醋酸菌分离及鉴定
藏灵菇发酵乳中醋酸菌的分离纯化与鉴定
藏灵菇发酵乳中醋酸菌的分离纯化与鉴定曹宜;刘芸;刘波;朱育菁;陈倩倩【摘要】One Acetobacter strain, FJAT-13797, was isolated from Tibetan kefir. The image under scanning electronic microscope showed that the bacterium was rod-shaped with round ends, and presented in single or pairs without spores. The strain showed the bio-chemical properties of Acetobacter spp. The 16S rDNA sequence analysis indicated that the strain, FJAT-13797, belonged to Acetobacter orientalis.%从藏灵菇中分离出醋酸菌株FJAT-13797,利用形态学观察、生理生化和16S rDNA方法对其进行细菌学鉴定,菌体形态为圆端直杆,单个或成对,无芽孢,其生理生化特征与醋杆菌属(Acetobacter)基本一致.经16S rDNA基因序列同源性比较和系统发育分析,菌株FJAT-13797鉴定为东方醋酸菌(Acetobacter orientalis).【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2012(027)012【总页数】4页(P1339-1342)【关键词】藏灵菇;鉴定;醋酸杆菌;东方醋酸菌【作者】曹宜;刘芸;刘波;朱育菁;陈倩倩【作者单位】福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003【正文语种】中文【中图分类】TS252藏灵菇是一种乳白色、胶质状的块状物（由微生物产生的胞外多糖与乳蛋白聚合而成），外形酷似米粒，上面栖息着多种微生物，长期在牛奶中培养，个体会增大很多，形状如盛开的雪莲，有人称之为“西藏雪莲”［1－3］。
传统广式米醋中醋酸菌的分离与鉴定
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醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。
醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。
醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。
黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。
醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。
醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。
醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。
本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。
2.2实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。
试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。
表2.2.1.a主要仪器设备Tab 2.2.1.a Main instrument equipment主要仪器型号厂家生化培养箱双目生物显微镜分析天平手提式不锈钢蒸汽灭菌锅超净工作台精密数字式酸度计PYX-250S-ABME（BA/E3）BS224SDSX-280BSW-CJ-1FDpHS-3C长沙科技科力仪器德国莱卡北京化丰上海南鹏上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。
2.2.2培养基[33-37]表2.2.1.ｂ培养基成分表Tab 2.2.1.ｂMedium composition名称葡萄糖酵母膏无水乙醇(v/v)琼脂CaCO3备注⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然⑸改进后的斜面液体保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5⑺Horyer-Frateur培养基3%pH自然⑻GYC培养基10%5%2% 2. 5%pH自然⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%⑾产5-酮基葡萄糖酸盐培养基3%1%2%2%pH自然⑿氧化乙酸培养基1% 1% 2% 乙酸钙1% pH7.2⒀氧化乳酸培养基1% 1% 2% 乳酸钙2% pH7.0-7.2⒁乙醇培养基1% 3% 2% pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。
醋酸菌菌种分离筛选方法
醋酸菌菌种分离筛选方法醋酸菌是一类常见于自然界中的微生物，主要分布于果酱、蜂蜜、果汁等酸性环境中。
醋酸菌能够利用酒精和氧气生成乙酸作为能量源，在食品加工、饮料发酵以及环境保护中具有重要的应用价值。
为了获得高效的醋酸菌菌种，需要进行菌种的分离筛选。
以下是醋酸菌菌种分离筛选方法的一般步骤：1.样品的收集与处理：从酸性环境中收集样品，如水果糖浆、果酱、蜂蜜等。
样品应保持新鲜，并避免污染。
如果样品是固体的，可以通过混合样品和生理盐水来制备悬浮液。
2.菌落计数：将悬浮液经过适当稀释，并均匀分布在含有固体培养基的琼脂平板上。
用细菌计数板或细胞计数器对菌落进行计数。
选取外形典型的菌落进行进一步的分离。
3.菌种分离：根据菌落形态、色素沉积、生理特性等进行分离。
选取外形典型的菌落，利用无菌环针在无菌琼脂平板上进行涂布。
4.筛选培养基的选择：醋酸菌是革兰氏阴性菌，最适生长温度一般在30-35°C范围内。
常用的筛选培养基包括葡萄糖琼脂葡萄糖琼脂（GAC）和醋酸葡萄糖琼脂（GAA）。
也可以根据菌种特性选择适宜的培养基进行筛选。
5.培养条件控制：将分离出的菌种接种在含有适宜营养物质的筛选培养基上，并控制培养条件。
包括温度、pH值、搅拌速度等。
优化培养条件可以提高菌种的产量和质量。
6.菌种纯化：逐步单菌分离并培养，目的是获得纯种菌株，确保菌株的纯度和稳定性。
7.菌种特性分析：对分离出的菌种进行鉴定和特性分析，包括形态学观察、生理特性鉴定、生化指标检测和分子生物学方法确定其种属和亲缘关系等。
总结：醋酸菌菌种的分离筛选是一个多步骤的过程，需要进行样品收集、菌落计数、菌种分离、筛选培养基的选择、培养条件控制、菌种纯化以及菌种的特性分析。
通过这些步骤的实施，可以获得高效的醋酸菌菌种，为醋酸菌的应用提供有力的支持。
杏皮渣醋酸发酵醋酸菌的分离筛选和鉴定
杏皮渣醋酸发酵醋酸菌的分离筛选和鉴定吴越;张富县;艾乃吐拉·马合木提;傅力【摘要】[目的]筛选获得适宜杏皮渣醋发酵的醋酸菌并对其进行鉴定,为杏皮渣醋质量及产量的提高奠定基础.[方法]在杏皮渣汁自然发酵液、固态发酵醋醅和杏园的土壤中分离醋酸菌,对分离菌株进行产酸曲线的测定及生理生化鉴定,对产酸量高的菌株进行16S rDNA序列测定并建立系统发育树,对其进行鉴定.[结果]共分离得到6株菌,其中Ac01、Ac02、Cp01、Cp02和Tr01属于醋酸菌属.初步判定,在杏皮渣汁的自然发酵液中分离的Ac01和Ac02可能属于醋化醋杆菌(Acetobacter aceti),菌株Ac02醋酸产量在分离菌株中最高,可达到3.04 g/100 mL,其16S rDNA序列与Acetobacter pomorum strain LMG 18848 16S rDNA序列相似度大于99％.[结论]在杏皮渣汁自然发酵液中分离得到的菌株Ac02为醋杆菌属(Acaobacter)的Acetobacter pomorum strain LMG 18848,是一株在杏皮渣醋生产中有应用潜力的醋酸菌.%[Objective] The aim of this study was to screen and identify the acetic acid bacteria strain for brewing vinegar from apricot dregs and lay the foundation for the improvement of the quality and yield of apricot dregs vinegar.[Method] The acetic acid bacteria were isolated from the natural fermentation broth of apricot dregs juice,the solid fermentative substrate of vinegar and the orchard soil,the curve of acid production was measured and the experiments of biochemical identification of each selected strain were conducted.The strains which could produce the highest acid were identified by 16S rDNA sequence and by the phylogenetic tree.[Result] Six strains wereisolated,Ac01,Ac02,Cp01,Cp02 and Tr01 were identified asAcetobacter.Ac01 and Ac02 separated from the natural fermentation broth of apricot dregs juice may belong to Acetobacter aceti after the preliminary determination,the acetic acid yield of the strain Ac02 can reach 3.04 g/100 mL.The similarity of 16S rDNA sequence is more than 99％between Ac02 and Acetobacter pomorum strain LMG 18848.[Conclusion] The strain Ac02 from the natural fermentation broth of apricot dregs juice was identified as Acetobacter pomorum strain LMG 18848.It is a potential application of acetic acid bacteria in brewing vinegar from apricot dregs.【期刊名称】《新疆农业科学》【年(卷),期】2013(050)007【总页数】7页(P1297-1303)【关键词】杏皮渣;醋酸菌;分离;16S rDNA;鉴定【作者】吴越;张富县;艾乃吐拉·马合木提;傅力【作者单位】新疆农业大学食品科学与药学学院,乌鲁木齐830052;新疆农业大学食品科学与药学学院,乌鲁木齐830052;新疆农业大学食品科学与药学学院,乌鲁木齐830052;韩山师范学院生物系,广东潮州521041【正文语种】中文【中图分类】S662.2;S188+.40 引言【研究意义】新疆是全国较大的浓缩杏浆生产基地，2011年新疆杏浓缩浆产量已达约4.53×104t。
山西老陈醋醋酸菌遗传学分类鉴定及生产性能的研究
山西老陈醋醋酸菌遗传学分类鉴定及生产性能的研究摘要本试验以山西省久负盛名的清徐老陈醋厂发酵正常、不同批次、不同发酵阶段的醋醅为研究对象。
采用溴甲酚紫作为指示剂通过变色圈法，从其中分离醋酸菌。
共挑选出了１０８个产生变色圈的单茵落，转接入试管斜面，经过反复纯化、革兰氏染色试验及产醋酸定性试验，最后得到了６０株醋酸菌。
经过对这６０株醋酸菌的茵体形态、固体平面培养特征、液体培养特征、生理特征、生化反应等生物学特性的试验研究，将它们初步鉴定为醋杆菌属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｏ，）的五个种，即巴氏醋杆菌（√．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕ曲、汉氏醋杆菌（Ａ．ｈａｎｓｅｎｉｉ）、醋化醋杆菌（Ａ．ａＣＣｆ力、恶臭醋杆菌（Ａ，ＴａｎＣｅｎ０和液化醋杆菌（Ａ，ｌｉｑｕｃｆａｃｉｅｎ曲。
ＤＮＡ的Ｇ＋Ｃｍ０１％的测定是分子遗传学分类法中常用的一种方法，它已成为细菌分类鉴定的基本方法，是细菌分类单位的特征之一。
本试验采用热变性温度（Ｙｍ）法，对分别代表上述５个种的５株醋酸菌（Ｆ２１、Ｆ¨、ｕ６、ｕ５、Ｕ８）进行了ＤＮＡ的Ｇ＋Ｃｍ０１％的测定，得到这５株菌的Ｇ＋Ｃｍ０１％４Ｒ舯Ｊ为：６４．１％、５５．４％、５７．５％、５９．２％、６１．２％。
最终可确定菌株Ｆ２１、Ｆ１１和Ｕ８为不同种，即分别为醋化醋杆菌（Ａ．８Ｃｅｔ０、液化醋杆菌（Ａ．１ｉｑｕｅ厂ａｃｉｅｎ曲和巴氏醋杆菌（Ａ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕ０；菌株ｕ５、ｕ６有可能为汉氏醋杆菌（』．ｈａｎｓｃｎｉＤ和恶臭醋杆菌（Ａ．ＴａｎＣｅＢ曲，或为二者的其中之一，需要进一步进行核酸分子杂交试验研究。
高产菌株的选育及其优良特性的发挥，对酿醋工业尤为关键，是提高食醋产量和品质的一个重要因素。
因此需要了解菌种的性能以达到控制其合适发育扣发酵条件的目的。
本试验通过对６０株醋酸茵进行多次筛选分离及产酸试验，得到了５株产酸能力强的优势菌株，其中最高产酸量达６．７８８９／１ＯＯｍｌ。
然后对这５株茵进行了生产性能指标的测定：产酸速度及酒精转酸率、耐乙醇能力和耐温度能力。
菠萝皮渣中醋酸菌的分离与筛选
摘要：以菠萝皮渣为样品，采用碳酸钙平板培养基分离，通过观察透明圈，革兰氏染色与产醋酸定性试验，筛选出2株优良醋酸菌。
对筛选得到的目的菌株进行产酸定性试验、细菌形态学观察、生理生化鉴定，结果表明为醋酸杆菌属，分别标记为B3和B4。
在32℃下以转速150r/min恒温振荡条件下培养并测定B3和B4产酸量和生长量，结果表明B3，B4在发酵84h时产醋酸量最高，分别为1.12g/L（p<0.05）和1.2g/L（p<0.01）。
对其生长量进行比色法测定，表明B3在培养16h（p<0.05）后进入生长稳定期，B4在培养19h（p<0.01）后进入稳定期。
关键词：菠萝皮渣；醋酸菌；分离；筛选中图分类号：TS264.22文献标志码：A doi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2020.11.005（College of Agriculture and Forestry，Longdong University，Qingyang，Gansu745000，China）Isolated acetic acid bacteria with CaCO3-plate in pineapple bran，comparing of the transparent circle，Granmstain and acid qualitative tests to screening2strains which had high acetic acied output.It was proved that the strains were acetic acid by the methods of bacterial morphological observation and biochemistry analysis.The propionic acid output and growth of screened strains marked B3and B4were cultured in32℃150r/min were up to1.12g/L and1.2g/L respectively after culture during of84h.The result of biomass determination indicated that B3and B4were up to stable growth period when the culture during was16h and19h respectively.pineapple residue；acetic acid bacteria；isolation；screen菠萝皮渣中醋酸菌的分离与筛选宋曦，汪慧，王应强，张亚亚（陇东学院农林科技学院，甘肃庆阳745000）收稿日期：2020-04-24基金项目：陇东学院青年科技创新项目（XYZK1509）。
醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。
醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。
醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。
黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。
醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。
醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。
醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。
本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。
2.2实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。
试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。
表2.2.1.a主要仪器设备Tab 2.2.1.a Main instrument equipment主要仪器型号厂家生化培养箱双目生物显微镜分析天平手提式不锈钢蒸汽灭菌锅超净工作台精密数字式酸度计PYX-250S-ABME（BA/E3）BS224SDSX-280BSW-CJ-1FDpHS-3C长沙科技科力仪器德国莱卡北京化丰上海南鹏上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。
2.2.2培养基[33-37]表2.2.1.ｂ培养基成分表Tab 2.2.1.ｂMedium composition名称葡萄糖酵母膏无水乙醇(v/v)琼脂CaCO3备注⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然⑸改进后的斜面液体保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5⑺Horyer-Frateur培养基3%pH自然⑻GYC培养基10%5%2% 2. 5%pH自然⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%⑾产5-酮基葡萄糖酸盐培养基3%1%2%2%pH自然⑿氧化乙酸培养基1% 1% 2% 乙酸钙1% pH7.2⒀氧化乳酸培养基1% 1% 2% 乳酸钙2% pH7.0-7.2⒁乙醇培养基1% 3% 2% pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。
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醋酸菌分离及鉴定
一、培养基
1、分离培养基（溴甲酚紫显色平板）:葡萄糖1%、酵母膏1%、无
水乙醇3%（体积分数）、0.04%溴甲酚紫5%（体积分数）、琼
脂1.8%、水100 mL，0.1 Mpa 灭菌20 min，无水乙醇在灭菌
后培养基温度降到75 ℃左右时加入。
2 、保藏培养基: 葡萄糖1%、酵母膏0.5%、琼脂2%、丙三醇2.5%
（体积分数）、水100 mL，121℃灭菌20 min 备用。
3、液体培养基:葡萄糖1%、酵母膏0.5%、丙三醇2.5%（体积分
数）、水100 mL，调节pH 至6.30，121 ℃灭菌20 min 备用。
二、醋酸菌分离纯化流程
样品→醋酸菌发酵液中富集培养→稀释分离→纯化→斜面试管
保藏→产醋酸定性测试。
三、步骤
1 、菌株分离
取1g 醋醅样品置入无菌试管，装入9 mL 无菌水，振荡均匀后得到10-1 的稀释液，之后10 倍梯度稀释直到10-6 稀释度。
取
10-2至10-6 稀释度的样品稀释液分别涂布溴甲酚紫显色平板，每个稀释度涂布2 个平板，每个平板涂布0.2 mL 的样品稀释液，涂布完成后30 ℃倒置培养48 h左右。
选取菌落数在30~50 个左右的平板，挑取该平板上的所有单菌落转入斜面保藏培养基中，
30 ℃培养24 h 左右后保存于4 ℃冰箱。
2 、菌株纯化将试管斜面中的菌株平板划线分离后再转接试管斜面，
4℃冰箱保存。
3、菌株归类以上述各菌株划线分离的平板为基准，将形成菌落极
其相似的菌株归为一大类。
4 、菌悬液的制备用接种环挑取新鲜培养的斜面菌株半环，溶于
装有200 μL 无菌超纯水的Eppendorf 管中，于试管振荡器上
混匀后得到菌悬液。
四、鉴定
1、菌株形态特征:镜下细胞呈短杆状,革兰阴性,无芽胞,单个或成
对、成链排列,个体大小为（0.5～0. 7)μm ×(1. 0～1. 5)μm。
2、培养特征:在葡萄糖、酵母膏、乙醇、CaCO3平板培养基上生
长旺盛,菌落圆形、油脂状,表面光滑、凸起,边缘整齐,培养2 d能
产酸,使CaCO3 溶解形成透明圈,继续培养将乙酸氧化分解产生
CO2 和水,菌落周围出现白色透明圈。
在斜面培养基上生长良好,
培养2 d后呈油脂状,并产酸。
在10% ( v / v)乙醇的培养基上、
Hoyer2Frateur培养液中、30%葡萄糖培养基上均不生长。
五、测试
1、产酸量的测定方法取1 mL 发酵液, 加入10 mL 蒸馏水, 3 滴～
5 滴0.02 %酚酞酒精溶液, 用标定的0.1 mol/L NaOH 溶液滴定
至浅粉色。
由所耗的NaOH 溶液的量来计算样品中的含酸量(以
醋酸计)。
产酸量( %) =( V- V0) ×CNaOH×0.06×100 %
式中：
V——发酵液样品滴定耗用的NaOH 量(mL);
V0——以空白培养基为对照滴定耗用的NaOH 量(mL); CNaOH——NaOH 标准溶液浓度(mol/L);
0.06——消耗1 mL 0.1mol/L NaOH 溶液相当于乙酸的质量( g) ; 100 %——转化为百分含量的系数。
六、有关背景
1、传统法酿醋过程中熏醋醅料固态发酵大致上可分为3 个阶段:
第1 阶段是第1 ～ 10 天主要为酒化、糖化阶段;
第2 阶段为醋酸发酵阶段( 第10 ～ 23天) ；
第3 阶段是第23 ～ 28 天主要为传统酿醋过程中熏醋的后熟
阶段。
后熟阶段由于酸的大量积累，大部分微生物在此阶段被
严重抑制，甚至死亡，此时醋酸菌在物料中占绝对优势，物料
中的酒精此时也消耗殆尽，酒化、醋化、糖化作用都基本停止，但各种风味物质酸、醇、酮、酚、酯、醛以及它们的复合物等
的转化还在缓慢地进行。
2、对于醋品的生产而言，不仅需要产酸能力极强的醋酸菌，也需
要产酸及产香的芽孢杆菌以及一些其它的微生物，这也是各地出品的醋口感与香味不一的重要原因。
但是，因为选用的分离
培养基主要适用于产酸菌的分离，因而所分离出的菌株只是醋醅中微生物的一小部分。
通常环境中可培养的细菌不到细菌总
数的1%。
而对于难以培养的细菌及一些需要特殊培养基的细菌，
可以采用免培养法。
3、醅料中的微生物前期以霉菌为主，中后期以酵母菌和细菌为主。