实验三、四病原菌的分离和(一)鉴定
农业植物病理学实验指导
农业植物病理学实验指导农业植物病理学是农业生产中极为重要的学科之一，其研究的是农作物疾病的发生与预防。
为了更好地培养学生的病理实验操作能力，本文将提供一份简单的农业植物病理学实验指导。
1. 实验一：植物病原菌的分离和鉴定实验目的：掌握分离与鉴定植物病原菌的方法，理解病原学的基础概念。
实验原料：感染有病征的植株、消毒剂、无菌玻璃棒、琼脂、静置培养皿、荧光显微镜。
实验步骤：1. 从感染病株中取样。
用无菌玻璃棒在感染病株的表面轻刮几次，然后在无菌培养基上划一条线。
2. 将无菌玻璃棒沾上感染样品，并将其划到无菌培养基上，将其密封，将其放入37℃的温室中培养3-5天。
3. 检查接种坛中的细菌单个斑点，清除任何后来发现的杂细菌，然后进行细菌鉴定，以识别不同的菌株。
使用荧光显微镜和其他实验技术来确定不同的菌株。
实验结果：1. 获得了可研究的植物病原菌。
2. 学生理解了病原学的概念和关键技术。
2. 实验二：植物病害综合鉴定实验目的：应用综合鉴定法确认植物病害。
实验原料：受感染的植物样品，显微镜、手镰、组织切片、滴定管、生长瓶、测试器。
实验步骤：1. 阐述农业病害发生的原因和病害的分类。
培养出病原菌后，学生将初步考虑在何种植物病害范围内进行综合鉴定。
2. 制备切片，利用显微镜查看组织细胞的变化，以确定该病是有效的。
3. 测试样品以确保它是含有特征性病原体的。
除了使用显微镜查看组织切片外，还可以使用滴定管和生长瓶来测试样品的pH、氧含量、有机成分等信息。
4. 将所有数据纳入综合考虑，从而确定植物病害的类型、发展和所需的病虫害防治措施。
实验结果：1. 确定了植物病害的类型和发展。
2. 学生掌握了植物病害检测的重要步骤。
3. 实验三：生物防治法实验目的：为学生提供基本原则和技术，了解生物防治如何减少植物病虫害的损失。
实验原料：扁豆种子、法国圆白菜的幼苗、甜菜虫、灰蝉、昆虫脂肪。
实验步骤：1. 学生准备研究模型—扁豆或法国圆白菜幼苗，然后在其中一部分植物上覆盖甜菜虫或灰蝉，让它们大肆繁殖和吃掉幼苗。
肺炎的实验报告
一、实验目的1. 探讨肺炎的病原学特点。
2. 评估肺炎患者对常用抗生素的敏感性。
3. 为临床治疗肺炎提供科学依据。
二、实验材料1. 实验组：肺炎患者痰液样本（n=30）。
2. 对照组：健康志愿者痰液样本（n=10）。
3. 实验试剂：肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等病原菌的冻干菌种；抗生素纸片（氨苄西林、头孢噻肟、阿莫西林、左氧氟沙星等）。
4. 实验仪器：细菌培养箱、显微镜、细菌培养皿、酒精灯、无菌操作台等。
三、实验方法1. 样本采集：对肺炎患者和健康志愿者进行痰液采集，严格无菌操作。
2. 细菌培养：将痰液样本接种于血琼脂平板和巧克力琼脂平板，37℃培养24小时。
3. 病原菌鉴定：观察菌落特征，挑取典型菌落进行革兰染色，显微镜观察。
4. 抗生素敏感性试验：将病原菌接种于含有抗生素纸片的琼脂平板上，37℃培养24小时，观察抑菌圈大小。
5. 数据分析：采用SPSS 22.0软件对实验数据进行分析。
四、实验结果1. 病原菌鉴定：肺炎患者痰液中分离出肺炎克雷伯菌（n=12）、铜绿假单胞菌（n=8）、金黄色葡萄球菌（n=5）、肺炎链球菌（n=5）；健康志愿者痰液中未分离出病原菌。
2. 抗生素敏感性试验结果：- 肺炎克雷伯菌：氨苄西林（敏感）、头孢噻肟（耐药）、阿莫西林（耐药）、左氧氟沙星（敏感）。
- 铜绿假单胞菌：氨苄西林（耐药）、头孢噻肟（耐药）、阿莫西林（耐药）、左氧氟沙星（敏感）。
- 金黄色葡萄球菌：氨苄西林（耐药）、头孢噻肟（耐药）、阿莫西林（耐药）、左氧氟沙星（耐药）。
- 肺炎链球菌：氨苄西林（耐药）、头孢噻肟（敏感）、阿莫西林（耐药）、左氧氟沙星（耐药）。
五、讨论1. 肺炎病原菌的多样性：本实验结果显示，肺炎患者痰液中分离出的病原菌种类较多，包括肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌等。
这提示临床在治疗肺炎时应综合考虑多种病原菌，避免单一用药。
2. 抗生素敏感性差异：肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌对氨苄西林和阿莫西林耐药，而对左氧氟沙星敏感。
病原菌分离培养与鉴定
细 菌 专性厌氧菌
纯
培
养 兼性厌氧菌 物
鉴 定
的
鉴
需氧菌
定
形态和染色 菌落特征 生化试验 药物敏感试验 毒力试验 病原菌抗原 生物芯片检测
（四）生物芯片技术
将核酸片段、蛋白质或酶、抗原或抗体、细胞及组织 等生物样品有序地固定于硅片、尼龙膜等固相支持物上 在一定的条件下进行生化反应。 用化学荧光法、酶标法或同位素法显示反应结果， 通过特定的仪器读取与收集数据，并用软件进行数据 分析，从而判断样品中靶分子的种类和数量。
1929 – Penicillin discovered
1930s– Sulfa drugs discovered
1969 – US surgeon Gen, claims end infectious diseases
Today – Bacteria with multi-drug resistance
Fleming Domagk
一、抗菌药物的杀菌机制
• 抑制细菌细胞壁的合成：青霉素、溶菌酶等 • 影响细菌胞浆膜通透性：多粘菌素等抗生素 • 抑制细菌蛋白质的合成：红霉素、链霉素等 • 抑制细菌的核酸代谢：利福平等抗生素 • 抑制细菌的叶酸代谢：磺胺类等抗生素
Cell wall synthesis
collection and transportation of specimen
避免杂菌污染
标本的采集和送检六原则
不同期不同标本 用抗生素以前
采集病变明显部位
标本必须新鲜
运送注意保存
细菌感
（二）病原菌分离培养与鉴定：形态学检查
不染色检查法 压滴法 悬滴法 暗视野显微镜法
检查用仪器 普通光学显微镜 light microscope 暗视野显微镜 dark-field microscope 荧光显微镜 fluorescence microscope ……
实验四病原性球菌的检验
1、标本采集：脓液
2、检验程序：
脓液
↓
↓
直接涂片
分离培养
革兰染色镜检 （操作）（血琼脂平板）
↓
↓ 37℃ 18～24h
初报 挑取可疑菌落（性状、色素、溶血）
↓
鉴定试验及药敏试验
↓
↓
↓
↓
革兰染色镜检 生化反应鉴定 其他鉴定 药敏试验
↓
↓
↓
↓
↓37℃ 18～24h
报告
三、葡萄球菌属生物化学反应：
（一）触酶试验（操作）
规定时间内出现清晰凝集者为阳性，不出现凝集 者为阴性。
主要用于风湿热的辅助诊断：
风湿热患者ASO大多在250单位；
活动性风湿热患者ASO一般≥400单位。
『实验报告』
绘出化脓性球菌镜下形态图。 记录脓液标本的分离培养与鉴定程序。
实验四 病原性球菌的检验
病原性球菌，又称化脓性球菌，根据革 兰染色性的不同，分为两类： G＋球菌： 葡萄球菌、链球菌、肺炎链 球菌等。 G- 球菌： 脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌 等。
『目的要求』
掌握：葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、脑膜 炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌的形态及染色特点；葡 萄球菌、链球菌的菌落特点及链球菌在血琼脂 平板上的溶血性；血浆凝固酶试验、触酶试验 的试验方法、结果及意义。
四、抗链球菌溶血素“O”的测定（乳胶法，示教）
1、原理：ASO高滴度的血清被适量溶血素“O”中 和后，失去了正常水平量的抗体，多余的抗“O” 抗体与ASO乳胶试剂反应，出现肉眼可见的，清 晰均匀的凝集颗粒（ASO乳胶试剂系羧化聚苯乙 烯乳胶与溶血素“O”共价交联的产物）。
2、方法：（略）3、结Fra bibliotek及意义：1、原理：
本科生实验讲解
作业： 1.描述采集标本的症状特点 2.绘图：分离纯化病原菌的形态特征 3.分析孢子分离法和组织分离法的优缺点。
实验四
病原真菌的培养性状 及生长量的测定
植物病害方面，培养真菌的目的主要是观察它 的性状和研究环境条件对它的影响，或者是大量繁 殖后用于接种或其他试验。
真菌生长量的测定主要有（ 1）目力估测；（ 2） 直线生长 ： 测定菌落的半径或直径或者计算菌落 面积； （3）湿重测定：振荡培养后测定菌丝的重量； （4）干重测定：菌丝烘干后测重。
锅菌灭压高动自全
锅菌灭压高动自全
分离工作应 在无菌条件 下进行，无 菌室和超净 工作台是分 离不可缺少 的设施。
2. 组织分离法： 这种方法适用于大部分病菌的分离，以番茄
叶霉病、灰霉病为试材进行： （1）取番茄叶霉病病叶，先用无菌水冲洗干
净。 （2）在病、健交界处剪取 2～3毫米长的病
组织，在70%的酒精中浸 2～3秒种。
亚甲蓝染色法 制备涂片标本 →染色
涂片
干燥
固定
水洗、吸干
镜检
染色1min
2.革兰氏染色法（ Gram Stain ）
原理: 第一步：结晶紫使菌体着上紫色 第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细
胞壁阻留在细胞内。 第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的
反应。 G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇 脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫 -碘复合物被 阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结 构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫 -碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄 复染后呈红色。
医学微生物学实验三
• 盖上平板的盖子，做好标记，放置培养箱内孵育16~18h。
• 下次实验课找到自己的药敏结果，量取抑菌环直径，根据 CLSI（clinical and laboratory standards institute ）标准， 报告细菌对该抗生素敏感(susceptible,S)、耐药(resistant,R) 、中介(intermediate,I)。
MIC：在与微生物生长速率有关的特定时间 间隔内，通常是18－24小时，能够抑制被测菌生 长的最低药物浓度。
抑菌环
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ药物效果越好，抑菌环直径越大；效果越差，抑菌环直径越小。
操作方法
• 无菌挑取孵育16～24h的血平板上4个菌落,沿4个方向均匀抹 无菌M-H琼脂表面，使菌液均匀分布，最后再取一个菌落沿 平板内缘环形涂抹均匀。
直接
涂片镜检 （革兰染色）
接种 血琼脂平板
菌落观察
血浆凝固酶试验
革兰染色
药敏试验 诊断报告
一、脓汁标本中化脓性球菌的鉴定
直接涂片镜检
• 取标本直接涂片，均匀涂成菌膜，自然干 燥，固定后革兰染色，油镜观察。
金黄色葡萄球菌
革兰染色镜检
─────────
形态
排列 染色性
乙型溶血性链球菌
细菌分离培养
• 取一号和二号脓标本，分别接种于血琼脂 平板上，划线分离，37℃培养18~24h后， 观察菌落特征，取单个菌落进行再次革兰 染色镜检。
– 保护病菌不受血清中杀菌物质的破坏 – 抵抗吞噬细胞的吞噬和消化 – 使感染局限化和形成血栓
游离血浆凝固酶
实验三 病原菌的分离培养
注：试管加棉塞(最好)
培养基分装完毕以后，在管口
上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。
加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内，如下图所示。
（五）病原真菌的分离培养
1．组织分离法 按照以下步骤进行：
(1) 取灭菌培养皿一个，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料 和分离人的姓名。 提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将 所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌； 保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要 用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸 要轻，不要说话。 (2) 取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个 病斑，用解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块(边长3--4mm)病 组织数块。 提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌 混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋 生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。
4. 在空试管内倒入2～3mL已经溶解好的培养基，
【注意尽量不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶
塞. 5.放入烧杯中,高压蒸汽灭菌. 6.摆斜面,凝固后放冰箱备用.
用于活化菌种， 或培养菌种的斜面
用于保存菌种的斜面
搁置斜面
当培养基冷却至50℃左右时，将试管带棉塞的一
端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的 斜面的长度不超过试管总长的一半。
（二）灭菌与消毒
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培 养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。 常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压 蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌超高温灭菌、过滤除菌、辐源自射灭菌、化学药品灭菌等方法。
病原微生物实训实验报告
一、实验目的1. 熟悉病原微生物的基本概念和分类。
2. 掌握病原微生物的分离、培养和鉴定方法。
3. 培养无菌操作技能，提高实验室生物安全意识。
4. 学习病原微生物与人类健康的关系，增强防护意识。
二、实验原理病原微生物是指能引起人类、动物和植物疾病的微生物。
本实验通过病原微生物的分离、培养和鉴定，了解病原微生物的基本特征，为疾病诊断和治疗提供依据。
三、实验材料1. 实验器材：显微镜、接种环、培养皿、移液器、酒精灯、无菌棉签等。
2. 实验试剂：生理盐水、营养肉汤、营养琼脂、血琼脂、革兰染色液、芽孢染色液等。
3. 实验样本：粪便、尿液、痰液等。
四、实验步骤1. 病原微生物的分离（1）将实验样本分别接种于营养肉汤和营养琼脂平板。
（2）将接种好的平板置于37℃恒温培养箱中培养24小时。
（3）观察培养结果，挑选可疑菌落进行进一步鉴定。
2. 病原微生物的培养（1）将可疑菌落接种于营养肉汤中。
（2）将接种好的肉汤置于37℃恒温培养箱中培养24小时。
（3）观察肉汤的变化，如浑浊、沉淀等。
3. 病原微生物的鉴定（1）革兰染色：取一小段肉汤培养物，滴加革兰染色液，观察菌体染色结果。
（2）芽孢染色：取一小段肉汤培养物，滴加芽孢染色液，观察菌体染色结果。
（3）生化试验：根据革兰染色和芽孢染色结果，选择相应的生化试剂进行试验，观察菌落的反应。
五、实验结果与分析1. 病原微生物的分离实验结果显示，在粪便样本中分离出革兰阳性菌和革兰阴性菌。
2. 病原微生物的培养在37℃恒温培养箱中，革兰阳性菌和革兰阴性菌均呈现浑浊现象。
3. 病原微生物的鉴定（1）革兰染色：革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红色。
（2）芽孢染色：革兰阳性菌芽孢呈无色或淡紫色，革兰阴性菌无芽孢。
（3）生化试验：根据革兰染色和芽孢染色结果，进行生化试验，结果显示革兰阳性菌为葡萄球菌，革兰阴性菌为大肠杆菌。
六、实验讨论1. 病原微生物的分离和培养是病原微生物学实验的基础，通过实验可以了解病原微生物的基本特征，为疾病诊断和治疗提供依据。