如何检测RNA病毒
RNA病毒检测简述
2、Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的引物 绝大多数真核细胞mRNA具有3’-端Poly(A)尾，此引
物（12-18核苷酸）与其配对，仅mRNA可被反转录。 由于Poly(A)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成
Yeast Total RNA
二、cDNA的合成
反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶 种类：两种 1、禽类成髓细胞病毒（AMV）反转录酶 包括两个多肽亚基（最适温度42℃） 活性：依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的
DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分 进行内切降解(RNA酶H活性)。
采取的措施：
1、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换 （使用一次性手套）。
2、所用的玻璃器皿需置于干热灭菌箱中200℃烘 烤2h以上。
3、不能用高温烘烤的材料，如塑料容器、试剂 等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理， 然后高压灭菌以消除残存的DEPC。
注意事项：
1、DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物。 2、DEPC能与氨基和巯基反应，因而含Tris和DTT
一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。 引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低
则降低产量。
4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)： ✓ dNTP原液一般配成2.5-10mmol/L分装，-20℃贮存。 一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。 ✓ 当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚
第一章 RNA的提取和cDNA的合成
流感病毒RNA荧光RT-PCR检测技术
流感病毒RNA荧光RT-PCR检测技术实时荧光定量PCR是在常规PCR基础上发展起来的定量PCR技术，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测整个PCR进程，最后根据ct值和标准曲线，对未知模版进行定量分析。
常用的实时荧光定量PCR又分为非特异性荧光标记的SYBR Green 法和特异性荧光标记的TaqMan法和分子信标法。
一、实时荧光定量PCR原理：1、SYBR Green法：SYBR Green是一种双链DNA结合染料，游离状态下不发光，非特意地掺入到双链DNA中后发出荧光信号，其强度与双链DNA的数量相关，随着扩增产物量的增加，检测到的荧光信号增强。
2、TaqMan法：在扩增反应液中，加入一特异性探针，该探针5‘端和3’端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，两基团位置靠近，5‘端报告基团的荧光能量被3’端淬灭基团吸收，此时检测不到荧光信号，在扩增过程中，探针与模板结合形成Taq 酶的5‘→3’外切活性底物，当Taq酶沿模板向前延伸到探针结合处时，发生链的置换，Taq酶的5’→3’外切活切将探针5‘端连接的报告基团从探针上切割下来，5’端报告基团的荧光能量脱离3’端荧光淬灭基团的吸收，可检测到荧光信号，每经过一个PCR循环，荧光信号也和扩增产物一样，有一个同步增长的过程。
3、分子信标法：探针设计成茎环结构的发夹状，环部核苷酸序列与扩增产物序列互补，两端核苷酸序列互补形成茎部，且一端标记有报告基团，另一端标记有淬灭基团，探针未与模板结合时，报告基团和淬灭基团空间位置靠近，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收，此时，检测不到荧光信号，与模板结合后，探针的构象由发夹状改变为链状，报告基团和淬灭基团分离，可检测到荧光信号。
核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。
本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。
流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA，即为cDNA。
流感病毒RNA荧光RT(PCR检测技术)-
流感病毒RNA荧光RT（PCR检测技术）-流感病毒核糖核酸荧光逆转录聚合酶链反应检测技术实时荧光定量聚合酶链反应是在常规聚合酶链反应基础上发展起来的定量聚合酶链反应技术。
通过在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累，对整个聚合酶链式反应过程进行实时监控。
最后，根据ct值和标准曲线对未知模板进行定量分析。
常用的实时荧光定量PCR可分为非特异性荧光标记的SYBR Green法、特异性荧光标记的TaqMan法和分子信标法。
1。
实时荧光定量聚合酶链反应原理:1。
SYBR Green方法:SYBR Green是一种双链DNA结合染料，在自由状态下不发光，当无意中掺入双链DNA时会发出荧光信号。
它的强度与双链DNA 的数量有关。
随着扩增产物数量的增加，检测到的荧光信号增加。
2，TaqMan方法:在扩增反应液中加入特异性探针，探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，当探针完成时，两个基团的位置接近，5’端报告基团的荧光能量被3’端淬灭基团吸收，此时未检测到荧光信号，在扩增过程中，探针与模板结合形成5’→3’切除活性底物当Taq酶沿着模板向前延伸到探针连接处时，发生链置换。
Taq酶的5’→3’切除活性切割从探针上切割连接到探针5’端的报道基团。
5’末端报道基团的荧光能量与3’末端荧光淬灭基团的吸收分离，并且可以检测荧光信号。
在每个聚合酶链反应循环之后，荧光信号也有一个同步生长过程，就像扩增产物一样3.分子信标法:将探针设计成发夹形的茎环。
环的核苷酸序列与扩增产物的序列互补。
两端的核苷酸序列互补形成茎。
一端用报道基团标记，另一端用淬灭基团标记。
当探针不与模板结合时，报道基团和淬灭基团在空间上彼此靠近，报道基团的荧光能量被淬灭基团吸收。
此时，无法检测到荧光信号。
与模板结合后，探针的构象由发夹状变为链状，报道基团和淬灭基团分离，并呈荧光核酸检测是鉴定流感病毒基因组的一种强有力的方法，即使基因组含量很低或可以检测到死病毒。
病毒RNA的提取及肠道病毒的鉴定
实验三病毒RNA的提取及肠道病毒的鉴定一、实验目的：1、掌握病毒RNA的提取技术；2、了解肠道病毒的常用鉴定方法。
二、实验设备与仪器：(1)QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒，1.5mlRNase-free离心管，乳胶手套，一次性口罩，10ul、200ul、1000ulRNase-free无菌枪头及加样枪，普通冰箱，废液缸，新洁尔灭、混合振荡器、离心机、异丙醇、无水乙醇、EP管架(2)PCR扩增仪、加样器、枪头、300ulEppendorf管、掌上离心机、小镊子、试剂盒（PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver.2）、EB染料、琼脂糖、称量纸、天平、微波炉、50ml三角烧瓶、20ml烧杯、50ml量筒、TAE电泳液、上样缓冲液6×Buffer、制胶盒、样品梳、DNA 分子量marker引物：Control F-1 Primer 5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′Control R-1 Primer 5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′三、实验方法：（一）病毒RNA提取：原理：QIAamp Viral RNA Mini Kit利用硅胶膜的选择吸附的特性，结合真空或分离柱处理，可同时纯化多个样品。
先将样品在高变性条件下裂解，灭活RNase，确保病毒RNA的完整性。
调节buffer至QIAamp膜吸附RNA的最佳条件，将样品转入QIAamp Mini column。
RNA与膜结合，而其他污染物则用两种不同的洗液分两步除去。
用特殊的Rnase-free缓冲液洗脱得到的高质量的RNA，可以直接进行下游实验，也可储存备用。
无需酚/氯仿抽提或酒精沉淀，QIAamp膜就可以保证高纯，完整的RNA。
所有缓冲液和试剂都保证是无Rnase污染的。
试剂准备（由老师课前准备）：1、吸取310ul buffer AVE加入到装有310ug冷冻carrier RNA的管子中，配成1ug/ul的溶液。
讨论二：RNA检测
2）异硫氰酸胍氯化铯超速离心 法
注意事项
1 .本方法适用于一组织或 108个细胞的 RNA的提 取，不适用于小分子(5S RNA，tRNA）的提取。 2 .操作过程中避免RNase的污染。 3 .离心温度低于4℃或离心速度太快将导致CSCI 析出。
3）盐酸胍－有机溶剂法
主要原理
利用盐酸胍抑制RNA酶，匀浆裂解细胞，有机溶 剂抽提去除蛋白质。
2、RT-PCR技术
注意事项
3 、由一条 RNA单链转录为互补 DNA(cDNA) 称作 “逆转 1 、作为模板的 RNA可以是总 RNA、 mRNA 录 ”，由依赖RNARNA 的DNA 聚合酶（逆转录酶）来完成。随 或体外转录的 产物。无论使用何种 RNA， 后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的 关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的 DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原 污染。 先的 RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。 4、用于反转录的引物可视实验的具体情况选 、RT-PCR的关键步骤在是RNA的反转录，要求RNA模 2 版为完整的且不含 DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录 择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中 酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian 的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细 myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白 胞mRNAmoloney ，三种都可。 血病病毒（ murine leukemia vrius,MMLV） 反转录酶。
2）异硫氰酸胍氯化铯超速离心 法
操作流程
4 .. 弃 25 ／ 3 GIT 溶液，用吸管将下1／3吸出，用于染色体DNA的 1 加 － 7倍于组织细胞体积的异硫氰酸肌匀浆液 制备，管底胶状沉淀即总 RNA。 至含样品的勾浆器中。高速匀浆 l－2min。 5 .用70％乙醇洗RNA沉淀，弃乙醇，干燥。 2. 加十二烷基肌酸钠（SLS）至终浓度0.5％，混 6. 用300ul TE pH7.6（含0.1％SDS）溶解 RNA沉淀，用等容 匀， 5000r ／min室温离心10min。 积酚、酚 /氯仿、氯仿各抽提一次。 7 .. 上清加人 0.1体积 3mol/L NaAc（PH 5.2）， 2倍体积乙醇混 3 在Beckman 离心机相应离心管中， 20 ℃按下表 匀，－ 70℃30min。 超速离心。 8. 于4℃以12 000r／min离心 10min，弃上清液，70％乙醇漂 洗 RNA沉淀，12 000r/min离心5min，弃上清液，真空抽干燥。 9. DEPC水适量溶解RNA，测定OD260与OD280，计算RNA的 质量与浓度，－20℃或加3倍体积的乙醇－70℃保存。
欧易生物rna测序步骤
欧易生物rna测序步骤欧易生物RNA测序步骤RNA测序是一种用于研究基因表达的技术，可以帮助科学家了解细胞内基因的表达情况。
欧易生物RNA测序是一种高通量的RNA测序技术，可以同时测序数千个基因，具有高灵敏度和高准确性。
下面将介绍欧易生物RNA测序的步骤。
1. RNA提取RNA提取是RNA测序的第一步，目的是从样本中提取出RNA。
欧易生物RNA测序使用的是磁珠法提取RNA，该方法可以快速、高效地提取RNA，并且可以避免RNA降解和污染。
2. RNA质量检测RNA质量检测是RNA测序的关键步骤之一，目的是确定RNA的质量和纯度。
欧易生物RNA测序使用的是Agilent 2100生物分析仪进行RNA质量检测，该仪器可以检测RNA的完整性、浓度和纯度。
3. RNA文库构建RNA文库构建是RNA测序的核心步骤之一，目的是将RNA转化为cDNA，并将其连接到测序适配器上。
欧易生物RNA测序使用的是Illumina TruSeq RNA文库构建套装进行RNA文库构建，该套装可以快速、高效地构建RNA文库，并且可以避免文库污染和偏差。
4. RNA测序RNA测序是RNA测序的最后一步，目的是将RNA文库进行高通量测序。
欧易生物RNA测序使用的是Illumina HiSeq X Ten测序平台进行RNA测序，该平台可以同时测序数千个基因，并且具有高灵敏度和高准确性。
5. 数据分析数据分析是RNA测序的最后一步，目的是对RNA测序数据进行分析和解读。
欧易生物RNA测序使用的是生物信息学分析软件进行数据分析，该软件可以对RNA测序数据进行差异表达分析、通路分析和功能注释等。
欧易生物RNA测序是一种高通量、高灵敏度和高准确性的RNA测序技术，可以帮助科学家了解细胞内基因的表达情况，为生命科学研究提供了有力的工具。
未知RNA病毒自由培养的检测和识别
未知RNA病毒自由培养的检测和识别简介大规模并行测序技和信息学的进步重新确定了分析的灵敏度，目的是为了检测和识别病原微生物。
常规的RT-PCR测序，毛细管电泳和微阵列杂交的方法具有一定的局限性。
他们的限制主要是在复杂性方面，他们需要依靠已有的DNA序列的知识，并需要不断的完善来应对快速突变和杂交。
这些方法也取决于分离，培养以及丰富的材料来源。
本文论述了来自于临床样品所有RNA病毒的自由培养的方法。
该方法是被泰国的一所武装部队研究所开发的，该信息分析工作流程能够快速识别已知病原体。
其可以加上额外的算法来鉴定和描述新的或意想不到的病毒在一个样品中的出现。
这种方对于疾病检测和临床快速诊断的应用是一种强大的新工具。
方法1.样品准备使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)试剂盒提取总的RNA，样品来自病人的鼻咽拭子和从相同specimen1隔离培养的病毒。
RNA样品的测序使用的是TruSeq试剂盒。
在MiSeq平台上采用的是2 X 150读长的双端测序。
2.数据分析生成的数据是在两个阶段进行分析的。
第一阶段的分析是测序的Reads和已知的呼吸道病原体数据库进行比对。
病原体的鉴定可以从比对上的Reads中推测出来。
第二阶段的分析包含使用Trinity软件从头拼接比对Reads和使用Blast软件比对来确定病毒是否在数据库中找到。
这两个层次上的方法可以进行病毒序列与一个已知参考数据库的快速筛选同时也可以识别该病毒有没有可能出现在数据库中。
结果样品在MiSeq平台上进行测序，大约产出1百万的Reads。
甲型流感H3N2通过MiSeq平台从同一临床和属于同一样本的分离样品中被成功的鉴定出来。
图3A展示了8个H3N3病毒的临床样品的最小覆盖度都是300 X。
高比对的覆盖率给临床样本的病毒识别提供了一个良好的条件。
同样的分析在病毒的分离配对中也被证实。
MiSeq自动分析的整个流程大约花费了1个小时的时间。
RNA、DNA提取与检测技术
RNA、DNA提取与检测技术（内容：目前RNA提取有哪些主流试剂，有什么优点，价格如何？提取RNA有何注意事项？Northern杂交分析法的一般过程是怎样的？提取质粒目前有哪些好用的试剂盒，提取过程中有些什么注意点？价格如何？Southern杂交的一般过程是怎样的？DNA转染可用哪些方法，各有何优点和缺点？目前主流用哪几种转染方法，所用试剂价格如何，有哪些好的生物公司提供？）一.RNA的提取完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。
所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点，即１）：样品细胞或组织的有效破碎；２），有效地使核蛋白复合体变性；３），对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；5），对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。
但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。
RNA 的提取目前阶段主要可采用两种途径，1),提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2),直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。
第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。
一些公司推出的总RNA提取试剂盒,可以用来制备高质量的可用于建库的RNA。
该总RNA纯化系统采用两种著名的RNA酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和β-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。
GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。
而进一步从复合体中纯化RNA,则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。
低pH值的酚将使RNA进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。
水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。
进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。
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在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带 负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影 响Mg2+浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。
模板：
PCR中模板DNA可以是单链分子，也可以是双链 分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状 分子比环状分子的扩增效果稍好)。
就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的 数量和纯度。 一般反应中模板量为102-105个拷贝。扩增单拷贝 基因，需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母 DNA，1ng的大肠杆菌DNA。多拷贝基因扩增用
接纯化PCR产物的Kit可用。
反应缓冲液：
反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris〃Cl (20℃下 pH8.3-8.8)，50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+。 50mmol/L的KCl有利于引物的退火。 加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)或100μg/ml的牛血 清白蛋白(BSA)，可稳定酶活性；加入T4噬菌体的基 因32蛋白对扩增较长DNA片段有利。 各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的缓冲液。
PCR的原理：
体外DNA复制
包括高温变性、 低温退火和中温 延伸过程。
一、PCR基本步骤
三个步骤：
1、变性(Denature)：双链DNA目的片段在94℃下解链。
2、退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃
左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对。
3、延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最
2、鼠白血病病毒(M-MLV)反转录酶
只有单个多肽亚基（最适温度37℃）
活性：依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，
但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱，
且对热的稳定性较AMV反转录酶差。
M-MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。
cDNA引物
种类： 1、随机引物：不特异的引物 体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板， PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通 常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
1、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换 （使用一次性手套）。 2、所用的玻璃器皿需置于干热灭菌箱中200℃烘 烤2h以上。 3、不能用高温烘烤的材料，如塑料容器、试剂 等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理， 然后高压灭菌以消除残存的DEPC。
注意事项：
1、DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物。 2、DEPC能与氨基和巯基反应，因而含Tris和DTT （二硫苏糖醇）的试剂不能用DEPC处理。 3、Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。 4、配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水 配制，并尽可能用未曾开封的试剂。
2、Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的引物
绝大多数真核细胞mRNA具有3’-端Poly(A)尾，此引
物（12-18核苷酸）与其配对，仅mRNA可被反转录。
由于Poly(A)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成
的cDNA比随机引物得到的cDNA在数量和复杂性方
面均要小。
3、特异性引物
总RNA提取方法（试剂盒）：
异硫氰酸胍－苯酚法（Trizol 法） 原理：（1）Trizol的主要成分是酚。主要作用是裂 解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释 放。酚是有效的蛋白变性剂，但不能完全抑制 RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、 异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase。 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白 质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构 消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
4、引物3'-端最好与目的序列阅读框架中密码子第 一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆 动产生的不配对。 5、在引物内，尤其在3‘-端应不存在二级结构， 且3’-端尽量不用A，尤应避免连续2个或2个以 上A，因为A引发错配的几率高；最好选择T。
6、两引物之间尤其在3'-端不能互补，以防出现 引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在 4个连续碱基的同源性或互补性。 7、引物5'-端对扩增特异性影响不大，可在引物 设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起 始密码子、缺失或插入突变位点等，通常应在 5'-端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化
进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增
加，过少则使产量降低。
反应结束后，需要灭活Taq DNA聚合酶。
灭活Taq DNA聚合酶的方法有：(1) PCR产物经酚/
氯仿抽提，乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的Eห้องสมุดไป่ตู้TA
螯合Mg2+ 。 (3) 99-100℃加热10min。目前已有直
用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用
此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的
PCR扩增。
第二章 聚合酶链式反应 （PCR）
* PCR，即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）, 是一种对特定的DNA片段在体外进行快 速扩增的方法。 * 由1985年穆里斯（K. Mullis）发明，他也因此获得 了1993年的诺贝尔化学奖。
8、引物不与模板结合位点以外的序列互补。
引物浓度：
一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。
引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低
则降低产量。
4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：
dNTP原液一般配成2.5-10mmol/L分装，-20℃贮存。 一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。 当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚 合酶的活性。 4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某 种dNTP的不足出现的错误掺入。
Mg2+：
Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响 酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度， 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。 通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。对于一种新的 PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。
Yeast Total RNA
二、cDNA的合成
反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶
种类：两种 1、禽类成髓细胞病毒（AMV）反转录酶 包括两个多肽亚基（最适温度42℃） 活性：依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分 进行内切降解(RNA酶H活性)。
适温度(72℃左右)下，以目的DNA为模板进行合成。
二、PCR反应中的主要成分
引物：好坏是PCR成败的关键。
设计原则： 1、引物长度约为16-30bp。 2、引物中G+C含量通常为40%-60%，粗略估计引物的 解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)，且接近72℃最好。 3、四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C， 因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。
量更少。
模板过多可能增加非特异性产物。DNA中的杂质
也会影响PCR的效率。
Taq DNA聚合酶：
一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min， 95℃ 40min， 97℃ 5min。 Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃ 30min， 掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。 Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一 般PCR中出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，在利用 PCR克隆和进行序列分析时尤应注意。
（3）异丙醇作用是沉淀RNA。异丙醇沉淀，优点是 容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA和 mRNA，对5sRNA、tRNA不产生沉淀，所以RNA 电泳的标志性三条带中5sRNA带很不清楚，未必 是你的RNA降解。但是异丙醇难以挥发出去。 （4）因为上述试剂会影响后续实验，所以用75%乙 醇洗1-2次。一是乙醇可以溶解一些沉淀中可能的 有机物杂质；二是洗掉异丙醇、氯仿，乙醇易挥 发，痕量的乙醇很容易挥发掉。
第一章 RNA的提取和cDNA的合成
RT-PCR原理
提取总RNA
以其中的mRNA作为模板
反转录
cDNA 作模板 PCR
获得目的基因
一、RNA的提取
RNA易降解，在提取过程中要严格防止RNA
酶的污染，并设法抑制其活性。
RNA酶稳定，并广泛存在，如各种组织、人
的皮肤、手指、试剂、容器等。
采取的措施：
（2）氯仿可使蛋白变性，降低蛋白的溶解度。其主 要作用是分相，实际上是加速有机相和水相的分 层。上层水相，pH 5.1左右，当溶液pH在酸性的 时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只 有RNA分子留在水相。而当pH接近中性时，DNA 就会溶解在水相，（导致pH中性的原因可能是 trizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前 提下使trizol过量）。同时，氯仿可以去除核酸溶 液中的痕量的酚。