性Buffer：
５0ｍM Tris—HCl（pH８、0)，10mＭCａＣl2,0、4 M L—Arg, ２mM ＧSH ／０、4mM GSSG,10％甘油。

透析buffer：
5０mM Tris-HCｌ(ｐＨ8、0),1０ｍＭCaＣl2，2mM ＤＴＴ，1０％甘油.
复性中蛋白析出！
出现蛋白析出,肯定就是条件变化太剧烈。

复性应该采取复性液浓度与pH值逐渐变化得方法，例如根据包涵体得溶液成分，每隔１个pＨ或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。

此外透析时必须浓度极低,条件温与，使蛋白质能够正确折叠。

(１）蛋白析出最大得可能性：蛋白浓度太高,建议稀释以后再复性;
（２）透析得盐浓度（比如ｕrea）要平缓降低:8M—6M—2Ｍ—ＰBS；
（3）若加变性剂(尿素可加到２Ｍ，盐酸胍可加到1—1、5M);
(4）另外可将甘油浓度增加（范围可在≤30%），且在复性样品中也可加适量甘油；
(5）如果还不行，可以换新得复性缓冲液；
(６)纯度不够!出现纯化得目标蛋白纯度不够时，可以先过分子筛再复性；
带有二硫键蛋白得复性!
如果蛋白中存在两个以上得半胱氨酸,立即形成正确得二硫键就是不可能得。

随着二硫键得数目增加(分子间与分子内得），可能得组合数目也在剧烈上升（3个二硫键就就是15种可能组合，４个对应１05,5个对应９45等等）。

如果二硫键就是正确折叠所必须得话，应该在溶解时加入一种还原性试剂（如1-１0ｍM DＴT）。

这种还原性试剂能够被复性用二硫化物置换试剂所取代。

加入二硫化物置换试剂（如氧化型＋还
原型谷胱甘肽)就是为了提供氧化还原作用力。

这些试剂同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体。

这些二硫键得形成或断裂反应就是可逆得，直到最有利得蛋白二硫键形成,这种平衡才会被破坏.这个过程被称作氧化型折叠.。