过氧化氢酶活性测定1
土壤过氧化氢酶活性的测定
土壤过氧化氢酶活性的测定
过氧化氢酶存在于细胞的过氧化物体内，是催化过氧化氢分解成氧和水的酶。
过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶，约占过氧化物酶体酶总量的40%。
其活性与微生物的数量和活性有关，也与土壤有机质含量、植物根系等有关，在一定程度上反映了土壤微生物学过程的强度，其强度可表征土壤腐殖化强度大小和有机质积累程度。
本实验采用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶的活性。
取2g风干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3%过氧化氢溶液。
将三角瓶放在往复式震荡机上，震荡20min。
而后加入5mL 3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。
再将瓶中的悬液用慢速型滤纸过滤，然后吸取25mL滤液，用0.1N高锰酸钾溶液滴定至淡粉红色终点。
土壤过氧化氢酶活性以震荡20min后1g土壤所消耗的0.1N高锰酸钾的体积表示。
过氧化氢酶活性=(A-B)×T
式中T为高锰酸钾滴定度的校正值；
B为用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾体积(mL)；
A为用于滴定25mL原始过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾体积(mL)。
过氧化氢酶的活性测定
过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法（滴定法、比色法）【原理】过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－)R(Fe+3OH－)2+ H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2 5 H2O2+2 KMnO4+4H2SO4-------- 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4即可求出消耗的H2O2的量。
【仪器和用具】研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。
【试剂】10% H2SO4；0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4•2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。
【方法】1.酶液提取取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入高温灭活酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。
土壤过氧化氢酶活性测定方法(完整)
高锰酸钾滴定法（一）1. 试剂配制：(1)0.3%过氧化氢溶液：①（1：100 30%的H2O2和水）②（0.5molH2O2+49.5ml蒸馏水）③（1ml30% H2O2+99ml蒸馏水）(2)3N硫酸：（10ml硫酸+50ml水）(3)0.1N高锰酸钾溶液：（1.58gKMnO4+100ml蒸馏水）2. 高锰酸钾的标定：准确称取约0.2 g在110℃干燥至恒量的基准草酸钠。
加入250 mL新煮沸过的冷水、10 mL硫酸，搅拌使之溶解。
将草酸钠溶液加热到75℃~ 85℃ (即开始冒蒸气时的温度)，趁热用待标KMnO4溶液进行滴定。
开始滴定时反应速度很慢，待溶液中产生M n2+后，反应速度加快，但滴定时仍必须是逐滴加入，至溶液呈粉红色，半分钟内不褪色即为终点。
注意滴定结束时的温度不应低于60℃。
2MnO4- + 5C2O42- + 16H+ 75~ 85℃ Mn 2+ +10CO2 + 8H2O。
参考：《高锰酸钾溶液标定方法的改进及注意事项》王继莲3. 测定：准确称取2 g风干土置100 mL锥形瓶→加入40 mL蒸馏水和5 mL0.3%过氧化氢（现配），另设对照(40 mL蒸馏水和5 mL0.3%过氧化氢)→在往复式振荡机上振荡20 min→加入5 mL3N硫酸（以稳定未分解的H2O2）→用慢速型滤纸过滤，→吸取25 ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色4．结果计算土壤的过氧化氢酶活性，以单位土重的0.1N KMnO4毫升数(对照与试验测定的差) 表示。
备注：以容量法测H2O2的酶活：Kappen（1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。
此法根据H2O2与土壤相互作用时，未分解的H2O2的数量用容量法（常用高锰酸钾滴定未分解的H2O2）测定H2O2的酶活2 KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4→2MnSO4＋K2SO4＋8H2O＋5O2土壤H2O2酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用。
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制
过氧化物酶（POD ）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H 202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。
【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL ，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL ，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g ，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL ，于研钵中研成匀浆，以4000r/min 离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。
（2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL ，KH2PO41mL ，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL ，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm 波长下测量OD 值，每隔1min 读数一次（4min ）。
以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD 值增加0.01定义为一个活力单位。
表1 紫外吸收法测定POD 酶活性配置表4.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。
也可以用每 min内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。
POD 总活性[u/g(FW)]=式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。
其中 △470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
ACK ——照光对照管的吸光度。
AE ——样品管的吸光度。
Vt ——样品液总体积，mL 。
过氧化氢酶(CAT)活性测定
过氧化氢酶(CAT)活性测定高锰酸钾滴定法(李合生．植物生理生化实验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社．2000．165-167)一、原理过氧化氢酶(catalase，CA T)普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，它属于血红蛋白酶，含有铁，能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
22R(Fe OH3+－) R(Fe2+2 2)2+2 H O2＋O2因此，可以根据H2O2的消耗量或者O2的生成量测定该酶活力的大小。
在该体系中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。
5H2O2+2KMnO4+4H2SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4二、材料、仪器设备及试剂(一)材料植物器官(花瓣、叶片等)(二)仪器设备冰箱、离心机、微量加样器(1ml、20μl、100μl)、移液管、精密电子天平、试管、研钵、剪刀、镊子、三角瓶、恒温水浴、容量瓶、酸式滴定管(三)试剂(1)10% H2SO4(2)0.2mol/L PH7.8磷酸缓冲液(3)0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4(AR)3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，再用0.1mol/L草酸溶液标定(4) 0.1mol/L H2O2：取30% H2O2(大约等于17.6 mol/L)5.68mL，稀释至1000mL，用0.1mol/L高锰酸钾标准液(在酸性条件下)进行标定(5) 0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g，用蒸馏水溶解后，定溶1000mL。
三、试验步骤(一)酶液提取取植物材料2.5g，加入PH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25mL容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定溶，4000r/min离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
过氧化氢酶活力的测定实验报告
一、实验目的1. 了解过氧化氢酶的作用和特性。
2. 掌握过氧化氢酶活力的测定原理和方法。
3. 通过实验，验证过氧化氢酶在催化过氧化氢分解过程中的活力。
二、实验原理过氧化氢酶（Catalase，简称CAT）是一种广泛存在于生物体内的酶，其主要功能是催化过氧化氢（H2O2）分解为水（H2O）和氧气（O2），从而降低过氧化氢对生物体的毒害作用。
过氧化氢酶活力的测定通常通过测量在一定时间内过氧化氢的分解量或氧气的生成量来进行。
本实验采用碘量法测定过氧化氢酶活力。
碘量法的基本原理是：在一定条件下，过氧化氢酶将过氧化氢分解，生成氧气，使溶液中的碘离子（I-）氧化成碘单质（I2）。
然后，用硫代硫酸钠滴定溶液中的碘单质，根据消耗的硫代硫酸钠的量计算出过氧化氢的分解量，从而推算出过氧化氢酶的活力。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜植物叶片（如青菜、萝卜叶等）、蒸馏水、碘液、硫代硫酸钠溶液、盐酸、氢氧化钠溶液、0.1 mol/L过氧化氢溶液等。
2. 实验仪器：分析天平、研钵、漏斗、容量瓶、移液管、滴定管、锥形瓶、水浴锅、计时器等。
四、实验步骤1. 酶液提取：- 称取0.5 g新鲜植物叶片，置于研钵中，加入2 mL pH 7.0磷酸缓冲液和少量石英砂，研磨成匀浆。
- 将匀浆转入25 mL容量瓶中，用磷酸缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容至刻度。
- 将容量瓶置于4℃冰箱中静置10 min，取上清液即为过氧化氢酶粗提液。
2. 测定过氧化氢酶活力：- 取4个锥形瓶，分别编号为1、2、3、4。
- 向1、2、3号锥形瓶中分别加入0.5 mL过氧化氢酶粗提液，向4号锥形瓶中加入0.5 mL蒸馏水。
- 向各锥形瓶中分别加入1 mL 0.1 mol/L过氧化氢溶液，立即开始计时。
- 当加入0.1 mL 1 mol/L盐酸时，停止计时，此时溶液中剩余的过氧化氢量即为酶促反应所分解的过氧化氢量。
- 向各锥形瓶中加入1 mL碘液，充分振荡，静置3 min。
过氧化氢酶活力检测方法
过氧化氢酶活力检测方法过氧化氢酶（catalase）是一种重要的酶类物质，它在生物体内起着催化无毒的氧化还原反应，将过氧化氢（H2O2）分解成水（H2O）和氧气（O2）。
由于其在维持细胞内氢离子浓度、氧化还原平衡和细胞抵抗氧化应激等方面的重要作用，因此过氧化氢酶活性的准确测定和分析显得非常必要。
在实验室中，常用的过氧化氢酶活力检测方法主要有光度法、气体检测法和电化学检测法。
首先是光度法，这是一种常用的测定过氧化氢酶活力的方法。
实验中，可以通过分光光度计测量酶样溶液中过氧化氢的浓度的变化来推测过氧化氢酶的活性。
具体的测定步骤一般为：首先，在酶样溶液中加入过氧化氢；然后，在适宜的温度下进行一段时间的潜伏期；然后，用过氧化氢检测试剂滴定到一定浓度时，观察溶液的颜色变化，并用分光光度计读取吸光度。
根据吸光度的变化可以计算出过氧化氢酶的活性。
第二种方法是气体检测法，这是一种基于检测氧气产生的方法。
实验中，可以将过氧化氢溶液加入酶样溶液中，然后用带有氧气传感器的电极测量氧气的产生速率和浓度。
根据氧气产生速率的变化可以推断过氧化氢酶的活性。
第三种方法是电化学检测法，这是一种基于电流变化的方法。
实验中，可以将过氧化氢溶液加入酶样溶液中，然后通过电极测量氧气的生成速率。
根据电流的变化可以计算出过氧化氢酶的活性。
除了以上的方法，还有其他一些比较新颖的方法用于测定过氧化氢酶活性。
例如，近年来，一些研究人员采用蛋白质组学和质谱分析等技术，通过检测酶样溶液中蛋白质的表达水平和酶活性的相关性，来推断过氧化氢酶的活性水平。
总结起来，测定过氧化氢酶活性的方法有光度法、气体检测法、电化学检测法等。
不同的方法有各自的优缺点，例如，光度法具有操作简单、成本低廉的特点，但可能受其他物质的干扰；气体检测法具有灵敏度高的特点，但需要专门的仪器和高昂的成本；电化学检测法具有快速、灵敏的特点，但需要较高的技术水平和仪器要求。
研究人员可以根据实际需求和条件选择合适的方法来测定过氧化氢酶的活性。
过氧化氢酶活力的测定实验报告doc
过氧化氢酶活力的测定实验报告篇一：过氧化氢酶活性测定实验29 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
一、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。
即可求出消耗的H2O2的量。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦叶片（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。
（三）试剂：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5.0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。
三、实验步骤（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。
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实验 48 过氧化物酶活性的测定（比色法）
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合
作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断
发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
一、原理
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物
质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定
过氧化物酶活性。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
马铃薯块茎。
（二）试剂
1 ． 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液 pH6.0 （见附录）。
2 ．反应混合液： 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液（ pH6.0 ） 50 mL 于烧杯中，
加入愈创木酚 28 μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶
液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 μl ，混合均匀，保存于冰箱中。
（三）仪器设备
分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 mL 容量瓶，吸管，离心机。
三、实验步骤
1 ．称取植物材料 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，
以 4000 r ／ min 离心 15 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5
mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。
2 ．取光径 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入反应混合液
3 mL 和磷酸缓冲
液 1mL ，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL （如酶
活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm
下吸光度值，每隔 1min 读数一次。
四、结果计算
以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]
表示之。
也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位
（ u ）表示。
过氧化物酶活性 [u/ （ g · min ） ]=
式中：Δ A 470 ——反应时间内吸光度的变化。
W ——植物鲜重， g 。
V T ——提取酶液总体积， mL 。
V s ——测定时取用酶液体积 , mL 。
t ——反应时间， min 。
POD（过氧化物酶）活性的测定
使用愈创木酚比色法。
（1）酶液提取
（2）活性测定
2.9mL 0.5mol/L pH 6.0磷酸缓冲液，加入1mL 0.05mol/L愈创木酚和0.1mL酶提取液，30℃
水浴保温15min 后迅速放入冰浴中，立即加入1mL 2%的H2O2（0.667mL 30% H2O2溶于100mL 蒸馏水，现配现用。
）激活反应，立即在470nm 下测定吸光度值，每隔30s 记录一次吸光度，共记录5次。
试验重复2次取平均值记录。
（3） 酶活力的计算：以每秒钟内OD 值变化0.01为一个酶活力单位（U ），酶活性用U/(mg ·min)表示。
A D
0.01t ∆⨯=酶活力U
其中：A ∆------反应时间内吸光度的变化值
D
------稀释倍数（粗酶液总体积
实验取用体积，其中取用体积为0.1mL ） t ------反应时间（本实验为30S ）
愈创木酚法
称取一定质量的植物材料放入研钵中，加入提取液1 mL(0. 05 mol /L pH 5. 5 的磷酸缓冲液) ，研磨，再加入9 mL 提取液，将匀浆全部转入离心管中，4 000 r /min 4 ℃离心10 min ，上清液即酶的粗提取液。
测定酶活性时，将4 mL 反应混合液( 磷酸缓冲液2 mL 、酶液1 mL 、0. 05 mol /L 愈创木酚1 mL)和1 mL 2% H2O2加入试管中立即摇匀并迅速倒入比色皿中，于470 nm 波长下用U-2800 型紫外可见分光光度计比色，立刻记录吸光度值，以后每30 s 记录1次，记录4 min ，以缓冲液代替酶液作对照，
POD 活性=V 1·ΔOD/0. 01V 2W ·Δt
式中:ΔOD 为反应初速度阶段的吸光度差，比色波长470 nm;Δt 为ΔOD 对应的时间(min) ;ΔOD /Δt 为直线部分的斜率，在此阶段吸光度与反应时间成正比;V1为提取酶液总体积(mL) ;V2为测定时取用的提取酶液体积(mL) ;W 为植物样品鲜重( g) ;0. 01 为以吸光度值(ΔOD) 变化0. 01 为1 个酶活性单位( u)。
过氧化氢酶活性的测定．取0.2ｇ去壳种子，液氮中研磨成粉，然后加入提取液(50 mmol/L ， pH 7.0 的磷酸缓冲液，20%甘油，1 mmol/L 还原型谷胱甘肽，2 mmol/L 抗坏血酸，1%聚乙烯吡咯烷酮)5 mL 继续研磨成匀浆，4 ℃，10 000 r/min 离心15 min. 在1 mL 反应体系(10 mmol/L ，pH7.0 磷酸钾缓冲液，10 mmol/L H2O2)中加入适量酶提取液，混匀后在240 nm 下测定OD 值. 过氧化氢酶活性以每分钟每克鲜重样品分解H2O2 的毫克数表示。