茶多酚、维生素C体外抗氧化作用的探究

关键词：茶多酚维生素C氧自由基清除血清脂蛋白氧化修饰
1. 前言
1956年Harman提出的“衰老自由基学说”得到不少研究的支持[1]。随着年龄增加，机体抗氧化防御体系功能下降，导致氧化损伤加剧，伴随一些慢性疾病发生，如心脑血管疾病、癌症、肿瘤、糖尿病等疾病。抗氧化、抗衰老已经成为保健美容的热点研究课题。同时研究表明,脂蛋白氧化修饰与动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)性心脑血管疾病的发生、发展密切相关。低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL)和极低密度脂蛋白(Very low-density lipoprotein，VLDL)氧化修饰后致AS作用增强,高密度脂蛋白(High-density lipoproteins，HDL)氧化修饰后抗AS效应降低,并具致AS效应[2, 3]。近年来，发现茶多酚具有较强的抗氧化活性，富含天然抗氧化物质，具有抗氧化,抗癌和肿瘤的发生,抗动脉粥样硬化,降血脂和血糖,抗龋护齿和抑制细菌的生长等多种保健和药理作用[4-6]。茶多酚对体内血清脂蛋白氧化修饰有了初步研究[7]，但体外血清脂蛋白氧化修饰尚少研究，本实验对其做出初步实验探究。研究发现维生素C在低浓度时具有促氧化作用，而高浓度时则有抗氧化作用[8]。对于抗氧化剂TP是否存在相同的作用效应，通过实验做出初步阐明；并探讨不同浓度TP对自由基清除率、抑制血清脂蛋白氧化修饰效应影响，并且与传统的抗氧化剂维生素C作比较，有利于进一步了解两者不同抗氧化作用的特点；进而为抗衰老、防止AS选择保健品、开发产品提供参考。
茶多酚、维生素C
体外抗氧化作用的探究
09级临床检验葛健祥113200900320011
09级临床检验张涛113200900320012
09级临床检验李思远113200900320017
09级临床检验区晓华113200900320025
1.摘要……………………………………………..........3
2.前言…………………………………………………..3
表1 茶水配备
空白对照组
实验组
干茶叶
（g）
0
2
沸蒸馏水
（ml）
100
100
6.1.2茶水过滤、离心
15分钟后，把用实验编号的烧杯中茶水分别倒到过滤漏斗上滤去渣得粗茶水；然后把滤液转移到离心管中并放在1000r/min离心机中离心1min。1min后用移液管吸取上清液转移到用实验编号烧瓶中并盖上瓶塞。
6.2 分光光度法测定茶水中的茶多酚浓度……..................7
6.3茶水用倍比稀释法稀释…….......................................8
6.4 维生素Ｃ含量测定……............................................8
6.2.3在以上两容量瓶中分别加pH7.5磷酸盐缓冲液至刻度，用50mm比色杯，在波长540nm处，以空白组溶液作参比，测定吸光度(A)。
按下式计算茶多酚含量：
6.3茶水用倍比稀释法稀释
取四支EP管分别加入1ml的煮沸过的蒸馏水，然后取1ml的标准茶多酚溶液加入第一支EP管，得到 。取 的溶液1ml加入第二支EP管得到 。同样方法得到 、 。
c(I2)=─────────────────────
用于滴定Na2S2O3标准溶液的I2的体积V
6.4.3维生素C含量的测定
量取配制好的各瓶维生素C混合液10mL，加入10ml2mol/L醋酸和8滴0.5%淀粉水溶液，立即用0.01mol/L I2标准溶液滴定至稳定的浅蓝色即为终点。平行测定三次，计算维生素C的含量。
维生素C的含量计算公式：
6.4.4标定的维生素C溶液倍比稀释
取四支EP管分别加入3ml的煮沸过的蒸馏水，然后取1ml的标准维生素C加入第一支EP管，得到 。取 的溶液1ml加入第二支EP管得到 。同法得到 、
6.5茶多酚/维生素C氧自由基清除测试
6.5.1取4.5 mL pH=8.210mmol/L的Tris-HCl缓冲液，4.2 mL蒸馏水；然后实验组加入1ml不同浓度茶多酚溶液/维生素C溶液，实验组的空白管加入1ml不同浓度茶多酚溶液/维生素C溶液，阴性对照组和阴性对照的空白管都不加样品，把各管混匀。
3.3氧自由基清除原理[10, 11]
在碱性条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,生成 和有色中间产物,该有色物在λ=325 nm处有一特征吸收峰。当加入清除剂时,有色中间产物的生成受到抑制,邻苯三酚的自氧化反应受阻,溶液在λ=325 nm处吸收峰值减小。故通过测定 值可以定量判断自氧化反应的程度,并可以计算出清除剂的清除率。
维生素C又称抗坏血酸，分子式C6H8O6，相对分子质量为176.12。包括L－抗坏血酸和L－脱氢抗坏血酸，两种抗坏血酸在一定条件下可以相互转化（如图）。
维生素C分子中的希二醇基具有还原性，能被I2定量地氧化成二酮基，反应为：
以淀粉为指示剂，用直接碘量法可测定药片、注射液、水果中的维生素C的含量。标准I2溶液采用间接配制法获得，用Na2S2O3标准溶液标定，反应如下：
6.1.3把用空白编号烧杯中的溶液转移到空白编号的烧瓶盖上瓶塞；并把空白和实验编号烧瓶放到37℃水浴箱中保持温度。
6.2分光光度法测定茶水中的茶多酚浓度
6.2.1打开空白组、实验组烧瓶塞子，用加样枪分别准确吸取茶水1ml。
6.2.2分别注人两个用空白和实验编号的25ml容量瓶中，加水4ml和酒石酸亚铁溶液5ml，充分混合。
●c(I2)=0.01mol/L I2标准溶液的标定
用移液管取10mL0.01mol/LNa2S2O3标准溶液于锥形瓶中，加入8滴0.5%的淀粉水溶液，用I2标准溶液滴定至稳定的浅蓝色，30秒不退色即为终点。平行标定三次，计算I2标准溶液的浓度c(I2)。计算公式：
Na2S2O3的体积（10ml）×0.01（mol/l）
（实验前准备）
5.2 材料的处理
对已购买的绿茶进行筛选，将其中带叶子的茶叶选出，去除掉茶叶中的茶杆和茶渣，将筛选好的茶叶放入保鲜袋中，密封保存，待实验使用。（实验前准备）
6.实验操作步骤
6.1茶水的制备
6.1.1用托盘天平按表1称取茶叶，加进用空白和实验编号的烧杯中，然后用沸蒸馏水100mL浸泡15分钟。
09级临床检验张涛113200900320012
09级临床检验李思远113200900320017
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摘要
绿茶对氧自由基的清除，其中主要是绿茶中的茶多酚(Temasek Polytechnic,TP)对氧自由基的清除作用。通过不同浓度的茶水、维生素C对氧自由基的清除率试验和对血清脂蛋白（serum lipoprotein）氧化修饰抑制试验，作出浓度清除率的曲线、血清脂蛋白氧化修饰抑制效应曲线从而进行两者浓度清除率和浓度血清脂蛋白氧化修饰抑制效应曲线的比较，得出两者的清除作用和血清脂蛋白氧化修饰抑制效应的强弱和不同作用特点。初步了解不同浓度TP、维生素C对自由基清除和血清脂蛋白氧化修饰抑制效应变化情况。为临床指导防止衰老和动脉硬化提供参考。本实验中采用酒石酸亚铁比色法（GB8313-2002）测量茶水中TP含量，I2氧化还原滴定法测定维生素C浓度。采用邻苯三酚自氧化法测定自由基清除率，共轭双烯生成影响实验测定血清脂蛋白氧化修饰抑制程度。进而利用不同浓度TP、维生素C进行氧自由基清除和血清脂蛋白氧化修饰抑制实验。
茶叶中的茶多酚含量以干态质量分数表示，按下式计算：
式中：L1——试液的总量（ml）
L2——测定时的用液量（ml）
——试样的质量（g）
m——试样干物质含量百分率（%）
A——试样吸光度
1.957——用10nm比色杯，当吸光度等于0.50时，每毫升茶汤中含茶多酚相当于1.957mg
3.2 维生素C的测定原理
5.实验材料及试剂
绿茶、蒸馏水、七水硫酸亚铁（ ）、酒石酸钾钠（ ）， PH=7.5的磷酸盐缓冲液（PBS）、、2.5mmol/L硫酸铜溶液，3mmoL/L邻苯三酚（以10mmoL/L为溶剂配制）、10 mmoL/L盐酸（HCL）、PH=8.2Tris-HCL、0.01mol/L Na2S2O3标准溶液、I2（A.R）、KI（A.R）、HAC（2mol/L）、淀粉指示剂（0.5%）、新鲜人血清、抗坏血酸粉末。
6.4维生素Ｃ含量测定
6.4.1维生素C溶液的制备
称取1.5g抗坏血酸粉末，加入新煮沸并冷却的蒸馏水使其溶解，定量转移至1000mL容量瓶中，定容，备用。
6.4.2标准溶液的配制与标定
c(I2)=0.1mol/L I2标准溶液的配置和标定
●c(I2)=0.1mol/L I2储备液的配置
将6.5g I2与10gKI置于研钵中，在通风橱中加入少量水研磨，待I2全部溶解后，将溶液转入棕色试剂瓶中，加水稀释至500mL，摇匀，放暗处保存。
6.5 茶多酚/维生素C氧自由基清除测试……………….9
6.6茶多酚/维生素C抑制血清脂蛋白氧化修饰试验....…...10
6.7 数据统计…………………………………...……...11
6.8比较………………………………………………..11
7.结果、计算及作图……………………………………….12
8.注意事项………………………………………………….14
2. 实验目的
2.1证明茶多酚(TP)、维生素C对氧自由基的清除作用以及不同浓度茶多酚、维生素C对氧自由基的清除率效应影响。
2.2证明茶多酚(TP)、维生素C对血清脂蛋白氧化修饰抑制作用以及不同浓度茶多酚、维生素C对血清脂蛋白氧化修饰抑制作用效应影响。
2.3茶多酚对氧自由基清除率、血清脂蛋白氧化修饰抑制作用与维生素C对氧自由基的清除率、血清脂蛋白氧化修饰抑制作用不同特点作对比。
3.实验原理
3.1茶多酚的测定原理
茶多酚是一类具有多酚羟基的物质，在一定条件下可与金属离子发生显色反应用于定量，酒石酸亚铁比色法（GB8313-2002）是测定茶多酚含量的国际标准方法。茶水浸出物中能与亚铁离子产生络合反应的酚性化合物，均称茶多酚。茶叶中多酚类物质能与亚铁离子形成紫蓝色络合物，该溶液对540nm可见光有最大吸收，故可用分光光度测定其吸光度，通过计算确定茶水中茶多酚的含量[9]。