禽流感病毒分子生物学检测方法综述
禽流感病毒的分子生物学研究
禽流感病毒的分子生物学研究近年来，禽流感一直是人类严重关注的问题之一。
随着科技的发展，研究人员在禽流感病毒的分子生物学研究方面取得了许多进展，包括病毒的基因组组成、进化和传染机制等方面的研究。
本文将简要介绍这些研究成果，以及未来的发展前景。
病毒的基因组组成禽流感病毒是一种RNA病毒，其基因组由八段负链RNA组成。
其中，每段RNA分别编码了十多种不同的蛋白质，包括衣壳蛋白、神经氨酸酶、甲基转移酶、复制酶等等。
这些蛋白质在病毒的生命周期中起到了重要的作用。
进化和分类禽流感病毒是一种高度变异的病毒，不同的亚型之间有着明显的差异。
根据血凝抑制试验和神经氨酸酶基因序列分析的结果，人们将禽流感病毒分为H1-H18和N1-N11两个基因型。
其中，H5N1亚型是最具有威胁性的亚型之一，因为它可以感染人类，而且死亡率非常高。
传染机制禽流感病毒主要通过空气传播和直接接触传播而传播。
病毒可以在家禽和野生鸟类中不断变异，形成新的亚型，引发严重的疫情。
人们可以通过控制家禽和野生鸟类的转移、屠宰和处理等工作来控制禽流感病毒的传播。
未来的研究方向禽流感病毒的研究还有很多待解决的问题。
例如，研究人员可以继续深入研究病毒的进化和传染机制，寻找更加有效的预防和控制方法。
此外，研究人员还可以借助新的分子生物学技术，如PCR和NGS等技术，快速鉴定病毒的亚型和抗原特征，并对病毒的抗药性进行研究。
总之，禽流感病毒是一种严重的病毒，对人类和动物的生命安全构成了威胁。
随着分子生物学技术的发展，研究人员在禽流感病毒的分子生物学研究方面取得了很多进展。
未来，研究人员可以继续深入研究病毒的进化和传染机制，并开发出更加有效的预防和控制方法。
禽流感病毒分子生物学检测方法
饲料博览 ，０ １ （ ） １—Ｏ ２ ０ ，９ ｌ９ ． ２
［ ２ 任睿 玲 ， 振均 ， 经元＋ ２］ 孙 宋 药物饲料 添加剂对 环境影响 的研究 进展 ［ 饲料工业 ２ ０ ，６ 。３３ ． 刀． ０ ６ （ ） ３—６ ［ ３ 马明颖 ， 沐森 。 ２３ 李 吴
家禽和野禽的病毒性传染病 。该 病于 １７ ８８年在 意 术 的飞速 发展 ， 流 感 病毒 分 子 生 物学 检 测 方 法不 禽 大利鸡群中首次暴发 ， 现已遍布世 界许 多国家 。世 断 取得新 的进展 。
界 各地 的高致病 性 禽 流感 主要 由 Ｈ５和 Ｈ７亚 型 禽
收 稿 日期 ：０ ６０ —０ ２ ０ —８１
［２ 王玉堂． １３ 开发 中草药饲料添加剂大有可为［ 中国禽业 导刊 ， 刀．
２０ ，２ ５ ｔ３３ ０ ５２ （） ３ —．
畜禽业 ｔ０ ３ （）一０４ ． ２ ０ ， ２ ４－２ ［ １ 武 ２］
瑞， 康世 良． 中草药饲 料添加 剂与绿 色生态． 畜牧业 ［ 刀．
［３ 胨寒青 。 １］ 金征宇． 中草药饲料 添加剂 研究进展 ［ ］ 饲料 工业 ， Ｊ．
物疾 病 ， 国将 其 列为 一类 动 物疫病 ［ 我 １ ］
禽流感 的诊 断包括 临 床诊 断 和实 验室诊 断 。由
于流感病毒的亚型众多， 毒力差别很大， 所以临床症 状也千差万别 ， 难以与其他有类 似症状的传染病 区 分。而且流感的临床症状和病理变化因感染动物的
重视 ， 文章 就禽 流 感 病毒 分 子 生物 学检 测 方
兽 医药研究进展 ， ０ ３ （ ） １ １１２ ２ ０ ，８ 。３— ３． ［ ９ 马美蓉 ， 淑琴 ． 饲料安全 谈 中草药饲料 添加剂 的开发利 １］ 竺 从 用 ［］ 饲料研究 ，０ ４ （ ） ８１． Ｊ． ２ ０ ，２ 。１Ｌ９
禽流感病毒的监测及诊断
定结 果 为 阳 性，则 说 明 尿 囊 液 中 很 可 能 含 有 ＡＩＶ。 如果第一代分离物 血 凝 试 验 结 果 呈 阴 性，尿 囊 液 样 本 再 用 鸡 胚 传 １～２ 代 ，采 用 相 同 方 法 观 察 鸡 胚 的 发 育情况和检测尿囊液中的血凝活性。因为有些检测 样本中的病毒含量 很 低，需 要 通 过 鸡 胚 连 续 培 养 来 获得高滴度的病毒。 经鸡胚培养分离出具有血凝活性的 ＡＩＶ 后，可 以通过血 凝 抑 制 试 验 （ＨＩ）、神 经 氨 酸 酶 抑 制 试 验 （ＮＩ）来鉴定 ＡＩＶ 的 亚 型。 病 毒 分 离 法 和 血 清 学 方 法的优点 在 于 它 们 可 以 用 来 准 确 判 断 是 否 发 生 了 ＡＩＶ 的感染。 然 而 它 们 却 难 以 监 测 环 境 中 由 于 突 变不断产 生 的 新 的 ＡＩＶ 变 异 株［１０］，这 主 要 是 由 于 人们常常缺乏 针 对 新 出 现 的 ＡＩＶ 抗 原 变 异 株 起 特 异 性 反 应 的 血 清 、抗 体 及 相 关 的 标 准 诊 断 试 剂 。 ２．２ 病毒特异性抗 原 的 检 测 法 病 毒 特 异 性 抗 原 检测法采用的 原 理 主 要 利 用 针 对 ＡＩＶ 特 异 性 抗 原 的抗体来捕获 ＡＩＶ 特异性抗原，例如琼脂扩散试验 及酶联免疫吸 附 试 验 等 。 ［１１］ 目 前 已 有 检 测 ＡＩＶ 特 异 性 抗 原 的 试 剂 盒 问 世 。 ［１２］ 由 于 ＡＩＶ 的 核 蛋 白 （ＮＰ）相对保守，不 易 变 异，所 以 目 前 采 用 的 病 毒 抗 原捕获免 疫 测 定 主 要 是 用 来 检 测 ＡＩＶ 的 核 蛋 白。 ＡＩＶ 特异性抗原检测法的优点是快速，据报道有些 方法可以在３０ｍｉｎ 之 内 得 到 检 测 结 果 。 ［１３］ 目 前 可 以检 测 ＡＩＶ Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３ 及 Ｎ７ 亚 型 的 抗 体 的 ＥＬＩＳＡ 方法均已 建 立 。 ［１４］ 但 抗 原 测 定 法 目 前 存 在 的主要问题是检测敏感度低于病毒分离法及病毒核 酸检测法，同时 对 所 测 样 品 的 质 量 要 求 较 高。 检 测 ＡＩＶ 特异性抗 体 的 试 剂 盒 则 可 用 于 评 估 鸟 类 或 禽 类是否曾接触或感染过 ＡＩＶ。 ２．３ ＡＩＶ 的 毒 力 测 定 ＡＩＶ 的 毒 力 主 要 是 通 过 ６ｗ龄 鸡 体 实 验 的 静 脉 内 致 病 指 数 （Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎｄｅｘ，ＩＶＰＩ）来判定，即若 ＡＩＶ 在６ｗ 龄 鸡 体 内 的ＩＶＰＩ大 于１．２ 时 ，则 认 为 被 检 毒 株 属 于 ＨＰＡＩＶ［９］。另一 常 用 的 判 定 毒 力 方 法 是，当 ＡＩＶ 经静脉途 径 感 染 ４～８ ｗ 龄 鸡 后，若 在 １０ｄ内 引 起 至少 ７５％ 的 鸡 群 死 亡，则 也 可 以 将 所 测 定 的 ＡＩＶ 毒株划 归 为 ＨＰＡＩＶ［９］。 研 究 结 果 表 明，目 前 所 发 现的 ＨＰＡＩＶ 大多是 Ｈ５ 或 Ｈ７ 亚 型。 尽 管 仍 有 不 少 Ｈ５或 Ｈ７亚型的 ＡＩＶ 是 ＬＰＡＩＶ，可是一旦它们 经基 因 突 变 或 基 因 重 配 后 就 很 有 可 能 形 成 ＨＰＡＩＶ，感 染 新 的 宿 主 。 判 断 Ｈ５ 或 Ｈ７ 亚 型 的 ＬＰＡＩＶ 有 无 可 能 成 为 ＨＰＡＩＶ 的一个 常 用 标 准 是：通 过 序 列 测 定 检 查 病 毒 ＨＡ 前体 中 的 蛋 白 酶 裂 解 位 点 附 近 是 否 含 有 多 个碱性氨 基 酸。 人 们 发 现 在 ＨＡ 前 体 蛋 白 裂 解 位
禽流感实验室检测技术方案
禽流感实验室检测技术方案禽流感，这个让无数人闻之色变的词汇，已经成为我们生活中无法回避的一部分。
如何快速、准确地检测出禽流感病毒，成为了当务之急。
今天，就让我来为大家详细介绍一下禽流感实验室检测技术方案。
我们需要明确检测的目标。
禽流感病毒有多种亚型，我们要检测的是哪些亚型，需要根据实际情况来确定。
一般来说，H5和H7亚型的禽流感病毒对我国养殖业和公共卫生安全威胁较大，因此，我们将重点检测这两种亚型。
我们要选择合适的检测方法。
目前，实验室检测禽流感病毒的主要方法有病毒分离、血清学检测和分子生物学检测。
病毒分离是传统的检测方法，准确性较高，但操作复杂，耗时较长。
血清学检测通过检测抗体来判断病毒感染情况，速度快，但准确性相对较低。
分子生物学检测，尤其是实时荧光定量PCR技术，具有高灵敏度、高特异性、快速简便等优点，成为近年来禽流感病毒检测的主流方法。
下面，我将详细介绍实时荧光定量PCR技术在禽流感实验室检测中的应用。
一、实验材料1.样本：采集疑似感染禽流感的家禽咽喉拭子、泄殖腔拭子等。
2.试剂：实时荧光定量PCR试剂盒、病毒提取试剂盒等。
3.仪器：实时荧光定量PCR仪、离心机、恒温箱等。
二、实验步骤1.样本处理：将采集的拭子样本放入病毒提取试剂盒中，按照说明书操作，提取病毒RNA。
2.模板制备：将提取的病毒RNA与实时荧光定量PCR试剂盒中的缓冲液、酶混合，进行模板制备。
4.结果分析：观察实时荧光定量PCR仪上的扩增曲线和溶解曲线，判断样本是否为阳性。
三、注意事项1.实验过程中要严格遵循无菌操作原则，防止样本污染。
2.实验室人员要具备一定的分子生物学实验技能，确保实验顺利进行。
3.实验结果要及时记录，并与临床诊断相结合，为疫情防控提供有力支持。
通过实时荧光定量PCR技术，我们可以快速、准确地检测出禽流感病毒，为我国养殖业和公共卫生安全保驾护航。
当然，实验室检测只是禽流感防控工作的一部分，我们还需要加强疫情监测、疫苗接种、生物安全等措施，共同抵御禽流感病毒的侵袭。
禽流感实验室检测方法
禽流感实验室检测方法一、标本的采集与处理(一)标本的采集1、病毒分离标本的采集病毒分离成功与否很大程度上取决于采集标本的质量，及其保存、运输等环节。
多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物，有时也采用肺活检材料等。
标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，常用的采样液为：普通肉汤，pH7.4-7.6的Hank's、Eagle's或水解乳蛋白液。
为防止细菌和真菌生长，在采样液中需加入抗菌素，以往抗菌素多用青、链霉素，近来发现不少种类细菌对它们具有耐药性，故近来多用庆大霉素（其终浓度为每ml采样液中加入0.1 ml的10mg/ml）和抗真菌药物（终浓度为每毫升采样液中加入0.008 ml的250ug/ ml）。
主要的采集方法有以下几种：1)鼻拭子：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。
以同一拭子拭两侧鼻孔。
将棉签浸入4-5 ml采样液中，尾部弃去。
2)咽拭子：用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将棉签头浸入4-5 ml 采样液中，尾部弃去。
注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。
3)鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器（国外有售）从鼻咽部抽取粘液。
先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。
收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器3次。
由于该收集器国内难买到，也可采用国内一种设计装置（见郭元吉、程小雯著，流行性感冒病毒及其实验技术。
中国三峡出版社P186，1997）。
4)鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将1-1.5ml洗液注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。
然后让患者低头使洗液流出，用平皿或烧杯收集洗液。
重复此过程数次。
洗两侧鼻孔最多可用10-15 ml洗液。
5)漱口液：用10 ml洗液漱口。
漱时让患者头部微后仰，发“噢声”，让洗液在咽部转动。
然后，用平皿或烧杯收集洗液。
注：取鼻洗液和漱口液时，需预先了解患者是否对抗菌素有过敏史，如有则洗液和含漱液中不应含有抗菌素。
禽流感病毒分子克隆技术路线
禽流感病毒分子克隆／分子生物学技术路线：Virus提RNA［先virus纯化］反转录（vRNA cDNA）PCR扩增（RT-PCR）[cDNA]回收特异阳性带（即PCR引物中所需带）（切胶）连接［连接克隆载体如PMD 18-T Vector］转化(Competent Cell JM109或DH5α)涂菌（涂板）挑菌酚氯仿异戊醇或异丙醇硅脂法粗提质粒试剂盒细提质粒[小量质粒抽提纯化试剂盒]PCR质粒鉴定保存细菌／菌种测序序列分析比较第一步 AI virus RNA提取250μl 未浓缩的病毒液＋750μl的 Trizol 或Trizol Ls Reagent(裂解液) 摇匀 5min 15～30℃（室温）加入200μl氯仿1～2min 15～30℃（室温）摇匀≤12000g 10min RCF 2～8℃吸取上清约500μl，加入500μl异丙醇 注：①勿吸下层液－20℃（过夜）可以 ②上清液：异丙醇＝1：1≤12000g 10min 2～8℃弃上清 注：rpm（转速）与相对离心力(RCF,g)的换算公式:70%DEPC乙醇1000μl rpm=1000×(RCF/1.12r)1/2r：转子轴心到离心管底的水平距离7500g 5min 2～8℃超净台内充分干燥后或抽真空后加入40μl DEPC水，－20℃保存注意：①用DEPC水处理高压的离心管和枪头②带手套操作注意：DEPC水配制：DEPC:过柱水（mili水）＝1：1000,配制时充分摇匀，均一。
离心管、枪头DEPC水处理：用配好的DEPC水加入到饭盒中，放入离心管和枪头，DEPC水浸没离心管与枪头。
第二步反转录试验（RT：reverse transcription）20μl反应体系：12bp Ui primer 1μl70℃ 5minvRNA 5μl冰浴10minRNase inhibitor 1μl（≤100μl体系最大为1μl）5× First buffer 4μl2.5M dNTP 2μl 冰上操作0.1M DDT 2μlDEPC水4μlReverase M-ML-V(反转录酶) 1μl（≤100μl体系最大为2μl）37℃ 60 min、 90min、 120min 或2～4小时，依序列长短而定试剂： RNAOUT RNase inhibitor，Reverase M-MLV 购自Invitrogen.第三步PCR 扩增试验反应体系：RT prduct(cDNA) 5μl 10× Ex Taq buffer10μldNTP 6μlp1（up primer）1μl 19μlp2（down primer）1μlEx Taq 1μlddH2O 76μl注：①p1、p2分别为上、下游引物，扩增不同片段用不同的引物。
浅析研究禽流感病毒检测方法相关进展
浅析研究禽流感病毒检测方法相关进展禽流感是一种高度传染性的疾病，对禽类产业造成了巨大的损失，同时对人类健康也带来了极大的威胁。
因此，准确、快速地检测禽流感病毒对于防控禽流感具有重要意义。
本文将对禽流感病毒检测方法相关进展进行浅析。
一、传统检测方法1. 细胞培养法细胞培养法是一种常用的传统禽流感病毒检测方法。
该方法将病毒接种到特定的细胞培养物中并进行培养，观察细胞的形态变化、病毒感染区域出现的细胞变形、塑像等特征来判断样本中是否存在禽流感病毒。
该方法具有操作简单、成本较低等优点，但需要一定时间进行细胞培养以便检测，且检测结果需要通过显微镜观察，此法的数据精度相对较低，不能对病毒毒株作差异分析。
此外，细胞培养法只能检测能够感染特定细胞系的禽流感病毒株，不能检测全部毒株。
2. 血清学方法血清学方法是利用血清学技术，检测血清中是否存在禽流感病毒特异性抗体或抗原的方法。
血清学方法具有操作方便、标本保存期长等优点，同时可对不同毒株作差异分析，且可以作为定量方法来测定病毒的抗体或抗原含量。
但是该方法的灵敏度相对较低，不能检测到病毒感染初期的病例；同时抗体响应不稳定，因此不能用于诊断急性感染，只能用于长期的流行病学监测。
二、分子生物学检测法随着现代分子生物学技术的不断发展，在禽流感病毒检测方面也出现了一系列基于分子生物学技术的新型检测方法，如PCR法、实时荧光定量PCR法（RT-PCR法）、LAMP法、核酸微芯片法等。
1. PCR法PCR法是指用聚合酶链反应技术，通过扩增目标病毒基因片段使其呈指数倍增长从而检测样本中的禽流感病毒。
PCR法具有闭管式系统、扩增特异性高、灵敏度高、快速检测等优点，但PCR法检测中存在假阳性、假阴性等误差，并且PCR扩增后的目的产物需要进行凝胶电泳分析，需要一定实验经验，操作相对较复杂。
RT-PCR法是在传统PCR法基础上，通过引入逆转录过程得到RNA模板进行扩增，从而实现对RNA病毒如禽流感病毒检测。
禽流感疫情的检测技术和预防方法
禽流感疫情的检测技术和预防方法近年来，禽流感疫情频频爆发，对人类和动物的健康造成极大威胁。
禽流感是世界性应激源，也是人类最担心的传染疾病之一。
如何及早发现和防范禽流感成为全球关注的话题。
本文将介绍禽流感疫情的检测技术和预防方法。
一、禽流感疫情的检测技术1. PCR 检测技术PCR 检测技术是目前最普遍的禽流感检测技术之一。
它的敏感和特异性较高，可以在短时间内检测出病毒核酸。
PCR 检测技术通过扩增样品中的病毒核酸，建立病毒RNA 和DNA 的检测模型，实现禽流感病毒的快速检测。
同时，PCR 检测技术试剂盒价格相对较低，可以广泛应用于实验室。
2. 传统的病毒学检测技术传统的病毒学检测技术包括：细胞培养、鸟胚传递、抗体检测等，这些技术常用于检测禽流感病毒。
其中鸟胚传递和细胞培养技术是主要的检测方法，通过这些技术，能够根据病毒的特性、形态和外壳来检测病毒。
这些检测方法不仅具有较高的准确性，而且可用于病毒复原、病毒培养和抗原表征，有助于对病毒的深入研究。
二、禽流感疫情的预防方法禽流感疫情的预防方法主要包括以下几种：1. 禽流感疫苗预防禽流感疫苗预防是最常用的禽流感预防方法之一。
疫苗可以帮助鸟类产生免疫力，使它们能够对病毒产生抵抗力，从而减少被感染的机会。
由于禽流感具有高度变异性，因此根据病毒菌株的变化需要不断更新和传统疫苗的研制。
但是，疫苗预防的生产时间较长、疫苗成功率较低是质疑其效果的主要原因。
2. 密切监控和管理密切的监控和管理是防止禽流感疫情发生的其他重要手段之一。
监控和提高人与禽类之间的距离，同时监控禽畜市场，加强宣传和警示，以减少病毒的传播。
在过去的几次严重的禽流感疫情中，对禽类进口、出口等进行严格管理，有助于防止疫情扩散。
3. 健康卫生教育健康卫生教育是预防禽流感疫情的重要途径之一。
定期开展健康卫生教育，加强人们的健康意识和卫生知识，增强人们知晓和控制禽流感疫情的能力，有助于减少病毒的传播。
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5基础科学中国畜牧兽医文摘2012年28卷第11期禽流感（AI ）是由A 型流感病毒（AIV ）引起的一种以禽类呼吸系统及全身性败血症为特征的禽类疾病综合征。
自禽流感被发现至今100多年来，人类并没有掌握特效的防治该病方法。
暴发疫情时，一般还是依靠消毒、隔离、大量宰杀等方法防止其蔓延，经济损失巨大。
能否及时发现该病流行，尽快采取有效措施，是降低经济损失的有效途径。
因此，快速、准确的检测十分重要。
1 聚合酶链式反应1986年，Bea rd 用PCR 技术诊断AI ，大大缩短了AI 的诊断时间。
1993年，Kaw aoka 应用PCR 和Southern-blotting 联合辨别A IV 血凝素基因序列，现已建立了可以直接从临床病料的感染组织中检测AIV 的RT-PCR 诊断技术，可用于所有亚型AIV 感染的早期快速诊断。
1997年，黄平等用PCR-RFL P 方法分析流感病毒H 3N 2亚型毒株，认为该方法作为一种分子流行病学筛选试验在流感变异研究中具有重要作用。
1998年，崔尚金等首次建立了针对H 7亚型A IV 的RT-PCR 诊断技术。
2000年，Schw eiger 等应用荧光PCR 法对呼吸道标本中的流感病毒进行型别、亚型鉴定，并将该方法应用于德国近2个流感流行季节监测中。
2001年，M ing-Shiuh Lee 等建立了以HA 蛋白序列为模板的H 5、H 7亚型特异性RT-PCR 诊断技术和以NP 或M 蛋白序列为模板的型特异性RT-PCR 诊断技术。
同年，Herrmann 报道，用巢式RT-PCR 可以同时检测A 型流感、B 流感。
Spackman 建立了RRT -PCR 方法，将荧光素标记的探针与引物一起在荧光PCR 仪中反应，电脑对整个反应进行实时监测，避免了交叉污染。
利用探查流感M 基因可以迅速诊断病毒感染，同时加入H 5、H 7亚型血凝素特异性探针，研究出一种可以鉴别这2个亚型的RRT-PCR 方法。
2000年，No to mi 等建立了环介导恒等温扩增（LAM P ）技术，这是一种新型的核酸扩增技术。
该方法应用广泛，适用于基层实验室进行快速检测。
2008年，侯佳蕾等根据H 5亚型A IV HA 基因序列，设计了一套特异识别HA 基因序列中6个不同区段的环介导恒等温扩增引物，并以此套引物建立了一种基于LAMP 技术的H 5亚型禽流感病毒诊断方法，结果表明，该方法对H 5亚型A IV RNA 的最小检测限为10-6，灵敏度高于RT-PCR 方法，全部反应可在1.5h 内完成。
在反应体系中添加SYBR G REEN I 染料后，可通过肉眼观察有无荧光，直接判定结果。
N ASBA 技术是一项以RNA 为模板的快速等温扩增技术，该技术特别适用于RNA 分子的检测。
Collins 研究小组于2002年首次发表了关于应用NASBA 技术检测禽流感病毒的论文，目前已成功开发出可检测禽流感群特异性（H 1～H 15）（NASBA -AIV ）、H 5亚型（N ASBA -H5）、H 7亚型（NA SBA-H 7）的NA SBA/ECLipse 检测试剂盒。
2005年，单松华等也建立了N ASBA 技术进行H 5亚型的禽流感检测。
该技术的特点是整个扩增过程在恒温条件下进行，因此不需要特殊的控温装置，大大避免了R 扩增过程中复杂的温度变化，不仅能检测出具有感染性的完整的病毒颗粒，还能检出非感染性病毒粒子以及错误包装的非感染性病毒粒子。
2 基因芯片技术由于流感病毒拥有众多的型和亚型，无论是现存的哪一种诊断方法，都无法同时对所有的流感病毒进行精确的分型。
基因芯片技术可以对成千上万个基因进行检测，它的出现为同时对流感病毒进行检测和分型提供了可能的途径。
基因芯片是指将大量的核酸分子扩增的cDN A 或合成的特异性寡核苷酸探针以大规模阵列形式固化在载玻片等芯片载体上，通过与Cy3、Cy5荧光素标记的样品进行核酸杂交，检测杂交信号的有无和强弱，进而判断样品中被检分子的种类和数量。
该项技术具有高通量的优点，检测禽流感病毒的时间约为7h 左右。
Li J 等建立了鉴别流感病毒型和亚型的基因芯片检测方法，设计的26对引物可从A 型流感病毒HA （H 1，H 2，H 3）、NA （N 1，N 2）和NP 基因，以及B 型流感病毒的HA （H 1，H 2，H 3）、N A （N 1，N 2）和NP 基因上的目的基因杂交，从而达到鉴别型和亚型的目的。
目前基因芯片技术在流感病毒的检测中，主要用于科研和流行病学调查，操作较繁琐，检测成本及硬件要求均较高，离实际应用还有一段距离。
3 核酸探针技术核酸探针自20世纪70年代末出现以来，在致病因子的检测中，越来越发挥出优于常规方法的长处。
它可以确认血清学反应为阴性的慢性病毒的存在，也可以检出培养困难、或不易制成高滴度抗体、或没有被膜蛋白不能制备抗体、或表面抗原分型较多难以找到共性抗体的病毒。
核酸探针灵敏度高，检测样品数量大，需要的设备要求不高，价格相对便宜，使用的探针从早期的对人体危害较大的放射性同位素，到被安全性较高的非放射性标记物所取代。
目前使用较多的是地高辛（异羟基毛地黄毒苷，Digoxigenin ，DIG ）。
D IG 标记探针的标记方法有随机引物法、缺口平移法、末端标记法和PCR 标记法。
其中，PCR 标记法是近年来刚发展起来的一种方法，其原理与PCR 相同，不同之处在于在dNTPs 中的dUTP 带上了DIG 标记物。
黄庚明等利用PCR 技术建立并优化了检测AIV 核酸的D IG 标记的cDNA 探针杂交法。
该探针具有良好的特异性和敏感性，为从分子水平探讨A I V 的发病机理及临床早期快速诊断提供了新的手段。
参考文献[1] BEARD C W.Avian influen za antibody detection by PCR [J].AvianDisaeae ，1986，（42）：779-785.[2] KAWAODA D K ，MUNCH M .PCR as a tool for d iagno sis of lowpathogenicity avian influenza[J].Avian Disaeae ，1993，47（2）：1075-1078.[3] 黄平，B ND R ，沈桂章，等用R RFL 方法分析流感病毒3N 亚型毒株[]疾病控制杂志，，（3）；6禽流感病毒分子生物学检测方法综述陈爱林1安亚兰1孟祥升2刘宏祥3（1.江苏省射阳县畜牧兽医站，射阳224300；2.江苏省连云港市动物卫生监督所，连云港222001；3.江苏省家禽科学研究所，225009）[摘 要]禽流感是一种以禽类呼吸系统及全身性败血症为特征的禽类疾病综合征。
一旦暴发疫情，经济损失巨大。
能否及时发现该病的发生，尽快的做出应对措施是降低经济损失的途径之一。
目前，分子生物学检测方法在A I V 病原学检测及诊断方面有着较大优势，可以对其进行快速、准确的检测。
[关键词]禽流感病毒聚合酶链式反应基因芯片技术核酸探针技术7PC E E C A .PC -P H 2J .199717-178.基础科学中国畜牧兽医文摘2012年28卷第11期[4] 崔尚金，陈化兰，唐秀英，等.禽流感RT-PCR诊断法的建立[J].中国预防兽医学报，1998，（2）：42-44.[5] SCHWE IGER B，ZADOW I，HECKLER R.Ap p lication of afluo rog enic PCR assay fo r ty ping and subty pin g of influenza viruses in respiratory sam ples[J].J Clin Microbiol，2000，（38）：15-52.[6] Ming-Shiuh Lee.Development o f a real-time reverse transcriptasePCR assay for typ e A influenza virus and the avian H5an d H7 hem agglutinin sub types[J].J o f Clinical Micro b iology，2001，29（4）：446-449.[7] Herrmann B，Larsso n C，Zweyg berg BW.Sim ultaneo us detectio n andty ping of influenza v iruses A an d B by a nested reverse transcription-PCR：comparison to viru s isolation and an tigen detection b y imm unofluorescence and optical immuno assay（FLU OIA）[J].J Clin M icrobio l.2001；39（1）：134-8.[8] SPACKM AN E，DENN IS A S，MYERS T J，et al.Developmento f a real-time rev erse transcriptase PCR assay fo r type A influenza v irus and the avian H5and H7hemag glutinin subty pes[J].J o f Clinical M icrobio logy，2002，40（9）：3256-3260.[9] LEE CW，SUAREZD L.Application o f real-tim e RT2PCR fo r th equantiatio n and co mpetitive rep lication study of H5an d H7subtype avian influenza v irus[J].J Viro lM ethods，2004，（119）：151-158.[10] DYBKER K，MUNCH M，KURT J H，et al.RT-PCR-ELISA asa to ol for d iagnosis o f low-pathogenicity avian influenza[J].AvianDisease，2003，（47）：1075-1078.[11] NOTOMI T，OKAYAM A H，M ASUBUC H IH，et al.Loo p-mediatedisothermal amp lification of DNA[J].Nucleic Acid s Res，2000，28（12）：63.[12] 侯佳蕾，罗开健，樊惠英，等.H5亚型禽流感病毒RT2LAM P快速检测方法的建立[J].中国兽医科学，2008，38（12）：1070-1074.[13] COL INS R A，KO L S，SO K L，et al.Detection o f highly patho genicand lo w patho genic avian influenza subtype H5（Eurasian lineage）using NASBA[J].J VirolM etho ds，2002，103（2）：213-325. [14] 单松华，刘乐庭，陈家华，等.NASBA快速检测禽流感H5亚型病毒[J].中国病毒学，2005（3）：74-78.[15] Gy armati P，Co n ze T，Zo hari S，et al.Simultaneo us genotyp ingof all hem agg lutinin and neuram indase subtypes of avian influenza viruses b y use of padlock p ro b es[J].J Clin M icrobiol，2008，46（5）：1747-1751.[16] Li J，Chen S，Ev ans D H.Ty ping and sub typing influenza virususing DNA microarrays and multiple ex rev erse t ranscriptasePCR[J].J Clin M icro biol，2001，39（2）：696-704.[17] Kessler N，Ferraris O，Palmer K，et e o f t he DNA Flo w-Th ru C hip，a th ree-dim ensional biochip，fo r ty ping and subtyping of influenza virus[J].J Clin Micro bio l，2004，（42）：2173-2185.[18] Townsend M B，Dawson E D，M ehlm ann M，et al.Experimentalev aluation o f the Flu Chip diagno stic micro array fo r influ enza v irus surv eillance[J].J Clin M icrobio l，2006，（44）：2863-2871. [19] 王秀荣，邓国华，于康震，等.在DNA芯片平台上探测AIV不同亚型cDNA[J].中国农业科学，2005（2）：184-188.[20] Daw so n E D，Mo ore C L，Dank bar D M，et al.Identification o f A/H5N1influenza virus usin g a single g en diagnostic microarray[J].Analytical Chem istry，2007，79（1）：378～384.[21] 徐秋林.流感病毒寡核苷酸检测芯片的初步研究[D].广东广州：第一军医大学，2005：68-72.[22] Sengupta S，On o dera K，Lai A，et al.M olecular detection an did en tificatio n of influenza viruses b y oligo n ucleo tide microarray hybridizatio n[J].J Clin M icrobio l，2003，（41）：4542-4550. [23] 刘毅新，刘仲明，王弘，等.用于禽流感H9亚型检验的牙点免疫蛋白芯片的研制[J].中国卫生检验杂志，2007，17（2）：217-219.[24] 黄庚明，辛朝安.PCR制备地高辛标记的探针检测禽流感病毒核酸[J].中国兽医杂志，2001，（12）：3-7.康养殖业生产是一项系统工程，任何一项措施的作用效果，都会在时空上受制于其他要素因子的影响。