临床免疫学和免疫检验第六章 沉淀反应讲义
第六章沉淀反应沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。
第一节沉淀反应的特点沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。
沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见；第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。
第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法，常见类型有：（一）抗原稀释法抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。
（二）抗体稀释法抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。
（三）方阵滴定法方阵滴定法即棋盘滴定法。
二、免疫浊度测定属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。
（一）免疫比浊测定的影响因素1.抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素。
当抗原过量时，形成的IC分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。
当抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。
在反应体系中保持抗体适当过量，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。
2.抗体的质量对免疫比浊测定法的抗体要求（1）特异性强（2）效价高（3）亲和力强：则抗体的活性高，不仅可以加快抗原抗体反应的速度，而且形成的IC较牢固，不易发生解离。
在速率比浊法中尤为重要。
（4）R型和H型抗体：根据抗血清来源的动物种类不同，分为R型抗体和H型抗体。
R型抗体是指以家兔为代表的小型动物被注射抗原免疫后制备的抗血清。
这类抗血清的特点是亲和力较强，抗原抗体结合后不易发生解离。
H型抗体是指以马为代表的大型动物注射抗原后制备的抗血清，这类抗血清的亲和力弱，抗原抗体结合后极易解离。
3.抗原抗体反应的溶液反应液最适pH为6.5～8.5，否则不易形成IC，甚至可引起IC解离。
在一定范围内，离子强度大，IC形成越快；离子的种类也可影响IC的形成。
一般常使用磷酸盐缓冲液作为免疫比浊法的反应液。
4.增浊剂某些非离子型亲水剂对促进IC的形成有显著的增强作用，如聚乙二醇（PEG）、吐温-20，其作用是消除蛋白质（抗原或抗体）分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。
（二）免疫比浊法方法分类1.透射免疫比浊法通过检测光被吸收、衍射、反射和折射后光线减弱的变化，来定量抗原抗体的复合物。
2.免疫胶乳比浊法是以胶乳作为载体对小分子免疫复合物进行微量测定，进一步提高了免疫浊度测定的灵敏度。
3.散射免疫比浊法通过检测光折射和衍射而形成的散射光强度来定量抗原抗体的复合物。
该法根据抗原抗体反应的时间和反应结合的动力学，又可分为终点散射比浊法、固定时间散射比浊法和速率散射比浊法。
（三）免疫比浊法应用血液、体液中蛋白质的测定如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、补体C3、补体C4、血浆蛋白（前白蛋白、α-抗胰蛋白酶、α-酸性糖蛋白、α2-巨球蛋白、血浆铜蓝蛋白、结合球蛋白、转铁蛋白）。
尿微量蛋白系列和半抗原（如激素、毒物和各种治疗性药物）。
（四）免疫比浊法优点1.稳定性好2.敏感度高（达ng/L）3.精确度高（CV＜5%）4.简便快速，易于自动化5.无放射性核素污染，适合于大批量标本的检测第三节凝胶内沉淀试验利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶内扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。
凝胶支持物的种类有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶等。
不同分子量的物质在凝胶中扩散速度不同，借此可用以识别不同待测物分子量的差别。
一、单向扩散试验在琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，则形成沉淀环。
（一）试管法0.7%琼脂糖溶液中，注入小试管内，上层加抗原溶液使待测抗原在凝胶中自由扩散，在抗原抗体比例恰当位置形成沉淀环。
较少采用。
（二）平板法是将抗体或抗血清混入0.9%琼脂糖凝胶内，未凝固前倾注成平板，然后在上打孔，将抗原加入孔中，放37℃让其自由扩散，24～48小时后可见孔周围出现沉淀环，测定环的直径或面积计算标本中待测抗原的浓度。
有两种计算方法：1.Mancini曲线适用大分子抗原和长时间扩散（＞48小时）的结果，沉淀环直径的平方（d2）与抗原浓度（c）呈线性关系：c/d2＝k。
2.Fahey曲线适用于小分子抗原和较短时间扩散的结果处理，用半对数纸画线，浓度对数logc与扩散环直径（d）呈线性关系：logc/d＝k（其中c为抗原浓度，d为沉淀环直径，k为常数）。
（三）影响因素1.抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强，在良好条件下保存。
2.每次测定都必须作标准曲线。
3.每次测定时必须用质控血清作质控。
4.注意双环现象（出现了两种抗原性相同成分）。
二、双向扩散试验双向扩散试验是让抗原和抗体在琼脂中各自向对方扩散，在比例恰当之处形成沉淀线，沉淀线的位置、形状以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。
双向扩散试验简单易行，用途广泛，但该技术灵敏度低，出现结果慢，不能精确定量，这些弱点在相当程度上限制了它的应用。
根据试验形式可分为试管法和平板法两种。
（一）试管法（二）平板法是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一。
根据沉淀线的有无、形态和位置可作如下分析：1.抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计（1）沉淀线如果靠近抗原孔，则表示抗体含量较大；（2）沉淀线如果靠近抗体孔，则表示抗原含量较大；（3）不出现沉淀线则表明无对应的抗体（抗原）或者抗原过量。
2.抗原或抗体相对分子量的分析（1）抗原或抗体在琼脂内自由扩散，其速度受分子量的影响。
分子量小者扩散快，反之则较慢。
（2）由于慢者扩散圈小，局部浓度则较大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方；如果两者分子量大致相等，则形成直线。
3.抗原性质的分析（1）两条沉淀线互相吻合相连，表明抗体与两个抗原中的相同表位结合而沉淀，两个抗原相同；（2）沉淀线呈部分相切，说明两个抗原之间有部分相同；（3）两条沉淀线交叉而过，说明两个抗原完全不同。
4.抗体效价的滴定双向扩散试验是抗血清抗体效价滴定的常规方法。
固定抗原的浓度，稀释抗体；或者抗原和抗体双方皆作不同的稀释，经过自由扩散，形成沉淀线，以出现沉淀线最高的抗体稀释度为该抗体的效价。
5.抗原或抗体纯度鉴定用混合抗原或抗体鉴定抗体或抗原，出现一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯，出现多条沉淀线说明不纯。
双向扩散试验简单易行，用途广泛，但该技术灵敏度低，出现结果慢，不能精确定量，这些弱点在相当程度上限制了它的应用。
第四节免疫电泳技术电泳分析与沉淀反应的结合产物。
一、优点（一）加快了沉淀反应的速度；（二）电场规定了抗原抗体的扩散方向，使其集中，提高了灵敏度；（三）可将某些蛋白组分根据其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应。
本法既具有抗原抗体反应的高度特异性，又具有电泳技术的高分辨率和快速、微量等特性，因此其应用范围日益扩大。
随着实验技术的不断发展，免疫电泳技术逐步发展为对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳等多项实验技术，广泛用于科学研究和临床实验诊断分析。
二、对流免疫电泳双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。
在pH8.6缓冲液中，大多蛋白质带强负电荷，在电场中向正极移动；而IgG等电点偏高（pH6～7），在pH8.6时带负电荷较少，且分子量较大，移动速度慢，故向正极移动缓慢甚至不移动。
在凝胶的电渗作用下，随水流向负极，电渗引向负极移动的液流速度超过了IgG向正极的移动速度，因此抗体移向负极，在抗原抗体最适比处形成沉淀线。
IgG作为蛋白质在电泳中比较特殊，4个亚型有不同的表现，IgG3和IgG4与一般蛋白质无异，泳向正极,而IgGl和IgG2则因其带电荷少，受电渗的作用力大于电泳，所以被水分子挟裹向负极移动。
这就形成了IgG的特殊电泳形式：一部分泳向正极，另一部分泳向负极，在抗体孔两侧都有抗体存在，因此所谓对流只是部分IgG的电渗作用所致三、火箭免疫电泳单向免疫扩散与电泳相结合的一项定量检测技术，实质上是加速的单向扩散试验。
实验时，将抗体混合于琼脂中，样品孔中的抗原置于负极端，电泳时抗体不移动，抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰。
当琼脂中抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关，因此用已知标准抗原作对照，抗原浓度为横坐标，峰的高度为纵坐标，绘制标准曲线，待测样品浓度就可根据沉淀峰的高度在标准曲线中计算获得。
火箭电泳作为抗原定量只能测定Pg/ml以上的含量，如低于此水平则难以形成可见的沉淀峰。
加入少量125I标记的标准抗原共同电泳，则可在含抗体的琼脂中形成不可见的火箭峰，经洗涤干燥后，用X线胶片显影，可出现放射显影，这就是目前采用的免疫自显影技术，根据自显影火箭峰降低的程度（竞争法）可计算出抗原的浓度。
免疫自显影技术可测出ng/ml的抗原浓度。
四、免疫电泳区带电泳与免疫双扩散相结合的一种免疫分析技术，为定性试验。
先用区带电泳技术将抗原在凝胶中电泳，分成肉眼不可见的若干区带，电泳停止后，沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清，置室温37℃作双向扩散，经18～24小时后，已分离成区带的各种抗原成分与抗体槽中相应抗体在两者比例适合处形成弧形沉淀线。
免疫电泳所需扩散时间长，沉淀线的数目和分辨率又受许多因素影响，且结果较难分析，必须积累经验，才能作出恰当的结论。
免疫电泳为定性试验，目前主要应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定方面，例如多发性骨髓瘤患者血清在免疫电泳后，可观察到异常的M蛋白沉淀弧。
五、免疫固定电泳可用于各种蛋白质的鉴定。
该方法原理是先将待检样品在凝胶板上作区带电泳，将蛋白质分离成不同区带，然后在其上覆盖抗血清，当抗血清与某区带中的单克隆免疫球蛋白结合，便形成抗原抗体复合物而沉淀。
最后通过漂洗和染色，并与蛋白质参考泳道对照分析，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。
本法可用于迁移率近似的蛋白和M蛋白的鉴定与分型，免疫球蛋白轻链，尿液中的本-周蛋白检测及κ、λ分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测及分型，鉴定游离轻链，补体裂解产物等。
免疫固定电泳最大的优势是分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析。
六、交叉免疫电泳将区带电泳和火箭免疫电泳相结合的免疫电泳分析技术。
是一种有效的抗原蛋白定量技术，可一次同时对多种抗原定量。
沉淀反应实用PPT课件PPT课件
二、原理
1.总试验原理：沉淀反应是指可溶性抗 原与相应抗体在一定条件下发生结合并出 现肉眼可见的沉淀物。
2.双向免疫扩散试验原理：可溶性抗原 与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，当扩 散到两者浓度比例合适的部位相遇时，即 出现乳白色的沉淀线。
Ag Ab
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双向琼脂扩散的用途
琼脂板厚 度3mm
3.在琼脂板上打孔：孔径3㎜、抗原、抗体孔间 距5㎜，抗原孔间距2㎜。
4.加样：(见图样) 5.电泳：将琼脂板放入电泳槽、抗体端接阳极，
纱布做引桥，电流为3～4mA/㎝（玻片宽度） 电泳40—50min。
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四、方法
双向免疫扩散
1.配制1%琼脂： 称取琼脂0.5g + 生理盐水50ml
？
根据抗原抗体的反应有特异性， 抗人血清 可用已知抗原测定未知抗体；
也可用已知抗体测定未知抗原。
血清学反应条件
抗原抗体反应特点
1.电解质
1.特异性
2.PH
2.可逆性
3.温度
3.可见性
4.阶段性
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沉淀反应类型
环状沉淀 絮状沉淀 琼脂扩散 荚膜膨胀
• 根据抗原抗体反应的方式和特性分为:
• 双向免疫扩散
• 用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原 （或抗体）；
• 抗原或抗体的纯度鉴定；
• 抗原或抗体相对量的估计。
1:2
1:8
1:4
1:16
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• 沉淀线形成的位置与抗原、抗体浓度有关，抗原浓度越浓，形 成的沉淀线距离抗原孔越远，抗体浓度越浓，形成的沉淀线距 抗体孔越远，因此，当固定抗体的浓度，稀释抗原，可根据已 知浓度的抗原沉淀线的位置，测定未知抗原的浓度；反之固定 抗原的浓度，亦可测定抗体的效价。
第06章 免疫沉淀试验
第三节
凝胶内沉淀试验
免疫电泳流程图
第三节
凝胶内沉淀试验
（三）免疫电泳
免疫电泳结果示意图
第三节
凝胶内沉淀试验
（四）免疫固定电泳 区带电泳+沉淀反应 原理： 先将血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上经区带电泳分 离，再将固定剂和各型免疫球蛋白及轻链抗血清加在凝 胶表面的泳道上，经孵育后，固定剂和抗血清在凝胶内 渗透并扩散，抗原抗体直接发生沉淀反应，洗脱游离的 抗体，形成的抗原抗体复合物则保留在凝胶中。经漂洗 和染色，参考泳道和抗原抗体沉淀区带被着色，根据电 泳移动距离分离单克隆组分，可对各类免疫球蛋白及其 轻链进行分型。 最大的优势：分辨率强，敏感度高，操作周期短， 结果易分析。
第三节
凝胶内沉淀试验
（一）对流免疫电泳 原理： 双向免疫扩散+电泳技术 比双向免疫扩散法灵敏度提高8倍～16倍 （负极） （正极）
抗原等电点低，带较 强的负电荷，分子量 小，在电场中向正极 移动
抗体等电点偏高，带负电荷 较少，且分子量较大，在电 渗作用下，抗体移向负极
抗原抗体浓度最适比处形成沉淀线
扩散，在浓度比例恰当处形成沉淀线，观察沉淀线的位置
、形状及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。 根据试验形式可分为试管法和平板法。
第三节
凝胶内沉淀试验
二、双向免疫扩散试验（平板法）
平板法是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法
之一。
基本步骤是：打孔→在各对应孔中加入抗原或抗 体→湿盒37℃18h～24h→观察沉淀线。
第三节
应用：
凝胶内沉淀试验
二、双向免疫扩散试验（平板法）
1.判断抗原或抗体的存在以及估计相对含量 2.分析抗原或抗体相对分子量
临床检验主管技师 临床免疫学和免疫检验 第六章 沉淀反应
第六章沉淀反应沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。
第一节沉淀反应的特点沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。
沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见；第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。
第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法，常见类型有：（一）抗原稀释法抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。
（二）抗体稀释法抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。
（三）方阵滴定法即棋盘滴定法。
二、免疫浊度测定属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。
（一）免疫比浊测定的影响因素1.抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素。
当抗原过量时，形成的IC分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。
当抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。
在反应体系中需保持抗体适当过量，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。
2.抗体的质量对免疫比浊测定法的抗体要求（1）特异性强（2）效价高：低效价（＜1:20）抗体会增加非特异性浊度（伪浊度）的产生。
（3）亲和力强：则抗体的活性高，可加快抗原抗体反应的速度，且形成的IC较牢固，不易发生解离。
（4）R型和H型抗体：R型抗体是指以家兔为代表的小型动物被注射抗原免疫后制备的抗血清。
这类抗血清的特点是亲和力较强，抗原抗体结合后不易发生解离。
H型抗体是指以马为代表的大型动物注射抗原后制备的抗血清，这类抗血清的亲和力弱，抗原抗体结合后极易解离。
沉淀反应(免疫学检验课件)
沉淀反应
沉淀反应
(precipitation)
可溶性抗原（细菌培养滤液、细胞或组织的 浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在液相中特异 结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的 沉淀现象。
反应中的抗原称为沉淀原（precipitinogen） 可以是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为沉淀素 （precipitin）。
❖ (3)溶液中的抗原－抗体复合物的数量要足够多。如果 数量太小，溶液浊度变化太小，对光通量影响不大。
❖ (4)透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此 只能测定抗原－抗体反应的第二阶段，检测需抗原－ 抗体温育反应时间，检测时间较长。
❖ (5)检测用的抗体一般应选择亲和力较高的抗体，且在 检测中应保证抗体过量。
退。实际上在电泳的过程中受
负电荷多
－
电泳力 ＞
电渗力
抗体 负电荷少
电泳力 ﹤ 电渗力
+
步骤：
制板
3－4ml琼脂
打孔
孔间距3mm
加样
约7ul
抗体
抗原
电泳
总电流＝4mA x 1cm/板宽 x N(板数） 20—30分钟
三、免疫电泳技术
免疫电泳技术的用途
是散射比浊法的改良。一般在30～120min内比 浊
用于免疫沉淀反应的缺陷
(1)因为是一次性测定光吸收值，没有考虑每一个待测 样本的吸收和散射效果，可测定结果不准确
(2)测定的仍是抗原－抗体反应的第二阶段，不适合快 速检测。
(3) 终点法存在反应本底（空白管），测定样本的含量 越低，本底比例越大，故在微量测定时，本底的干 扰是影响准确测定的重要因素。
（4）若反应时间过长，IC聚合形成沉淀则导致散射值 偏低。故需掌握最适时间比浊。
免疫学试验沉淀反应 PPT
2、 抗原性质分析
利用三角孔型,将待检抗原和标准抗 原加入相邻两个孔中,与另一孔相对,依照 沉淀线形状分析待测抗原,见图 。
(1) 沉淀线吻合:待检抗原与标准抗原完全相同 。
(2) 沉淀线相切:待检抗原中含有与标准抗原相 同的抗原,还含有另外的抗原与抗血清相对应 。
计出现结果偏高或偏低。
2、 抗体种类
实验证明兔抗血清优于马、羊抗血 清,兔抗血清可测抗原0、1~1IU/ml,马抗血 清为1~10IU/ml,羊为0、4~4IU/ml,为提高 实验敏感度,应首选敏感度高的抗血清。
3、 抗体稀释度
抗体浓度大,沉淀环小,则敏感度低;抗体浓度小, 沉淀环增大,不同浓度抗原间的差别较显著,敏感 度高。但沉淀环过大,常造成边缘糊不清,致使测 量误差也增大。因此要求在沉淀环清楚的基础上 加大稀释度以提高敏感度。下图为抗体分别以 1:25、1:50、1:75、1:100稀释,所形成的4条标
二、环状沉淀试验
环状沉淀(ring precipitation)试验 是 由 Ascoli 于 1902 年 建 立 的 一 种 经 典 的血清学定性试验。用特别简便的技 术了解待测血清内是否存在某种抗原 或抗体。
(一) 原理 把抗原溶液小心地加于已含抗体溶液的细
试管液面上。当对应的抗原与抗体相遇 ,在界面处形成清楚的乳白色沉淀环。
(2) 操作步骤
1) 用稀释液稀释待检抗原和抗原标准品。 2) 取一定量稀释待检抗原液和不同浓度抗原 标准品溶液加至试管中,加抗体充分混匀,孵育 一定时间,比浊。 3) 以抗原标准品量为横坐标,浊度值为纵坐标, 绘制标准曲线。依照待检抗原的浊度值,查出
临床免疫学与检验课件：沉淀反应
火箭免疫電泳
影響因素
1.瓊脂（無電滲或電滲很小的）影響火箭形狀不規 則。 2.電泳終點時間的確定。 3.標本數量多時應先通電後加樣,防止寬底峰形. 4.IgG定量時，可用甲醛與IgG上的氨基結合（甲 醯化），抵消了電滲作用。
火箭免疫電泳示意圖
+
-
火箭免疫電泳圖 ①②③④為標準抗原；⑤⑥為標本
三、免疫電泳
電泳時凝膠中抗體不移動，樣品孔中的 抗原向正極泳動，隨著抗原量的逐漸減 少，抗原泳動的基底區越來越窄，抗原 抗體分子複合物形成的沉澱線逐漸變窄， 形成一個形狀如火箭的不溶性複合物沉 澱峰，抗體濃度固定時，峰的高度與抗 原量呈正相關。
火箭免疫電泳
技術要點
1.2%巴比妥瓊脂糖約55℃，加入適量抗 血清，混勻後制板，打孔，孔內加待測樣 品，樣品孔放負極側， 6h後觀察瓊脂板 上沉澱峰，繪製標準曲線，求出待測樣品 濃度。
單向擴散試驗（平板法）
傾注平板 打孔 加樣 放置37℃ 24～48h觀察沉澱環
單向擴散試驗 （平板法）
沉澱環的直徑與待測標本含量兩種計算方法
Mancini曲線： 大分子抗原（IgM）
時間擴散＞48h， 常數K＝C∕d2 普通座標紙曲線
Fahey曲線： 小分子抗原（IgG,IgA）
擴散時間24h 常數K＝logC∕d 半對數座標紙曲線
單克隆抗體；多克隆抗體； 可出現假性降低與增高
• 雙環現象
不同擴散率抗原性相同的兩個 組分
單向擴散試驗 上排為5個不同濃度的參考品； 下排為患者血清，下排右2為異常病 理血清
二、雙向擴散試驗 （平板法）
鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一
原理：將抗原抗體 分別加在瓊脂糖 不同的對應孔中， 兩者在凝膠中自 由擴散，在比例 合適處形成白色 沉澱線。
沉淀反应6
5
8
－
35
10Leabharlann 13540
15
25
12
45
20
60
35
50
25
150
90
55
30
230
80
60
300
70
360
60
415
55
450
45
480
30
500
20
33
抗原抗体反应速率的动态变化
34
35
2. 技术要点
稀释待检样品和标准品
加最适工作浓度的抗体 孵育
立即比浊（速率单位RU）
绘标准曲线
RU
抗原浓度
敏感度高（达ng/L）； 稳定、可靠，特异性好； 不需特殊仪器设备；
血清中的 RF可与IgG Fc段结合，使IgG致
敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用F(ab′)2 片段代替IgG既可消除此干扰。
20
代表性仪器：
普通分光光度计 自动生化分析仪：olympus AU560
21
三) 散射比浊法
I＝K3C抗原
（Ab浓度恒定）
25
2. 技术要点
稀释待检样品和标准品
加最适工作浓度的抗体
孵育
测定散射光强度 I（450nm ）
绘标准曲线
浊度
抗原浓度
标准曲线
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全量标本
1/10标本量
I1＜阀值
7.5s-
120s
I1
I1>阀值 稀释标本
4sec
I2-I1 I2
抗原浓度
27
定时散射比浊法测定原理示意图
Distribution of scattered radiation
医学免疫学实验课件-沉淀反应
沉淀物
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琼脂扩散实验
可溶性抗原和抗体在琼脂中扩散，相遇， 在适当比例下形成沉淀线或沉淀环。
分类:
单向琼脂扩散实验: 仅抗原或抗体扩散 —— 定量
双向琼脂扩散实验: 抗原和抗体同时扩散 —— 定性
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沉淀反应分类
一、单向琼脂扩散 特点
1. 简单 2. 灵敏度较低约为：10－20μg 3. 1~2天才能看结果
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概述
一、单向琼脂扩散试验 二、双向琼脂扩散试验 三、火箭电泳 四、对流免疫电泳 五、免疫电泳
•目的要求
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目的要求
1.掌握对流免疫实验原理、操作过程及应用。 2.熟悉单向、双向琼脂扩散实验的原理、操作 过程及应用。 3.了解免疫电泳、火箭电泳实验的原理、操作 过程及应用。
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2. 取约4ml 琼脂液浇注在载玻片上
凝固
3. 打4个孔，孔径3mm，孔距6mm
_
+
4. 在孔中加入相应样品
Ag1
Ab
Ag2
Ab
5. 电泳约1h
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对流免疫电泳
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沉淀反应分类
1.单向琼脂扩散 2.火箭电泳 3.双向琼脂扩散 4.对流免疫电泳 5.免疫电泳
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免疫电泳
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特点： 1.需仪器 2.灵敏度提高约为：10μg/ml 3.1h能看结果
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四、对流免疫电泳
【原理】
在适宜缓冲液和电场条件下，抗原和相应抗 体在琼脂凝胶中，由于电泳和电渗作用，抗原向 正极移动，抗体向负极移动，两者相向移动，在 两孔之间相遇，在比例合适处形成沉淀线。
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临床免疫学检验课件第6章沉淀反应2
加入抗血清
各管抗体量不变
Ab
振摇 混匀、37℃孵育
Ag
沉淀量不同
轻摇
出现沉淀量最多的管为最适比例管。
表6-1 最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体 稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照
1/5
+
++ +++ +++ ++
+
±
—
1/10
+
++ ++ ++ +++ ++
•基本原理：电泳技术+沉淀反应 •优点：加快沉淀反应的速度；
提高灵敏度。 •应用： 主要用于细微成分的分析。
•电泳原理：带电质点在电场中向带有异相电荷的 电极移动。
•在常规血清蛋白电泳，一般选择可使所有蛋白质 分子均带负电荷的碱性缓冲液。
•电场中的作用力（碱性条件下） 电泳力：蛋白质由阴极向阳极移动。 电渗力：水分子向阴极移动。 若电泳力>电渗力, 向阳极移动(大多数Ag) 电渗力>电泳力, 向阴极移动（Ａb）。
• 对待检蛋白质样品定量测定的条件： 1、具有单价特异性抗血清 2、已知含量标准品（绘制标准曲线用） 3、待检含量>1.25ug/ml。（敏感度稍低）
• 单扩试验的应用范围： 常用于IgＧ、IgＡ、IgM、C3、C4等测定， 简易的抗原定量技术。
• 双环现象
抗原性相同、扩 散率不同的两个 组分：α重链病 人血清中的α重 链与正常IgA
抗体相遇，在界面处形 •临床意义：
成清晰的乳白色沉淀环。 鉴定血迹、
临床免疫学和免疫检验第六章沉淀反应讲义
第六章沉淀反应沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。
第一节沉淀反应的特点沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。
沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见; 第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。
第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀 因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法，常见类型有:抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。
抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。
方阵滴定法即棋盘滴定法。
二、免疫浊度测定属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应，可进 行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。
（一）免疫比浊测定的影响因素1. 抗原抗体的比例 是浊度形成的关键因素。
当抗原过量时，形成的IC 分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。
当抗体过量时，IC 的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是 经典的海德堡曲线理论。
在反应体系中保持抗体适当过量，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。
2. 抗体的质量 对免疫比浊测定法的抗体要求（1） 特异性强 （2） 效价高（3） 亲和力强：则抗体的活性高，不仅可以加快抗原抗体反应的速度，而且形成的IC 较牢固，不易 发生解离。
在速率比浊法中尤为重要。
（4） R 型和H 型抗体：根据抗血清来源的动物种类不同，分为R 型抗体和H 型抗体。
R 型抗体是指以家兔为代表的小型动物 被注射抗原免疫后制备的抗血清。
这类抗血清的特点是 亲和力较强，抗原抗体结合后不易发生解离。
H 型抗体是指以 马为代表的大型动物 注射抗原后制备的抗血清, 这类抗血清的 亲和力弱，抗原抗体结合 后极易解离。