多糖类药物的分析
多糖类药物提取方法及抗病毒活性分析
多糖类药物提取方法及抗病毒活性分析摘要：本文首先从动物多糖、植物多糖、微生物多糖、海藻多糖等方面阐述多糖类药物种类，并从抑制病毒吸附干扰病毒复制、增强免疫力刺激干扰素产生等方面分析多糖类药物抗病毒机理，然后阐述多糖类药物提取流程、提取方法、杂质去除、分离提纯等工序，最后从结构测定困难、作用机制复杂、天然多糖纯化困难等方面阐述多糖类药物抗病毒活性分析存在的问题。
关键词：多糖类药物；提取方法；抗病毒活性引言：多糖类是构成生命的四大基本物质之一，广泛存在于自然界各处，在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血、免疫促进等方面发挥着生物活性作用，因此多糖类药物开发一直是各大药厂的研究重点。
但是多糖类药物提取方法没有有效地去除其中的杂质，导致其组分的理化性质没有得到要求。
优化多糖类药物提取方法，提高其抗病毒活性，是药厂的必然选择。
一、多糖类药物种类及抗病毒机理（一）多糖类药物种类1.动物多糖动物多糖主要来自于动物结缔组织基质和细胞间质等脊椎动物组织胞外空间的特征组分，肝素、硫酸软骨素等药物便是动物多糖的代表，前者具有抗凝血、抑制疱疹病毒等作用，后者具有抑制人体免疫缺陷病毒的作用[1]。
2.植物多糖植物多糖主要来自于高等植物的根、茎、叶、皮、种子和花，中草药药理作用明显，上品中草药基本无毒副作用，中品中草药毒副作用较小，下品中草药毒副作用可以使用其他药物监制，中草药中植物多糖分布广泛。
其中黄芪多糖是植物多糖中的代表，该多糖类药物具有抑制乙肝血清标志物和抑制多株疱疹病毒的作用[2]。
3.微生物多糖微生物多糖主要来自于昆虫及甲壳动物的壳真菌、细菌的胞内胞外等，由于微生物具有培养容易的优点，一般来说微生物多糖主要从菌体或者培养液中提取。
微生物多糖提取后所蕴含的蛋白质和色素等杂质较少，因此药厂生产微生物多糖比较简单，其提取工艺适合大规模生产。
灵芝多糖是微生物多糖中的代表，在抗病毒和抗肿瘤等方面均可以起到重要效果[3]。
植物多糖的研究现状的研究报告
植物多糖的研究现状的研究报告植物多糖是从植物中提取的一种多糖，是一种有机大分子物质，具有高度的生物活性和药用价值。
近年来，植物多糖的研究受到了广泛的关注，也在国内外得到了广泛的应用。
植物多糖的种类很多，在不同的植物中含量和种类也会有所不同。
随着技术的不断发展，越来越多的植物多糖被发现和提取出来。
植物多糖在抗氧化、免疫调节、降血糖、抗癌等方面具有显著的药用效果，因此对植物多糖的研究和开发具有很大的意义。
目前，关于植物多糖的研究主要集中于以下几个方面：1.提取和纯化方法的改进植物多糖在植物中的含量通常很低，而杂质又很多，因此要提取出纯度高的植物多糖是一项技术难点。
目前，以超声波辅助提取、离子液体等为代表的新型提取技术正在逐步发展，可以有效提高多糖的提取率和纯度。
2.药用活性成分的研究植物多糖的药用效果主要与其分子结构、分子量、空间构象等有关。
因此，通过分析不同来源植物多糖的化学性质和生物功能，在深入研究其机制的基础上，努力筛选和开发具有高药用活性的植物多糖成分。
3.多糖药物的开发近年来，越来越多的植物多糖被用于研制药物，如多糖肽药物、多糖胶束等。
多糖药物具有良好的生物相容性、低毒性、高效性等优点，可望成为新型药物的重要领域。
总之，植物多糖的研究在不断深入，为我们了解植物多糖的药用价值、开发新药提供了新的思路和方法。
通过深化对植物多糖的研究，可以挖掘出更多的药用活性成分和制备更先进、更有效的多糖药物，为人类健康事业做出更大的贡献。
植物多糖的相关数据：1. 提取率和纯度：在以超声波法提取 Artemisia annua 中polysaccharide 的研究中，可以实现的最大提取率为26.71%，最高纯度为74.34%。
2. 含量：植物多糖的含量因植物种类和部位不同而异。
如在当归中，多糖含量为8.08%，而在灵芝中为1.96%-8.19%。
3. 药用效果：植物多糖具有很强的生物活性和药用效果，如提高免疫力、抗氧化、调节血糖、抗癌等。
糖 类 药 物
常见的交换剂为DEAE-纤维素
电泳、超滤法、亲和色谱、制备性高压液 相色谱、活性碳柱色谱
.
多糖的含量测定与结构分析
显色试剂一硫酸法
硫酸－蒽酮 （620nm） 苯酚－硫酸（490nm） 两种方法都是测总糖的，多糖被硫酸水解为单糖，然后单 糖在硫酸作用下脱水生成糠醛。 糠醛与蒽酮作用行测一 种蓝绿色的络合物，在620nm处有最大吸收。 糠醛与苯酚 作用形成橙黄色化合物，在490nm处有最大吸收。 二者的 颜色深浅与糖含量呈正相关。
.
生产工艺
在动物体内，肝素与蛋白质共价结合形成 肝素－蛋白复合物。
这种复合物无抗凝活性，随着蛋白质的去 除，其活性方能显示出来。
典型的粘多糖提取步骤
.
肝素钠的提取分离两大生产工艺
碱性热水或沸水来提取肝盐解法
使用蛋白水解酶使其断键解离 酶解法
DNS法
其利用S，5一二硝基水杨酸与多糖水解产物还原糖共热 后还原成棕红色氨基化合物，在540nm处有特征吸收。
.
高压电泳、纸色谱、薄层色谱、高效液相 色谱、旋光测定、凝胶色谱、高效凝胶渗 透色谱（HPGPC）等。
HPGPC测定多糖的纯度和分子量具有快速、 高分辨率和重现性好的优点，在国内外已得 到广泛应用。
.
多糖的提取
脱脂：动植物多糖及微生物细胞
内多糖的组织细胞多有脂质包围， 甲醇、1：1的乙醇乙醚混合溶液、 石油醚。
脱色：含色素较高的根、茎、叶、
果实类，需进行处理。
.
稀碱液提取法 难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液（胶类）
水提法 易溶于温水、难溶于冷水和乙醇
.
粘多糖提取
粘多糖与蛋白质结合于细胞中，
因此使糖-蛋白质间的结合键断裂，促使多 糖释放。方法有：
多糖类药物提取方法及抗病毒活性研究
多糖类药物提取方法及抗病毒活性研究一、多糖类药物提取方法多糖类药物主要来源于天然植物、真菌和微生物等，其提取方法通常包括以下几个方面：1. 搅拌法搅拌法是最常见的提取方法之一。
将植物、真菌或微生物粉碎成细小的颗粒，然后用适当的溶剂浸泡获得药物提取物。
这种方法操作简单、成本低廉，因而在实际生产中应用较为广泛。
2. 超声波法超声波法是利用超声波的机械振动使样品产生强大的超声波辐射，导致产生空化、涡流和高温高压等效应，从而加速溶剂渗透到样品内部，促进多糖的提取。
超声波法具有提取效率高、操作简便、易于控制温度和压力等优点，因而逐渐成为多糖类药物提取的热门技术。
3. 高温高压法高温高压法是通过以高温高压条件下，使溶剂渗透到样品内部，促进多糖的快速提取。
这种方法提取效率高、时间短，但需要特殊的设备和条件，操作相对较为复杂。
4. 超临界流体法超临界流体法是指在超临界状态下使用超临界流体（例如二氧化碳）进行提取。
这种方法提取效率高、不产生有害溶剂残留物，具有较好的环保性，因而备受关注。
二、多糖类药物的抗病毒活性研究多糖类药物在抗病毒领域的应用潜力已经引起了广泛的关注。
多糖类药物对于不同类型的病毒均具有一定的抑制作用，包括流感病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）等。
下面将对多糖类药物的抗病毒活性进行简要的介绍：1. 多糖类药物对流感病毒的抑制作用研究表明，多糖类药物对流感病毒具有一定的抗病毒活性。
来自真菌和植物的多糖类物质对流感病毒的复制和传播起到了抑制作用，有望成为新型流感病毒的治疗药物。
2. 多糖类药物对乙型肝炎病毒的抑制作用多糖类药物也显示出了对乙型肝炎病毒的抑制活性。
多糖类药物可通过干扰病毒入侵、抑制病毒复制等途径发挥其抗病毒作用，为乙型肝炎病毒的治疗提供了新的思路。
3. 多糖类药物对HIV的抑制作用HIV是世界范围内的重大公共卫生问题，而多糖类药物对HIV的抑制作用也备受关注。
有研究显示，来自微生物和植物的多糖类物质对HIV具有一定的抗病毒活性，可以有效抑制HIV的感染和复制。
多糖类药物的研究进展
・综 述・多糖类药物的研究进展冯 优1,2,王凤山1,2,张天民1,谭海宁1,2(山东大学1.国家糖工程技术研究中心,2.药学院,山东济南250012) 摘 要:此文综述了多糖的生物活性、制备方法及其在医药领域中应用的研究进展,并对多糖类药物的前景进行展望。
关键词:多糖;生物活性;抗癌;抗衰老;免疫调节 中图分类号:R285;T Q464.1 文献标识码:A 文章编号:100521678(2008)022*******R esearch advances of polysaccharide drugsFE NG Y ou 1,2,W ANG Feng 2shan 1,2,ZH ANG T ian 2min 1,T AN Hai 2ning 1,2(1.National G lycoengineering Research Center ,2.School o f Pharmacetical Sciences ,Shandong Univer sity ,Jinan 250012,China )收稿日期:2007210208作者简介:冯优(19842),女,山东泰安人,硕士研究生,从事多糖类药物研究;王凤山,通信作者,T el :0531288380288,E 2mail :fswang @ 。
多糖链是生命科学中除肽链、核苷酸链之外具有重大意义的第3种链状生物大分子,由于其结构的复杂性,它可能比肽链和核苷酸链含有更多的生物信息,对糖生物学的研究将成为揭示生命奥秘的第3个里程碑[1]。
近年来,人们不断发现糖类物质具有多样的生物功能,例如抗癌、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖等,并在生命现象中参与了细胞的多种活动,有些可作为或已经成为治疗疾病的药物。
本文对多糖类药物的研究进展进行综述。
1 多糖的生物活性研究多糖具有多种生物活性,与维持生物机能密切相关。
多糖可作为广谱的免疫促进剂,它不仅能激活巨噬细胞、T 细胞、B 细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞,还能促进细胞因子生成、活化补体,从而在抗肿瘤、抗病毒以及抗衰老等方面具有独特的功效。
高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量
高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量一、本文概述多糖作为一种重要的生物大分子，广泛存在于自然界中，具有多种生物活性，如免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等。
因此，对多糖的纯度及分子量的准确测定对于其研究和应用具有重要意义。
高效凝胶渗透色谱法（High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）是一种常用的多糖纯度及分子量测定方法，具有操作简便、分辨率高、重现性好等优点。
本文旨在介绍HPGPC法测定多糖纯度及分子量的原理、实验步骤、数据处理及注意事项，以期为多糖的研究和应用提供参考。
二、实验材料与方法1 多糖样品：选择待测定的多糖样品，确保其来源清晰，无杂质污染。
2 高效凝胶渗透色谱（HPGPC）柱：选择适当型号的HPGPC柱，以适用于待测多糖样品的分子量范围。
3 流动相：通常选用适当的溶剂或缓冲液作为流动相，以保证多糖样品在色谱柱上的良好分离。
4 检测器：使用示差折光检测器（RI）或紫外检测器（UV）等，以监测多糖样品在色谱柱上的分离情况。
5 其他试剂与仪器：包括样品制备所需的试剂、色谱仪、注射器、进样针等。
1 样品制备：将多糖样品溶解在适当的溶剂中，制备成一定浓度的溶液，以便进行后续分析。
2 色谱条件优化：通过预实验，优化色谱条件，包括流动相的选择、流速、柱温等，以获得最佳的分离效果。
3 进样与分离：将制备好的多糖样品溶液通过注射器注入HPGPC 仪中，通过色谱柱进行分离。
在分离过程中，利用检测器监测多糖样品的分离情况。
4 数据收集与处理：收集分离过程中的数据，利用相应软件对数据进行处理和分析，包括分子量计算、纯度分析等。
5 结果评价：根据分析结果，评价多糖样品的纯度及分子量分布情况，为后续研究提供依据。
通过以上实验材料与方法，可以高效地进行多糖纯度及分子量的测定，为后续多糖的结构研究、质量控制等提供重要支持。
三、实验结果与讨论在本研究中，我们采用了高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）对多糖样品的纯度和分子量进行了测定。
多糖类药用辅料的应用及其质量分析进展
海 藻敝 其 盐
从 褐藻 或 细 菌 中提 取 出 的 天 海藻 酸及其 盐具 有 与 多价 阳 离 子发 生 盐 酸环 丙沙 星 海藻 酸／ 壳 聚 糖双 层膜 然 多 糖 胶凝 反 成 凝胶 的 特 性
－
［
2
］
5 氟 尿 嘧啶 壳 聚 糖 ／果 胶 微 凝 胶 果 胶 从植物 细胞 壁 中 提取 的 非 淀 形成 凝胶 不 会被 胃 肠 道 消 化 液 消 化 纖性 多糖 可在 结肠 中 ■ 麵
．
Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄｓ
：
ｉ ｄｅ ｓ ｐ ｏ ｌｙ ｓ ａ ｃ ｃ ｈａｒ
；
ｐ
ｈ ａ ｒｍａ ｃ ｅｕ ｔｉ
ｃａ ｌ ｅｘ ｃｉ
ｐｉ ｅ ｎｔ ｓ ａｐ ｐ ｌ
；
ｉ
ｃａ ｔ ｉ ｏｎｓ
；
ｑ
ｕ ａｌ ｉ ｔ
ｙ
ａｎａ ｌ
ｙ
ｓ
ｉｓ
多 糖 是 由 糖 昔键 结 合 的 糖 链 至 少 要 超过
＾
－
从魔 芋 块 茎 中 提 取 的 天 然
，
［
4
］
’
、
、
、
，
［
5
］
酶酶解 环 合而得 贿 空 腔 賊 两雑 复 合物
，
壳 聚 糖 甲 壳 素 在 械性条 件 下 部 分或 碱性 多 糖 具有 良 好 的 生 物 相 容性 高 酸 胺酵 0 羧 甲 基 壳 聚 糖 纳 米 完全 去 乙 酷化 制 得 的 高 分子 电荷 密度 和 點 膜點附性粒 子 聚 阳 离子 多 糖 透 明 质 酸 高等 动 物 细 胞 外基质 优越 的 保 湿 性 能 良 好 的 透 皮 吸 收 促 Ａ ＤＡ ＭＴ Ｓ 5 抑 制 剂 透 明 质 酸凝胶
糖类药物
（二）多糖的纯化
（1）乙醇沉淀法
此法是制备粘多糖最常用的方法。供乙醇沉淀的多糖溶 液浓度以1%-2%为佳。同时向溶液中加入一定浓度（如5%） 可有助于多糖的析出。
（2）分级沉淀法
不同多糖在不同浓度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶解度不 同，因此可用不同浓度的有机溶剂分级沉淀分子大小不同的 粘多糖。 （3）季铵盐络合法（p388） 利用粘多糖与一些表面活性剂络合成难溶季铵盐。 （4）离子交换层析法 主要利用阴离子交换剂。
第三节 重要糖类药物生产工艺
一、D-甘露醇
（一）结构与性质 又名己六醇，为白色针状晶体，略有甜味，不潮解；易溶于 水。
（二）生产工艺
1、提取法 （1）工艺路线
（2）工艺过程 ①浸泡提取、碱化、中和 自来水室温浸泡2-3h，浸泡 液用30%NaOH调pH10-11，静置8h，凝集沉淀多糖类粘性 物；虹吸上清液，用1∶1 H2SO4中和至pH6-7，进一步除去 胶状物，得中性提取液。 ②浓缩、沉淀 浓缩中性提取液，除去NaCl和胶状物，直 到浓缩液含甘露糖30%以上，冷至60-70℃加入2倍体积95% 乙醇，搅拌均匀，冷至室温离心收集灰白色松散沉淀物。 ③精制 沉淀物悬于8倍体积95%乙醇中，搅拌回流半小 时，冷却过夜，离心得粗品甘露醇，含量70%-80%。重复 一次，经乙醇重结晶后，含量＞90%，氯化物含量＜0.5%。 重溶于蒸馏水中，加入1/8-1/10活性炭，80℃保温0.5h，滤 清。清液冷却至室温得结晶，抽滤，洗涤得精品甘露醇。 ④干燥、包装 结晶甘露醇于1 糖类药物
糖类药物主要有：
单糖 如葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和维生素C等； 低聚糖 如蔗糖、麦芽糖乳糖、乳果糖，多糖如右 旋糖苷、香菇多糖、茯苓多糖等； 糖的衍生物 如6-磷酸葡萄糖磷酸肌醇等。 糖类药物研究的最多的是多糖类药物，一般都是天 然动植物组织内直接提取，如黄芪多糖、人参多糖、 麦麸多糖、银耳多糖、灵芝多糖、云芝多糖、酵母多 糖、硫酸软骨素、透明质酸、几丁质、胎盘脂多糖等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
粘度法：用已知结构相似的多糖决定K值 （ η ＝ K M2），然后测出待测多糖的特 性粘数η ，计算待测多糖的分子量。
超离心法：根据测得的沉降系数计算多糖 的平均分子量。
20
高效液相色谱法测定分子量及分布
色谱条件： 凝胶柱（分子量大小），示差折光检测器。 标准曲线： 标准曲线：LogMW = a+b tR MW为重均分子量，tR为保留时间 待测多糖分子量（GPC专用软件）： 重均分子量 Mw=∑(RIiMi)/∑ RIi Mi为供试品在保留时间ti 时的分子量，RIi在第i部分中 被洗脱物质的量（重量）。
CH2OH O OH OH O
CH2OH O OH OH O
CH2OH 直链淀粉 O OH OH O
O OH
13
纤维素
14
多糖的理化性质
旋光性 硫酸蒽酮反应（620nm） 硫酸苯酚反应(490nm) 氨基己糖——乙酰丙酮(525nm) 糖醛酸——硫酸咔唑(520nm)
15
第二节 多糖的纯度测定
6
O- （N-）糖苷键型糖蛋白
O-糖苷键 N-糖苷键
7
磷酸乙醇胺残基
磷脂酰肌醇-聚糖的糖 蛋白
8
蛋白聚糖
软骨蛋白聚 糖:聚集体的分
子量非常大（大 约为2×108）， 其中含有透明质 酸、硫酸角质素、 硫酸软骨素、连 接蛋白、核心蛋 白和大量的寡糖 链。
9
多糖组成-单糖
吡喃 呋喃
六员环糖类似于吡喃，所以又称之为吡喃糖，而五员环糖
30
生色底物法原理－肝素、低分子肝素
当蛋白酶（FⅩa）从 生色底物分裂出pNA时， 发色物的产生量与剩余 的酶量成正比，与肝素 效价成反比。
405 nm测定。
31
生色底物
Bz：苯甲酰，Pip：哌啶酰， Tos：甲苯磺酰； 对-硝基苯胺（pNA）。 酰胺分解法（amidolytic method）。 当蛋白酶从生色底物分裂出 pNA时，发色物的产 生量与剩余的酶量成正比，与肝素效价成反比。 405 nm测定。 32
25
硫酸咔唑法测糖含量
硫酸咔唑法—己糖醛酸测定 在浓硫酸中，己糖醛酸与咔 唑溶液反应生成的反应物呈 红色。 520nm比色
26
硫酸苯酚法测定糖含量（总 糖）
原理：多糖在浓硫酸作 用下水解成单糖，该单 糖在强酸性条件下，与 苯酚反应生成橙色衍生 物。 它在490nm处有最大吸 收，其吸光度与浓度呈 线性关系。
39
（2）、部分酸水解、碱水解 选择温和的条件水解多糖，使糖链中某 种类型的键特异性地打断。
（3）、乙酰解 多糖经过乙酰解反应（醋酐、冰醋酸） 可生成乙酰化单糖和寡糖
40
（4）、甲醇解
多糖链在80－100℃条件下与无水甲醇反 应能将糖链变成组成单糖的甲基糖苷。 甲基糖苷能转化为三甲基硅醚衍生物或乙 酰基衍生物，进行气相色谱分析。
类似于呋喃，称之为呋喃糖。
环化单糖中氧化数最高的碳称为异头碳。在环式结构 中，异头碳是手性碳，所以环化的醛糖或酮糖可以呈现两 种异头构型中的一种，即-或-构型。
10
葡萄糖环状结构
11
椅式构象
β-D-葡萄糖
α-D-葡萄糖
12
直链淀粉是葡萄糖以α-1，4糖苷键结合成的链状化合物
CH2OH O O OH
27
蒽酮法测定糖含量（总糖）
原理：多糖在浓硫酸中 水解后，进一步脱水生 产糠醛类衍生物，与蒽 酮作用形成蓝色化合物， 620nm进行比色测定。
特点：10-100μg范围 内其颜色的深浅与糖含 量成正比。 灵敏度高。
28
生物测定法－肝素测定
美国药典采用羊血浆法。 即比较肝素标准品和供 试品延长血浆凝结时间 的作用来测定肝素的效 价。
常用的衍生物有： 三甲硅烷（TMS）衍生物 三氟乙酰（TEA）衍生物 乙酰（AC）衍生物 甲基（Me）衍生物
44
二、糖苷键连接方式的测定
红外光谱——糖苷键类型
确定吡喃糖糖苷键时，用红外光谱，在890cm-1 处有特征吸收者，示有β-型糖苷键，在840cm-1 处有特征吸收者，示有α-型糖苷键。
41
（5）、酶降解
分为外切糖苷酶和内切糖苷酶。 外切糖苷酶：切下多糖非还原末端的一个 单糖，并对单糖组成和糖苷键有专一性要 求。 内切糖苷酶可水解糖链内部的糖苷键，释 放多糖链片断以利于结构分析。
42
2、单糖的分离鉴定
气相色谱法
高效液相色谱法
气相色谱法与质谱分 析连用
43
气相色谱法
22
质谱法
质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间质 量与所带电荷比（m/z)的差异来分离并确定相对分子质量，是 目前测定相对分子质量最精确的方法。 电喷雾离子化（electro spray ionization，ESI）技术 基质辅助激光解析电离（matrix-assisted laser desorption ionization） 飞行时间质谱（time of flight mass spectrometry，TOFMS） 傅里叶变换质谱（fourier transform mass spectrometry， FTMS）
23
第四节、多糖的含量测定
比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、 硫酸苯酚法、蒽酮法） 生物测定法（肝素钠） 生色底物法（低分子量肝素钠） 高效液相法（硫酸软骨素）
24
乙酰丙酮法（elson-morgan）
——氨基己糖
原理： 氨基己糖在碱性条件下 加热，可与乙酰丙酮缩 合成吡咯衍生物，该衍 生物与对－二甲氨基苯 甲醛反应，反应物呈红 色，于 525nm 测定吸 收度。
34
色谱条件与系统适用性试验 用强阴离子交换硅胶为填充剂（如Hypersil SAX柱，250 mm 4.6 mm，5 μm），以水为流动相A，以2 mol/L氯化 钠溶液（为流动相B；流速1.0 ml/min，检测波长232 nm。组分流出顺 序为硫酸软骨素B、硫酸软骨素C和硫酸软骨素A，三者色谱峰的分离度 均应符合要求。 含量测定法 取待测品约0.1 g，精密称定后置10 ml容量瓶中加水溶解并 稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，精密量取100 μl，置具塞试管 中，加三羟甲基氨基甲烷缓冲液800 μl，充分混匀，再加入硫酸软骨素 ABC酶液100 μl，摇匀，置于37℃水浴中反应1 h，取出，100℃加热5 min，用冷水冷却。离心（10000 rpm）20 min后分取上清液，以0.45 μm滤膜滤过，精密量取20 μl注入色谱仪，记录色谱图。另取硫酸软骨 素钠对照品适量，精密称定，同法测定，按外标法以硫酸软骨素A、硫 酸软骨素B与硫酸软骨素C的峰面积之和计算，即得。
生色底物法
抗Xa因子活性测定
以溶液吸收度和浓度的 对数，照生物检定统计 法中量反应平行线测定 法计算出供试品的抗 Xa 因子活性
可 信 限 率 (FL%) 不 得 大于10%。
33
高效液相色谱法
糖类化合物一般缺乏特征的紫外吸收，为提高其在高 效液相色谱检测中的灵敏度，常常采用衍生的方法使 其成为具有紫外或荧光吸收的衍生物，再进行检测。 包括柱前衍生-HPLC 荧光标记-HPLC 柱后衍生-HPLC 直接HPLC和离子交换色谱法 如2015版《中国药典》中，采用离子交换色谱法对硫 酸软骨素进行含量测定，并以外标法计算待测样品含 量。
5
糖蛋白有三种主要类型
糖蛋白分为三种主要类型：O-糖苷键型糖蛋白、N-糖 苷键型糖蛋白和连有磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白。 在大多数的O-糖苷键型糖蛋白中，GalNAc残基通过O糖苷键与一个丝氨酸或苏氨酸残基连接形成，缩写为 GalNAc-Ser/Thr。 在N-糖苷键型糖蛋白中，GlcNAc残基通过N-糖苷键与 一个天冬酰胺残基相连，缩写为GlcNAc-Asn。
29
生物测定法——肝素测定方法
标准品稀释液的配制:精密量取标准品溶液，按高、中、 低剂量组（ ds1 、ds2、 ds3 ）用0.9%氯化钠溶液配成 三种浓度的稀释液，相邻两浓度的比值为1:0.7。 供试品稀释液的配制：按供试品的标示量或估计效价 （AT），照标准品溶液与稀释液的配制法配成高、中、 低（ dT1 、dT2、 dT3 ）三种浓度的稀释液。 各管凝结时间换算成对数，照生物检定统计法中的量反 应平行线测定法计算效价及实验误差。 可信限率（FL%）不得大于5%。
连接键构型
一种
一种
二肽与双糖
2个相同氨基酸连接形成的二肽仅1种
Ala
Ala
2个相同单糖连接形成的双糖有11种
Glc-Glc α型 β型 1-1连接 三种海藻糖 （α-α，α-β， β-β） 1-2连接 曲二糖 槐糖 1-3连接 黑曲二糖 昆布二糖 1-4连接 麦芽糖 纤维二糖 1-6连接 异麦芽糖 龙胆二糖
35
第五节、多糖类药物的结构分析
单糖组成 糖苷键连接方式 糖苷键连接位置
DNA 蛋白质
天然20种氨基酸
多糖
200多种单糖，常见20余种 每种单糖存在异构体 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-6糖苷键 存在α、β两种构型 36
基本单元
4种核苷酸
连接键
3’-5’磷酸二酯键
N-C肽键