凝集反应试验
实验一 凝集反应
1.间接凝集抑制试验
2.抗“O”试验
【原理】在受检血清标本中，加入溶血素“O”致敏的 胶乳试剂反应，如标本中含有高单位抗体，可出现清晰 而均匀的凝集颗粒。
试剂：ASO胶乳试剂、待检血清、双凹玻片、滴管、 生理盐水。
2.抗“O”试验
方法： （1）在右侧中加生理盐水1滴,在玻片左侧内加待检血清 1滴， （2）加溶血素“O”致敏胶乳1滴，混匀，再连续缓慢摇 动3min。观察结果。 结果：
实验室规则
一、爱护公物，节约使用实验材料。 二、进入实验室必须穿实验服，必要的文具应玻片等器材，应放在指定的地方。 四、实验完毕，应清理桌面，把用过的物品放回原处。 五、值日生负责整理清洁实验室，关好水、电、门、窗。 六、未经许可，不得将实验室内任何物品带出室外。
玻片、接种环、酒精灯。
NS+伤寒杆菌
诊断血清+伤寒杆菌
轻摇玻片1-2分钟，观察结果。
结果：对照侧——均匀混浊状；
试验侧——乳白色凝集块（阳性）； ——均匀混浊，不出现凝集（阴性）；
对照侧、试验侧均出现凝集，为自凝。
2.试管法凝集试验
【原理】用定量抗原悬液与一系列的待检血清混合，静 置后，根据每管内颗粒抗原凝集的程度，以判断待检血清 中有无相应抗体及其效价。
特异、敏感、快速、简便
抗原抗体反应的基本检测方法
根据抗原物的性质、出现结果的现象、参 加反应的成分不同，可将抗原抗体反应分为:
•凝集反应 •沉淀反应 •补体参与的反应 •免疫标记技术
实验一 凝集反应
（agglutination reaction)
颗粒性抗原(红细胞、细菌等)与相应抗体特 异结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物。
的结构互补性。
凝集反应实验原理和方法(直接凝集反应和间接凝集反应)(1)
凝集反应实验原理和方法（直接凝集反应和间接凝集反应）(1)凝集反应是指细菌、红细胞等颗粒性抗原或表面覆盖抗原的颗粒状物质与相应抗体特异结合，在适量电解质存在的条件下，形成肉眼可见的凝集现象。
一、直接凝集反应颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）直接与相应特异性抗体结合，在适量电解质存在条件下，出现肉眼可见的凝集现象，称直接凝集反应。
参加凝集反应的抗原称为凝集原，而抗体则称为凝集素。
直接凝集反应有玻片法和试管法两类。
（一）玻片凝集反应在玻片上进行的直接凝集反应,主要用于抗原的定性分析,数分钟之内便可观察结果,快速、简便。
常用于细菌的分型鉴定,也用于ABO血型的测定。
【实验材料】（ 1）抗原：受检菌液或受检者的血细胞盐水悬液。
（ 2）抗体：用于细菌鉴定的1：20稀释诊断血清。
血型检测的A及B诊断血清。
（ 3）生理盐水、玻片、吸管、接种环。
【实验方法】（ 1）于洁净玻片的一端加诊断血清1滴，另一端加生理盐水1滴作阴性对照。
（ 2）用接种环取待检菌液或血细胞悬液分别涂于诊断血清和生理盐水，混匀。
（ 3）轻摇玻片，静置数分钟，观察结果。
【结果分析】玻片上抗原凝集成肉眼可见的小团块状或絮状凝集物，其周围液体澄清，为阳性反应。
阴性反应和生理盐水对照均不发生凝集，为均匀混浊的乳状液。
【注意事项】细菌鉴定时，特别是肠道菌种的沙门菌属或志贺菌属，原则上先用多价诊断血清检测，如为阳性，再用单价诊断血清进行分群或定型。
血型测定时，室温需保持在 20oC左右，若低于10oC，易出现冷凝集现象而造成假阳性的错误诊断。
（二）试管凝集反应是用定量的颗粒性抗原悬液与一系列倍比稀释的待检血清在试管中进行的凝集反应，根据试验结果判定待检血清中有无相应抗体及其效价，对血清中抗体进行半定量分析。
此法目前仍常用于某些病原微生物感染的免疫学诊断，例如，诊断伤寒和副伤寒的肥达氏（ Widal test）反应，诊断斑疹伤寒的外—裴氏反应（weil-felix test）。
凝集试验名词解释微生物学
凝集试验名词解释微生物学
凝集试验是一种微生物学实验方法，用于检测特异性抗体或抗原的存在。
该试验基于抗体或抗原与相应微生物颗粒的凝集反应来检测是否存在特异性抗体或抗原。
凝集试验通常使用已知的特异性抗体或抗原标记物，如荧光抗体或酶标记物，与待测样品中的微生物进行反应。
如果存在特异性抗体或抗原，则会发生凝集反应，使微生物颗粒聚集在一起，可以通过显微镜观察到。
凝集试验广泛应用于微生物学研究和临床诊断中，例如用于检测细菌、病毒、真菌等微生物的抗体或抗原，帮助确定感染的原因和类型。
常见的凝集试验包括直接凝集试验、间接凝集试验和协同凝集试验等。
直接凝集试验是利用已知的特异性抗体与待测样品中的微生物直接反应，从而检测是否存在相应的微生物。
间接凝集试验是通过使用已知的特异性抗原标记物与待测样品中的相应抗体反应，从而检测是否存在特异性抗体。
协同凝集试验则是利用已知的特异性抗体与待测样品中的微生物结合，再加入相应的协同因子，使得微生物颗粒聚集在一起，从而检测是否存在相应的微生物。
需要注意的是，凝集试验结果仅能检测是否存在特异性抗体或抗原，不能确定微生物的种类、数量或活性状态。
因此，在微生物学研究和临床诊断中，通常需要结合其他实验方法进行综合分析。
实验三细胞凝集反应
2.间接凝集反应
将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无 关的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应 抗体（或抗原）作用。在有电介质存在的适宜条件 下，即可发生凝集，称为间接凝集反应。用做载体 的微球可用天然的微粒性物质，如人（O型）和动 物（绵羊、家兔等）的红细胞、活性炭颗粒或硅酸 铝颗粒等；也可用人工合成或天然高分子材料制成， 如聚苯乙烯胶乳微球等。由于载体颗粒增大了可溶 性抗原的反应面积，当颗粒上的抗原与微量抗体结 合后，就足以出现肉眼可见的反应，敏感性比直接 凝集反应高得多。
② 用1.5ml的离心管取血液1ml，2000rpm 离心5min，用移液器轻轻吸取上清去除； 加入1ml生理盐水清洗红细胞，2000rpm离 心5min，重复洗2—3次（注：从离心机内 拿出离心管时切勿震荡，不要倾倒离心管 倒上清，以免红细胞流出。清洗红细胞时 用移液器缓缓抽打，防止红细胞破裂）。
③ 在小试剂瓶中加入9.8ml生理盐水，用移 液器吸取200μl血红细胞加入小试剂瓶中， 混匀，即是2%的红细胞悬液，贴上标签备 用（注：吸取红细胞加入试剂瓶时可吸取 生理盐水清洗几次吸头，使得红细胞全部 在悬液中）。
凝集反应现象 用移液器吸取红细胞悬液，在三片载玻片 上各滴一滴，其中一片加一滴土豆凝集素， 一片再加一滴PBS缓冲液，充分混匀，另 外一片只有红细胞悬液做空白对照，盖上 盖玻片，待干后于显微镜下观察血细胞凝 集现象（注：红细胞悬液放置一段时间会 发生沉降，取用之前应当轻轻摇匀）。
鸡 血 红 细 胞 非 哺 乳 类
( )
凝血
图2 左图为红细胞未发生凝集，右图为加入土豆凝集 素红细胞发生凝集 如图左所示，显微镜下观察到红细胞是分散的；加 入土豆凝集素后红细胞就发生凝集，由于许多的红 细胞凝集，重叠一起使得颜色变得更深。
凝集试验
临床应用：
肥达试验 外斐试验 Wright test:布鲁菌病 交叉配血试验
二、间接凝集反应
间接凝集反应(indirect agglutination) 将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体表面， 然后与相应的抗体或抗原反应，在电解质的作 用下，出现肉眼可见的凝集现象
三、胶乳凝集试验
明胶凝集试验
将病毒抗原或重组抗原吸附于粉红色明胶颗粒 上，当致敏颗粒与样品血清作用时，若血清含 有抗病毒抗体则可形成肉眼可见的粉红色凝集
间接凝集反应的应用
抗原的检测 反向间接凝集试验可用于检测病原体的可溶性 抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。
抗体的检测 检测细菌、病毒、寄生虫等感染后产生的抗体。
抗球蛋白试验，又称Coombs试验，利用抗球 蛋白抗体作为第二抗体，连接与红细胞表面抗 原结合的特异性抗体，使红细胞凝集，是检测 标本不完全抗体的一种很有用的方法。
分为两种方法： 直接Coombs试验 间接Coombs试验
直接Coombs试验
检测标本中结合到红细胞表面的不完全 抗体
可分为玻片法定性试验和试管法半定量 试验
凝集试验
凝集反应
凝集反应是指颗粒性抗原（细菌、红细胞 或附着在载体上的可溶性抗原）与相应的抗体 在适量的电解质存在的条件下，经一定时间后 凝聚成肉眼可见的凝集物。参加反应的抗原称 为凝集原,抗体称为凝集素。
凝集反应是经典的血清学反应，使用历史悠久 并一直沿用至今。 1896年， Widal——诊断伤寒病； 1900年，Landsteriner——发现人类血型并于 1930年获得了诺贝尔奖金。
结果： RBC沉积孔底，集中于一圆点为阴性 RBC凝集，分布孔底周围，可根据凝集程度判 断阳性反应的强弱，以++为滴度终点
医学免疫学：实验2 凝集反应(ABO血型测定)
实验目的:
检测血清标本中有无HBsAb
材料:
48孔ELISA板
阳性对照血清（HBsAb） 阴性对照血清 酶标二抗
乙肝病毒表面抗体 诊断试剂盒
洗涤液
底物A和B
微量加样器，待测血清标本等
实验方法
微孔板已包被HBsAg
HBsAg
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
+ + — — ① ① ① ① ② ② ② ②A + + — — ③ ③ ③ ③ ④ ④ ④ ④B + + — — ⑤ ⑤ ⑤ ⑤ ⑥ ⑥ ⑥ ⑥C + + — — ⑦ ⑦ ⑦ ⑦ ⑧ ⑧ ⑧ ⑧D
实验结果
颜色变化或OD（吸光度）值
酶标板
酶标仪Βιβλιοθήκη 样+-1 2 3456
每孔加 50μl 不同的血清样本 Positive control (HBsAb) ：1 滴 Negative control (NS): 1 滴
加样
+
- sample
加酶结合物
enzyme
每孔加酶结合物1滴 混匀， 37 ℃ 30 min.
放射物标记技术 酶标技术
免疫荧光技术
酶联免疫吸附试验
酶免疫组化技术
双抗体夹心法
竞争法
双抗原夹心法
间接法
直接法
原理：间接ELISA法(酶联免疫吸附试验)
不显色
洗涤
洗涤
1.包被已知抗原 2.加入待测标本 （未知抗体？） 3.加入酶标二抗 （即抗抗体 ：抗人Ig的抗体） 4.加入底物
颜色改变 = 待测标本中存在抗体
实验结果
呈红色片状凝集颗粒为阳性 实验结束后，洗涤试管；
凝集反应(ABO血型的鉴定)
实验一凝集反应（ABO血型的鉴定）[实验目的]1．掌握凝集反应的原理，玻片法和试管法凝集实验的实验方法和结果分析。
2．了解凝集反应基本类型及血型鉴定的各种方法包括正、反定型，血型板鉴定法和血型卡鉴定法。
[实验原理]在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。
人类ABO血型抗原主要有A和B两种，根据红细胞表面这两种抗原的有无可把血型分为四种。
据此，将抗A和抗B抗体分别与待测红细胞混合，抗A或（和）抗B抗体与红细胞表面上的相应抗原结合而引起红细胞凝集，据其凝集情况便可判定出受试者的血型。
[实验器材]1．器材：光学学显微镜，消毒缸2．材料：消毒干棉球，一次性采血针，载玻片，玻璃试管，一次性带刻度朔料吸管，医用黄色垃圾袋3．试剂：75%医用酒精，0.9%NaCl注射液，抗血清试剂抗A、抗B[内容与方法](一)玻片法凝集实验1.用酒精棉签消毒被检者手指尖端，以采血针刺破皮肤，稍加挤压，使血液流出。
滴1至2滴血液于含有1ml生理盐水的试管内，摇匀，制成约0.5%血球悬液。
用干棉球止血。
2．取洁净载玻片1块，在中间用蜡笔画一条竖线，将抗A、B分型试剂分别加1滴于载玻片两端。
3. 用毛细吸管吸取血球悬液，在白瓷板的两个圆孔内各加一滴,并充分混匀，放置5－10分钟。
4.肉眼观察红细胞有无凝集发生。
如有凝集，可见红细胞凝集成块；无凝集，红细胞呈均匀分散。
若肉眼观察不明显，可在显微镜下观察是否存在微小凝集5.记录凝集情况，判定受检者的血型。
（二）试管法凝集实验1．用酒精棉签消毒被检者手指尖端，以采血针刺破皮肤，稍加挤压，使血液流出。
滴1至2滴血液于含有生理盐水的试管内，摇匀，制成约0.5%血球悬液。
用干棉球止血。
2．取洁净试管2支，分别标记上A、B字样，将抗A、B分型试剂分别加1滴于相应标记的试管中3．用一次性吸管吸取血球悬液，在2支标记试管中各加一滴,并充分混匀，放置5－10分钟。
免疫学实验-凝集试验
实验一凝集试验颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutination reaction)或凝集试验。
参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。
细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。
抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。
根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。
凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。
[目的要求]1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。
2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。
3. 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。
[材料与试剂]1. 玻板，载玻片，试管（1cm x 8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。
2. 灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。
3. 布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。
4. 鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。
[实验内容及操作方法]（一）试管凝集试验以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。
1. 试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。
如被检血清有多份，对照只需做1份。
2. 被检血清稀释：第1管加入2.3ml 0.5% 石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5 ml 0.5% 石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2 ml，加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取1.5 ml弃之，再吸取0.5 ml加入第2管中，混匀后吸取0.5 ml加入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5 ml（见表1-1）。
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电解质的存在
肉眼可见的凝集现象
凝集反应的发生分两阶段：
①抗原抗体的特异结合
②出现可见的颗粒凝集
凝集反应的类型
玻片凝集试验：ABO血型 直接凝集试验 试管凝集试验：外斐试验，肥达试验 正向间接凝集试验 反向间接凝集试验 间接凝集抑制试验 协同凝集试验 间接血凝试验 胶乳凝集试验 明胶凝集试验
第二章 抗原抗体反应
凝集反应
（agglutination）
是指颗粒性抗原，例如细菌、红细胞、
螺旋体、细胞性抗原，或可溶性抗原 （或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒 后，与相应的抗体（或抗原）在适量的 电解质存在的条件下，经一定时间后凝 聚成肉眼可见的凝集现象。
凝集反应的特点
颗粒性抗原 致敏颗粒 （可溶性抗原或抗体与载体颗粒结合）
实验结果
二、ABO血型鉴定结果： 1、A型血抗A试剂凝集为＋。 2、B型血抗B试剂凝集为＋。 3、O型血抗A、B试剂不凝集为－。 4、AB型血抗A、B试剂都凝集为＋。
三、RF测定结果
1、有凝集出现RF为阳性。
2、无凝集出现RF为阴性。
注意事项
1、加强无菌操作、安全防范意识。 2、如一次采血要求采集几个标本时，应按一 下顺序采血：血培养管、无抗凝剂及添加剂管， 凝血现象，有抗凝剂（添加剂）管。
玻片凝集法-ABO血型鉴定
试验目的
通过标准血清抗体鉴定红细胞上ABO 血型系统抗原，掌握盐水介质法进行 ABO血型系统正定型的基本操作方法和 结果判断。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
实验原理
根据IgM类特异性血型抗体与红细胞上
特异性抗原结合能够出现凝集反应的原 理，用已知IgM类特异性标准抗血清与 被检红细胞在盐水介质中反应（室温）， 若出现凝集想象，表明被检红细胞膜上 有与血型抗体相对应的抗原，从而判断 和鉴定被检者的血型。
3、在做配型试验时，如发现有不配合现象， 则取受检者血清，用已知A或B血型红细胞进行 反定型试验，以核实原鉴定的血型是否正确。 4、RF试验阴阳性对照经检测HbAg、HCV、 HIV为阴性，但仍须如病人样品一样小心处理。
思考题
凝集试验有哪些？可用于检测的原理是
什么？
间接反应的常见类型
– – – – – 间接凝集试验 间接血凝试验 胶乳凝集试验 明胶凝集试验 间接凝集反应的应用
1、（正向）间接凝集试验
2 反向间接凝集试验
3、间接凝集抑制试验
本次实验内容
一、第一次加强免疫
二、ABO血型鉴定
目的与要求
掌握凝集反应的原理与类型
掌握玻片凝集法操作与结果判断 熟悉ABO血型鉴定的原理与操作
实验材料与方法
试剂：抗A血清，抗B血清 材料：玻片，采血针，消毒干棉球，酒
精棉球等
实验方法与步骤
1、标记玻片：取玻片一张，一分为二，分别标记为
抗A，抗B。 2、采血：用酒精棉球消毒被检者左手无名指或中指 内侧，用采血针刺破皮肤，用干棉球擦去第一滴血， 稍加挤压，使其流出第二滴血，装入盐水试管，摇匀， 即成血细胞悬液。 3、加抗血清：滴加抗A，抗B血清于玻片标记处、 4、加RBC：在抗A，抗B血清中滴加RBC各一滴。 5、混匀：前后左右摇动，观察有无血细胞凝集出现。 6、结果：记录受检者红细胞凝集情况及血型鉴定结 果。
常用载体：
RBC
聚苯乙烯胶乳（polystyrene latex） 明胶颗粒 活性炭 皂土（bentonite） 火棉胶
间接凝集反应分类依据
根据致敏载体用的是抗原（正向）或抗
体（反向） 根据载体（RBC，胶乳，明胶） 根据凝集反应的方式（间接凝集试验， 间接凝集抑制试验，协同凝集试验）
与免疫无关大小适当的颗粒性载体的表 面，使之成为致敏载体颗粒，然后与相 应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解 质存在的条件下，出现特异性凝集现象， 称间接凝集反应（indirect agglutination） 或被动凝集反应（passive agglutination）。 其敏感度高于直接凝集反应和沉淀反应。
间接凝集试验
根据凝集反应中抗原的性质，反应的方
式分为： ①直接凝集反应 ②间接凝集反应
直接凝集反应（direct agglutination）
细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原， 在适当电解质参与下可直接与相应抗体 结合出现凝集，称为直接凝集反应。参 加反应的颗粒性抗原称为凝集原 （agglutinogen），抗体称为凝集素 （agglutinin） 。
ABO血型结果判断
抗B
+ + -
抗A
+ + -
血型
间接乳凝试验检测类风湿因子
间接凝集反应也称为被动凝集反应，是
将可溶性抗原或抗体吸附于载体颗粒表 面、再与相应的抗体或抗原结合，出现 凝集现象。间接乳凝试验检测类风湿因 子。 常用类风湿因子检测。
【操作方法】
1、轻轻混匀胶乳试剂 2、核对阴、阳性对照 3、在反应板孔中加1滴未稀释血清20ul 4、然后加1滴胶乳试剂在血清中（阴阳性对 照同此法） 5、轻轻摇动其充分混匀2分钟内观察结果。
玻片法：（定性） – 细菌鉴定 – ABO血型的鉴定 试管法： （半定量） – 肥达试验（Widal test）---伤寒 – 外斐试验（Weil-Felix test）---立克次体 – 交叉配血试验
间接凝集反应 （indirect agglutination）
将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联