影响内毒素G试验结果的常见因素
影响细菌内毒素检查结果可靠性的因素及克服方法
影响细菌内毒素检查结果可靠性的因素及克服方法华W西C药J学'杂P志S2加2,I7(11/:79～}}0n^J,l,l:一影响细菌内毒素检查结果可靠性的因素及克服方法王明清四川省广元市人民医院.四川广元628000摘要:目的探讨影响细菌内毒素检查法的因素及克服方法:方法查阅文献,结合实践和实验进行阐述.结果标准品,灵敏度,器具处理后的放置时间及操作环境,条件等均对内毒素检查结果有影响.结论克服以上因素可使内毒素检查法结果更加准确,可靠.关键词:细菌内毒素;影响因素;克服方法中圈分类号:R927.12文献标识码:B文章编号:1006—0103c2oo21ol一0079—02 细菌内毒素检查法仍被2000年版中国药典继续收载,并比1995年版规定更细,要求更高.我们在实际工作中发现,当具体执行时,仍存在不少值得研究和探讨的问题-,这些问题均可影响细菌内毒素检查法结果的可靠性.1细菌内毒素工作标准品对鲎试剂灵敏度的影响细菌内毒素标准品有两种,一种为细菌内毒素国家标准品,用于标定生产厂家生产的细菌内毒素及仲裁鲎试剂的灵敏度;另一种为厂家生产的细菌内毒素工作标准品,用于标定鲎试剂的灵敏度及试验中的阳性对照.可见内毒素工作标准品的质量,直接影响鲎试剂的灵敏度.1.1实验材料和方法鲎试剂(厦门,灵敏度标示值0.5EU?ml～,每支0.1ml,批号:951220);细菌内毒素工作标准品(每支10EU,批号:950101)及超纯水.鲎试剂(福州,灵敏度标示值0.5EU?rrd～,每支01rrd,批号: 960114);细菌内毒素工作标准品(每支5EL",批号: 950913)及超纯水.其它材料按药典实验要求进行灵敏度复核用各地生产的内毒素工作标准品对其鲎试剂的灵敏度进行复核,均符合标示值.当以厦门产细菌内毒素工作标准品复核福州产鲎试剂灵敏度时,其灵敏度有所提高;当以福州产细菌内毒素复核厦门鲎试剂灵敏度时,则灵敏度有所降低,复核时.仍存在差异.蔡红等报道.也证实这一点.这种现象的发生,是鲎试剂的质量问题,还是内毒素工作标准品的质量问题,因无国家标准品仲裁,故无法定论,但作者简介:王明清.男.副主任药师,从事医院药学工作应引起重视.在实际工作中,则建议使用某厂生产的鲎试剂,就用该厂供给的内毒素工作标准品或国家标准品来标定鲎试剂灵敏度,标示值与实测值符合规定,则可用于细菌内毒素的检测,使结果正确可靠.最好避免此厂产内毒素标准品复核彼厂产鲎试剂的灵敏度或用于样品内毒素的检测1.2鲎试剂灵敏度的选择厦复核正确选择灵敏度是保证鲎法检测内毒素结果可靠性的依据.热原大多数是微生物的内毒素,其检查方法仅为限量检查.而药品因其剂型,用量不同而热原限量亦不同,如果选用的鲎试剂灵敏度低于药品内毒素限量,则出现假阴性,若高于药品内毒素限量的灵敏度,则出现假阳性,均达不到检测热原以保证药品质量的目的.所以必须确定药品的细菌内毒素限值.根据确定的药品细菌内毒素限值而选择鲎试剂的灵敏度.鲎试剂是一种生物制品,使用前必须对购回的鲎试剂按中国药典2000年版规定对其灵敏度进行复核,当复核结果符合规定时方可用于细菌内毒素检查.试验前应按药典规定作"供试品干扰试验",否则其结果可疑.2供试品调pH值在细菌内毒素检查法中,对供试品DH的调试各国药典要求不同,美国药典和英国药典均规定pH6～8,而中国药典对此未作具体规定,高国政等则认为pH的调节很有必要.因大输液所含成分对鲎法无干扰,可以不调DH,同时鲎试剂本身具有一定的缓冲能力.但除大输液以外的品种,应进行多次调与不调pH的平行对比试验及多个试验室的复试方可定论80华西药学杂志第l7卷3器具的处理及放置时间试验所用器具必须无热原化处理,2000年版药典已明确规定.工作中曾出现过同一品种使用,经无热原化处理放置24h后的器具作热原试验,出现阳性结果;复核时,器具除热原后放置12h后用于细菌内毒素检查,结果阴性故器具除热原后放置12h应立即使用,最好不超过24h.4严格控制细菌内毒素检查法的操作环境,条件和时间在中国药典2000年版二部细菌内毒素检查中,未规定在37±1℃保温60±2min前的操作环境,操作时间和室内温度,笔者认为这是药典不够完善的地方.为此,作了如下实验.鲎试剂(福州0.5EU?ml～,每支0.1ml,批号: 960503);细菌内毒素工作标准品(每支10EU,批号: 960326)及细菌内毒素检查用水(批号:960109,每支2m1).实验过程中,室内温度分别为l5℃,23℃,28℃, 30℃,32℃.操作时间分别为10,20,30min.内毒素工作标准的浓度分别为1,0.5,0.25,0.125EU? ml.于37±l℃保温60±2min,观察发现,在室温28℃以上时,随着操作时间的延长,鲎试剂的灵敏度有所提高.工作中曾出现过因放置室温不同,实验时间不同而出现假阳性的结果;复试时,室温降低, 操作时间缩短则结果阴性;临床验证,无热原反应. 因此,整个细菌内毒素检查,从溶解,稀释,混合到放人水浴保温及结果判定的总时间控制在室温28℃及以上时,不超过80rain;室温在28℃及以下时,不超过90n即保温前操作时间为28℃及以上时20min;28℃以下时30min.参考文献I郭录平浅谈影响鲎试验的因素[J:中国药学杂志1996,319 (3):1872蔡红,王豫蓉.粱平鲎试剂灵敏度对细菌内毒素限量硷查的影响初探J]中国医院药学杂志.1998.I8(2】:853高国政,颤锦值影响鲥苗内毒素测定的实验研究[』:中国药学杂志,1998.33(3):162收藕日期:200012(上接第78页)1.2.3碱液中的硫酸沙丁胺醇片的含量测定精密量取"1.2.2"项下的续滤液3ml置250ml量瓶中,加0.01mol?L氢氧化钠液稀释至刻度,摇匀,照分光光度法在244/lilt波长处测定吸光度,以沙丁胺醇的吸收系数为506计算,并将测定的结果乘以1.2049,即得(表1).1.2.4碱液中的加样回收试验取1.2.3"项下已知含量的溶液,精密加人一定量的沙丁胺醇标准溶液,同法测定.平均加样回收率为99.4%,RSD=O.73%(=4).1.2.5HPLC测定硫酸沙丁胺醇片的含量取"1.2.2"项下的续滤液5置25量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,照文献..方法测定,按内标法以峰面积计算,并将测定的结果乘以1.2049,即得(表1.襄l硫酸沙丁胺醇片的含量测定结果{H=32讨论2.1从实验结果及表l可以看出,碱液法与HPLC法结果基本一致,而酸液法结果明显偏高.碱液法所用的浓度最低,酸液法次之,HPLC法所用的浓度最高.显然,改变溶液的酸碱性和检测波长,可提高其检测灵敏度.2.2采用紫外分光光度法测定硫酸沙丁胺醇片的含量,在碱液中较酸液中检测灵敏度提高7倍以上.文献[1]的测定方法改为高效液相色谱法,但操作较繁琐,灵敏度较低,且需使用对照品和内标物质此外,新版药典中硫酸沙丁胺醇注射液及硫酸沙丁胺醇胶囊的含量测定仍为灵敏度较低的吸收系数59的紫外分光光度法,均有待改进2.3试验表明,碱液法中样品宜先加水溶解过滤后再用氢氧化钠液碱化后测定,若直接将样品溶于氢氧化钠溶液中,过滤稀释后再测定,则结果偏高约5%,其原因有待进一步考证参考文献l中华人民共和国国家药典委员会中国药典【s]二部北京:化学工业出版杜,20oo.8712英国药典[s]上册199819213张晓橙喘乐宁气雾剂古量测定方法的改进J]药物分析杂志, 1992.I2(2):80收稿日期:2'001—02。
影响内毒素G试验结果的常见因素
影响内毒素、G试验结果的一些常见因素
一、采血严格按照无菌要求采集，须用专门配套耗材，采血后及时送检。
二、黄疸、溶血、乳糜血会影响检测结果。
三、引起细菌内毒素假阳性原因是：使用某些抗生素类药物，如磺胺类、以细菌为原料加工成的药物。
四、引起G试验假阳性原因有：
1、应用纤维素膜进行血液透析患者；
2、某些纱布或其他医疗物品中含有葡聚糖；
3、某些品牌的静脉制剂（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等）含有葡聚糖；
4、某些细菌败血病患者（尤其是链球菌败血症）；
5、抗肿瘤药物（如香菇多糖、裂殖菌多糖等）；
6、含有菌类食物。
五、隐球菌和接合菌不能检出。
六、内毒素检测的灵敏度大概为88%，特异性为90%；G试验的灵敏度为88%，特异性为85%。
七、一次检测结果不能成为确诊依据，须由临床医生根据检测结果并结合临床症状及其他检测结果综合分析。
八、G试验适用于深部真菌，浅部真菌在体内血液中含量并不增高。
九、尽管假阳性原因不清，需进行动态监测（1-3）-β-D葡聚糖的变化，可以降低假阳性的发生。
内毒素问题总结报告
内毒素问题总结报告1.目的1.1解决内毒素反复的问题1.2找出内毒素反复的原因2.背景从200501批次验证到200701批次验证一直存在内毒素反复不合格的问题，为了确认内毒素不合格的原因并予以解决，现进行内毒素问题筛查与解决。
3.试验过程3.1初步筛查准备SAM溶液、活化I、活化II、匀浆后溶液按照以下列表取样：按照上述样品取样后，每组样品加入内毒素用水13ml置于37℃、100rpm摇床振摇浸提。
取浸提液100ul加入1.5ml内毒素用水稀释16倍，置于漩涡混合机混合，取100ul 内毒素用水至0.03EU鲎试剂，然后加入100ul混合液封口置于内毒素测定仪37℃反应1h，倒转观察鲎试剂凝固或滴落，以此判定待测产品内毒素是否合格。
试验结果如下：初步筛查结果显示为活化II步骤存在问题，下一步主要针对活化II 进行筛查。
准备活化II、溶液＋CaCl2、溶液＋EDC、清洗未匀浆、200501二楼冻干成品、200501三楼冻干成品样品，按照下表取样：按照上述样品取样后，每组样品加入内毒素用水13ml置于37℃、100rpm摇床振摇浸提。
取浸提液100ul加入1.5ml内毒素用水稀释16倍，置于漩涡混合机混合，取100ul 内毒素用水至0.03EU鲎试剂，然后加入100ul混合液封口置于内毒素测定仪37℃反应1h，倒转观察鲎试剂凝固或滴落，以此判定待测产品内毒素是否合格。
试验结果如下：根据当前两次筛查结果显示，可能在活化II阶段存在干扰，其他步段无法检出干扰因素，分别针对溶液加CaCl2、EDC进行筛查，结果显示均为阴性，因此结合文献推断可能是Ca2+和β-葡聚糖组合干扰。
当前阶段，可供选择的解决方案有：1.采用物理方法排除干扰因素2.采用试剂排除干扰因素3.增大稀释倍数，采用精度更高的鲎试剂4.采用抗增液，结合更高精度鲎试剂3.3物理方法排除干扰针对活化II溶液，采取离心、过滤的方法进行试验。
离心方案为取2.4g溶液在3000rpm离心10min，然后对上清液进行浸提、稀释、检测，结果发现3000rpm离心10min无明显分层现象，且上层呈阳性；过滤方案为取2.4g溶液使用0.22um和0.45um的过滤器进行过滤，对滤液进行浸提、稀释、检测，结果发现溶液使用过滤器容易堵塞过滤器且过滤效率慢，且检测滤液呈阳性。
5、内毒素检查的常见干扰及消除
湛江安度斯公司的TAL可以抵抗一般水平的β-葡聚糖干扰。 用湛江安度斯公司的抗增液复溶鲎试剂可以消除（1-3）β-D葡
聚糖的干扰。
E3.0
NC E0.03 E0.3
每个浓度的标准内毒素溶液分别与抗增液复溶的 鲎试剂及BET水复溶的鲎试剂反应
0.1mg/ml葡聚糖（抗增液）
0.1mg/ml 葡聚糖
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
¼λ － － － －
SE¼λ ＋ － － －
符合CP要求，但不 符合USP要求
出现表b或表c的极端情况均为不适宜的实验结果，需要检查实 验条件。
干扰的类型
抑制
供试品含有的内毒素浓度≥2倍检测试剂的灵敏 度，但检测结果仍为阴性，称之为假阴性
增强
供试品含有的内毒素浓度低于检测试剂灵敏度 的1/2，但检测结果仍为阳性，称之为假阳性
在标准内毒素制备及使用过程，需要经常旋涡混合其 溶液
避免使用对标准内毒素有吸附作用的实验器具
增强的来源和解决方法
来源
β-葡聚糖是造成鲎试剂结果假阳性的一个已知来源。 美国药典BET法的要求： “除了内毒素，鲎试剂还与某些β-葡聚糖反应。一些经特殊制 备的鲎试剂不会与β-葡聚糖反应，应使用这种鲎试剂检测含β 葡聚糖的样品”
＋
溶液C（Es）
λ
½λ
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
溶液B（Et）
SEλ
SE½ λ
－
－
－
－
－
－
－
－
¼λ － － － －
SE¼ λ － － － －
不符合CP要求，但 符合USP要求
内毒素检测影响因素
内毒素检测影响因素
内毒素检测影响因素
1．有些物质对鲎试剂一内毒素凝胶反应有干扰作用，得出假阳性结果。
据报道：氨基酸、抗生素、碳水化合物、电解质、维生素、络合剂和添加剂产生抑制干扰；二价阳离子、右旋糖酐一40、鲎试剂反应物质、某些蛋白质、凝血酶等则能产生强化干扰得出假阳性结果。
2．葡聚糖的存在可致阳性结果，却不引起家兔发热，具有葡聚糖结构的物质包括血制品里的白蛋白、抗凝血酶、免疫球蛋白等故目葡聚糖及其类似物又称真菌多糖，这些成分在药品制备过程中有可能存在，此外．抗凝血酶、胰蛋白酶，免疫球蛋白、多棱苷酸、棕榈酰右旋糖酐磷酸盐、铜铵人造膜、纤维索膜等都能与TAL发生凝胶反应．导致实验结果的假阳性；
3．弃G因子鲎试剂排除了某些激活G因子这一旁路的干扰，使鲎试剂对内毒素发生反应具有专一性．去G因子鲎试剂即是一种只对内毒素起反应，而对r1—31一B—D—Glucan及类似物不起反应的鲎试剂因此．在有条件的情况下，采用去G因子鲎试剂，也是减少假阳性发生的有欢方法之～。
4．鲎试剂与内毒素的反应的最适宜pH值在6．5—8．0；TAL最佳反应pH值为6．5～7，低于5．7时TAL几乎没有反应活性，pH 小于3或大于9时，酶的活性受到抑制，直接检查，甚至改变整个酶分子系统使其变性失活。
故鲎试验时，供试品pH最好应预调到6．5—7．0为好。
细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。许多药物因
PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的Ca2+、
标示值是否准确？
2 细菌内毒素标准品引起的误差
细菌内毒素标准品种类 细菌内毒素标准品效价误差
细菌内毒素标准品操作误差
细菌内毒素单位表示误差 细菌内毒素标准品的错误使用
1） 细菌内毒素标家标准品
细菌内毒素工作标准品
2） 细菌内毒素标准品效价误差
品，其中包括, 无热原试管、无热原移液器吸头。 这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当 实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快 分析判断出误差原因。
2） 器皿的正确处理 2005年版《中国药品检验标准操作规范》278页— —细菌内毒素检查法“实验准备”规定：“将被 洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水
细菌内毒素检查结果准确性的
影响因素
一、试验误差分析及改进措施
鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响
细菌内毒素工作标准品效价及使用的影响
实验器皿的的影响
样品成份及理化性质的影响
实验员的影响
环境的影响
1 鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响
鲎试剂的质量：抗干扰能力，稳定性；
鲎试剂灵敏度标示值的准确性 。 鲎试剂灵敏度的误差 是否用细菌内毒素国家标准品标定？
细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标准品 之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素工作 标准品之间的生物效价存在一定的误差，用不同 细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度时可 能 存 在 一 定 的 误 差 。 中 国 药 典 要 求 “ 当 λc 在 0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素 检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏 度。”试验结果只要在这合格范围内表示鲎试剂 标示灵敏度准确。
G试验
7.O. Albert, Eur J Clin Microbiol Infect Dis ,2011,30:1453– 1460.
假阳性影响因素
3. 2细菌感染-革兰氏阴性菌
43个菌血症患者，16个BG阳性，分布如下。
菌血症
人数
BG阳性人数
假阳性率
革兰氏阴性杆菌
22
13
59.1%*
革兰氏阴性球菌
17
推荐级别
美国指南
传染病信息 2014 年 02 月 28 日第 27 卷第 1 期 Infect Dis Info, Vol. 27, No. 1, February 28, 2014
2013年美国《感染性疾病微生物学实验室 诊断应用指南》简介 —病原及标本处理部分
表6医疗相关和医院获得性肺炎及呼吸机相关性肺炎实验室诊断
肺真菌病诊断和治疗专家共识
中华医学会呼吸病 学分会感染 学组
中华结核和呼吸杂 志编辑委 员会
共识中声明，G试验(1，3-β-D葡聚糖)、GM试验阳性是肺部真菌病的 临床诊断中微生物学证据之一
G试验作为诊断标准已纳入肺部真菌感染患者诊断 标准与治疗原则中。
1.血液制品：
输注白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子或血液制品；
假阳性影响因素
2. 1 药物-克拉维
酸
采取6个患者10份血清检测G试验水平，克拉维酸治疗组BG水平
1339-1798 pg/ml，头孢他啶治疗组BG水平17.7-26.5 pg/ml，健康
对照组BG水平8.0±13.8 pg/ml。
提示：克拉维酸显著提高血清BG水平。并且克拉维酸治疗前BG水 平为阴性，注射结束20min血清BG水平可升至800pg/ml以上水 平。
影响鲎试验结果的常见因素
影响鲎试验结果的常见因素药品细菌内毒素检查法，是一项操作简便、快速、标准化程度高，应用成本低廉的新技术，又是一项生物学反应复杂的体外检测方法。
由于影响因素较多，实验操作的准确性尤为重要。
其次是目前美国药典收载的药品品种达680多种，但是在我国因人体重与国外的差异，供试品的内毒素限量值不尽相同。
所以，在实际工作中对美国药典收载的品种和文献报道的方法只能作为参考，对同一种药品的检查法不能照搬以免造成工作的失误。
因此在实际工作中应注意如下几个问题：1、实验前应复合鲎试剂产品的灵敏度和自身凝集时间，因为鲎试剂本身灵敏度的改变或质量不符合要求，能影响您的实验结果。
2、细菌内毒素工作品效价误差或效价不稳定，可影响实验结果。
建议您选用中检所提供的细菌内毒素标准品，必要时或有条件者应标定细菌内毒素标准品的效价。
3、请您选用厂家配备的细菌内毒素检查用水。
因为：BET用水是一种特殊的水，它不仅是要求细菌内毒素限值<0.03Eu/ml，而且要求有严格的PH （6.0-8.0）范围，不能用注射用水替代使用。
4、实验操作的误差：操作顺序和熟练程度尤为重要。
实验顺序如下所示：①制备内毒素标准溶液→②稀释检品→③溶解鲎试剂→④摆放试管→⑤加样或加试剂→⑥封口恒温→⑦观察结果并记录5、实验器具的洁净度影响：一般用硫酸清洁液浸泡4小时，用自来水冲洗干净，再用新鲜蒸馏水冲洗三道，并干热（250℃）恒温1.5h即可。
实验用的玻璃器具必须严格无菌无热原，建议不要使用一次性朔料制品。
6、实验条件：实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室，应备有一台超净工作台。
7、温度：实验室温度为25±2℃较好，恒温水浴箱温度为37±1℃为宜。
8、样品本身干扰，对含有多糖类药品，应选用特异性鲎试剂或普通鲎试剂加G因子抑制剂使用。
对PH较低的样品应调节PH值。
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影响内毒素、G试验结果的一些常见因素
一、采血严格按照无菌要求采集，须用专门配套耗材，采血后及时送检。
二、黄疸、溶血、乳糜血会影响检测结果。
三、引起细菌内毒素假阳性原因是：使用某些抗生素类药物，如磺胺类、以细菌为原料加工成的药物。
四、引起G试验假阳性原因有：
1、应用纤维素膜进行血液透析患者；
2、某些纱布或其他医疗物品中含有葡聚糖；
3、某些品牌的静脉制剂（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等）含有葡聚糖；
4、某些细菌败血病患者（尤其是链球菌败血症）；
5、抗肿瘤药物（如香菇多糖、裂殖菌多糖等）；
6、含有菌类食物。
五、隐球菌和接合菌不能检出。
六、内毒素检测的灵敏度大概为88%，特异性为90%；G试验的灵敏度为88%，特异性为85%。
七、一次检测结果不能成为确诊依据，须由临床医生根据检测结果并结合临床症状及其他检测结果综合分析。
八、G试验适用于深部真菌，浅部真菌在体内血液中含量并不增高。
九、尽管假阳性原因不清，需进行动态监测（1-3）-β-D葡聚糖的变化，可以降低假阳性的发生。