聚谷氨酸的检测方法
r-聚谷氨酸知识讲解
固体发酵：以黄豆 作为基本培养物， 所得γ-聚谷氨酸的 产量比液体发酵高， 只是固体发酵也存 在困境。
培养基的优化配置
液体发酵： 普遍
使用的碳源为葡 萄糖，氮源为酵 母粉、牛肉膏、 蛋白胨、豆粕等， 大多数的培养基 都含有谷氨酸钠。
培养基的优化配置 分离纯化方法 现状与前景讨论
菌种来源
1
2
3
从豆制品或土壤 中或日本纳豆、 豆瓣酱、酱大蒜、 酱黄瓜等传统酱 类食品自行筛选。
由实验室保藏γ聚谷氨酸产生菌 为出发菌经诱变 筛选出高产菌种。
运用基因工程将 产γ-聚谷氨酸的 基因连接到载体 导入大肠杆菌。
发酵方法
液体发酵：研究者
绝大多数止于摇瓶
γ-聚谷氨酸合成酶的 研究进展
• pgsB的表达蛋白（不含跨膜区）可与ATP结 合催化ATP水解，为γ-聚谷氨酸的合成提供 能量，pgsC蛋白（含4个跨膜区）高度保守， 为疏水性蛋白。PgsA蛋白在N端含一个跨膜 区，为亲水性稳定蛋白。
γ-聚谷氨酸检测技术
• 定性检测：实验采用的检测通常是用红外 光谱技术，与公司生产的γ-聚谷氨酸的标准 光谱图对照，以检测产物是否为γ-聚谷氨酸， 或是通过核磁共振来确定分子式。
护发素的有效成分，头发定型剂，表皮缓 27h 酶水解法 2-5h 黏度计法 快速
紫外分光光度法 快速
背景
γ-PGA的应用研究进展 γ-PGA
四大方面
医药制造
农业生产
重金属污 染治理
食品加工
γ-聚谷氨酸（γ-PGA）应用 研究进展
• 医药制造
作为载体：转运或联合转运或磁铁靶向转 运药物（疫苗，抗肿瘤药物，抗病毒药物， 激素类药物等）、基因。
《聚谷氨酸企标》
4.2 理化指标：应符合表 2 的规定。
表2 理化指标
第 1 页 共 8 页
项
目 ≥
指 标 90.0 5.0~7.5 ≤ ≤ 10.0 0.07 标识值±20% ≤ 20
检验方法 附录A 中A.3 附录A 中A.4 附录A 中A.5 附录A 中A.6 附录A 中A.7 中国药典二部附录Ⅷ H 重金属检查法第二法a
聚谷氨酸 (以钠盐按干基计)， w/% pH值 （1%水溶液） 干燥失重，w/% 吸光度（4%水溶液,400nm） 特性黏度，[η]/ ( dL/g ) 重金属（以Pb计）/（mg/kg）
a
称样量约为1g。
4.3
微生物指标：应符合表 3 的规定。
表 3 微生物指标 项 菌落总数/（cfu/g） 目 ≤ 指 标 100 检验方法 GB 4789.2-2010
COOH
O
[
3.4
HN HC CH2 CH2 C
]n
CAS号：25513Байду номын сангаас46-6
4 技术要求 4.1 感官要求：应符合表1 的规定。
表1 项 色泽 气味 状态 目 要求 白色或褐色 几乎无臭 颗粒或粉末 感官要求 检验方法 取适量样品置于清洁、 干燥的白瓷盘 中， 在自然光线下， 观察其色泽和组 织状态，并嗅其味。
X 1=
MS CS AU 100% %………………………（A.1） MU （1-X 0） AS
式中： X1——试样中聚谷氨酸的含量，%； AU——试样液色谱分析得到的主峰面积； AS——标准溶液色谱分析得到的主峰面积； MU——试样的质量，单位为克（g）； MS——聚谷氨酸标准品的质量，单位为克（g）； X0——实测试样的干燥失重，%； CS——聚谷氨酸标准品中标示的聚谷氨酸的含量，%； 实验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果 的绝对差值不大于算术平均值的2 %。 A.4 pH的测定 称取适量试样，配制成10mg/mL 的试样水溶液，用pH 计测定pH。 A.5 干燥失重 A.5.1 仪器和设备 快速水分测定仪(METTLER-TOLEDO Halogen Moisture Analyzer,HR83)。 A.5.2 测定条件 样品量：1g；温度：105℃；时间：15分钟。 A.5.3 测定方法 取本品约 1.0 g，置 HR83 型卤素水分测定仪托盘内。105℃测定 15 分钟，以仪器自动打 印结果计为 h（%）。
复合肥料中γ-聚谷氨酸含量的测定 柱前衍生-高效液相色谱法 -回复
复合肥料中γ-聚谷氨酸含量的测定柱前衍生-高效液相色谱法-回复复合肥料中γ聚谷氨酸含量的测定是农业学和化学学等学科领域的重要研究内容。
γ聚谷氨酸是一种具有较高氮含量的天然多肽，是植物生长和发育中的重要调控物质，能有效提高作物的抗逆性和产量。
为了准确测定复合肥料中γ聚谷氨酸的含量，我们可以采用柱前衍生高效液相色谱法。
柱前衍生是一种在样品分析前对目标分析物进行修饰的方法，可以提高分析物的检测灵敏度和选择性。
结合高效液相色谱技术，可以实现对复合肥料样品中γ聚谷氨酸的准确测定。
下面，我们将详细介绍柱前衍生高效液相色谱法测定复合肥料中γ聚谷氨酸含量的步骤和操作方法。
第一步：准备样品首先，需要准备待测的复合肥料样品。
将样品粉碎并均匀混合，取适量样品，称取一个准确的样品质量，并转移至适量的容量瓶中。
然后，加入适量的溶剂，如硝酸钠溶液等溶解样品。
待样品完全溶解后，用0.45μm的微孔滤膜过滤，以去除杂质。
第二步：柱前衍生将样品中的γ聚谷氨酸进行柱前衍生。
选择适合的柱前衍生试剂，如酰氯试剂，将试剂添加到样品中，并进行充分混合反应。
可采用常温或者加热的方法进行反应，反应时间通常在30分钟至数小时不等，具体的反应条件需根据试剂和样品的特性进行优化。
第三步：固相萃取固相萃取是在衍生化反应后去除混合体，净化样品并提取目标化合物的方法。
将衍生化样品经过固相萃取柱处理，可以有效去除多余的试剂和杂质。
选择合适的固相萃取柱，如C18柱，并设定适当的洗脱溶剂，如甲醇和水的混合物。
用洗脱溶剂进行洗脱，收集洗脱液中的目标化合物。
第四步：制备标准曲线为了定量分析样品中的γ聚谷氨酸含量，需要制备一条标准曲线。
选择一系列浓度已知的γ聚谷氨酸标准溶液，分别进行柱前衍生和固相萃取处理，并用高效液相色谱仪分离检测。
采用不同浓度标准溶液的响应值绘制曲线，可得一条γ聚谷氨酸的标准曲线。
第五步：高效液相色谱分析将经过柱前衍生和固相萃取处理的样品用高效液相色谱仪进行分析。
聚谷氨酸分子量和含量
聚谷氨酸分子量和含量1. 介绍聚谷氨酸聚谷氨酸是一种生物大分子多肽，由谷氨酸（glutamic acid）单体通过肽键连接而成。
它具有多种生物学功能，包括调节细胞的生长、分化和凋亡等过程。
聚谷氨酸在医药、食品、农业等领域都具有广泛的应用前景。
2. 分子量的定义和计算方法分子量是指一个分子中所有原子的质量之和。
对于聚谷氨酸这样由多个谷氨酸单体组成的大分子来说，其分子量可以通过以下公式计算：M = n * m其中，M表示聚谷氨酸的分子量，n表示聚合物中谷氨酸单体的个数，m表示每个谷氨酸单体的分子量。
3. 聚谷氨酸含量的测定方法3.1 琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法是一种常用于测定聚谷氨酸含量的方法。
通过将样品加入琼脂糖凝胶电泳胶液中，利用电场将样品分离成不同的带状条带，根据条带的强度和位置可以确定聚谷氨酸的含量。
3.2 高效液相色谱法高效液相色谱法是一种精确测定聚谷氨酸含量的方法。
通过将样品溶解后注入高效液相色谱仪中，利用色谱柱对样品进行分离，并通过检测器测量各组分的峰面积或峰高来计算聚谷氨酸的含量。
4. 聚谷氨酸在医药领域的应用4.1 肿瘤治疗聚谷氨酸具有较好的药物传递性能和生物相容性，可以作为肿瘤治疗药物的载体。
将抗肿瘤药物与聚谷氨酸结合，可以提高药物在体内的稳定性和靶向性，减少毒副作用。
4.2 创伤修复聚谷氨酸作为一种生物可降解材料，在创伤修复中具有广泛的应用。
聚谷氨酸可以促进伤口愈合过程中的细胞增殖和组织再生，加速创伤的愈合。
5. 聚谷氨酸在食品领域的应用5.1 食品添加剂聚谷氨酸可以作为一种食品添加剂，用于提高食品的营养价值和口感。
它可以增加食品的黏稠度、弹性和保水性，改善食品的口感和质地。
5.2 食品保鲜剂聚谷氨酸具有较好的保水性能，可以作为一种食品保鲜剂使用。
将聚谷氨酸添加到食品中，可以延长食品的保质期，减少腐败和变质。
6. 聚谷氨酸在农业领域的应用6.1 土壤改良剂聚谷氨酸可以改良土壤结构，提高土壤肥力和养分利用率。
聚谷氨酸理化指标
聚谷氨酸理化指标一、聚谷氨酸的基本概念聚谷氨酸（y-PGA），又称纳豆菌胶、多聚谷氨酸，是一种水溶性、生物降解、不含毒性的生物高分子材料。
它最早在纳豆发酵豆中被发现，并通过微生物发酵法制得。
聚谷氨酸具有粘性，广泛应用于食品、化妆品、药品等领域。
二、聚谷氨酸理化指标的重要性聚谷氨酸理化指标是评判产品质量优劣的关键因素。
这些指标包括聚谷氨酸的含量、分子量、粘度、溶解性等。
稳定的理化指标意味着产品具有较好的品质和性能。
三、聚谷氨酸理化指标的评判标准1.聚谷氨酸含量：正常情况下，聚谷氨酸产量稳定在35g/L即为优质产品。
生产过程中，不同批次的含量波动应控制在一定范围内，以保证产品性能的稳定。
2.分子量：聚谷氨酸分子量分布对产品性能有一定影响。
理想的分子量分布应在一定范围内，以满足不同应用场景的需求。
3.粘度：聚谷氨酸溶液的粘度是其性能的重要指标。
合适的粘度可以保证产品在应用过程中的流动性和稳定性。
4.溶解性：聚谷氨酸在水、醇等溶剂中的溶解性能对其应用范围有较大影响。
良好的溶解性有助于提高产品在实际应用中的效果。
四、聚谷氨酸理化指标检测方法1.高效液相色谱法：这是一种准确的检测方法，可以对聚谷氨酸含量进行精确测定。
2.酒精法（醇沉法）：这种方法在一定程度上可以检测聚谷氨酸含量，但受发酵液中其他成分的影响，检测结果可能出现偏差。
五、总结聚谷氨酸理化指标是评判产品质量和性能的重要依据。
稳定的产量、适当的分子量分布、良好的溶解性和合适的粘度都是优质聚谷氨酸产品的必备条件。
选择合适的检测方法，确保产品符合相关指标，对于提升产品质量和市场竞争力具有重要意义。
比色法快速测定发酵液中γ-聚谷氨酸含量
比色法快速测定发酵液中γ-聚谷氨酸含量刘鹏丽;刘萍;黄琛;殷志敏【摘要】建立了发酵液中γ-聚谷氨酸(γ-PGA)含量快速测定的比色检测方法.其原理为γ-聚谷氨酸可以与亚甲基蓝溶液发生反应,并且使亚甲基蓝溶液颜色发生变化.配制不同浓度的γ-PGA标准品溶液,使其与亚甲基蓝溶液形成反应体系,并对亚甲基蓝溶液浓度、反应温度以及反应时间对反应体系的影响分别进行对比优化.结果显示,亚甲基蓝溶液质量浓度为10 mg/L,反应温度为30℃,反应时间为5 min,线性回归方程y=0.0024x+0.3289,R2=0.9965,空白加标平均回收率为106.8％,平均RSD值为1.51％,发酵液中加标平均回收率为118.3％,平均RSD值为1.89％.利用比色法测定发酵液中γ-PGA的含量简便快捷、重现性好、灵敏度较高、准确度好,可用于发酵液中γ-PGA浓度的检测.【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(042)002【总页数】5页(P105-108,114)【关键词】γ-聚谷氨酸;亚甲基蓝;比色法;定量分析【作者】刘鹏丽;刘萍;黄琛;殷志敏【作者单位】南京师范大学生命科学学院,生物化学与生物制品研究所,江苏省分子医学重点实验室,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,生物化学与生物制品研究所,江苏省分子医学重点实验室,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,生物化学与生物制品研究所,江苏省分子医学重点实验室,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,生物化学与生物制品研究所,江苏省分子医学重点实验室,江苏南京210023【正文语种】中文【中图分类】Q5-33γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)是一种具有生物相容性的新型生物高分子材料,是炭疽杆菌细胞荚膜的一种化学组成成分,由D-谷氨酸或L-谷氨酸以α-氨基和γ-羧基通过酰胺键缩合而成的,由多数杆菌产生的一种胞外水溶性的高分子氨基酸聚合物. 微生物合成的γ-PGA通常由5 000个左右的谷氨酸单体组成,相对分子质量一般在100 kD～1 000 kD[1-3]. γ-PGA是一种阴离子高分子聚合物,在其分子链的侧链上有很多活性较高的游离羧基(—COOH),可以在分子内部或分子之间形成氢键[4],具有极高的保湿性和吸水性,易于和一些药物结合形成稳定的复合物,是一种理想的可在体内生物降解的药用高分子聚合物[5-6]. γ-PGA安全无毒,对环境没有污染,具有可塑性、成纤维性、成膜性、保湿性等众多的理化性质和生物学特性,被广泛地应用于农业、医药、环境治理、食品加工与包装、化妆品工业等众多领域,是一种极具开发价值和应用前景的新型多功能生物制品[7-9].亚甲基蓝(Methylene blue),又被叫做次甲基蓝、亚甲蓝、次甲蓝、美蓝等,是一种芳香杂环化合物,被用作化学指示剂、生物染色剂、染料和药物等,在水溶液中呈正电性[10-11]. 根据异性电荷相吸的原理,带正电荷的亚甲基蓝分子可以和带负电荷(—COO-)的γ-PGA通过静电吸引力相结合,使亚甲基蓝水溶液颜色发生变化[12-13].1 材料1.1 菌种及培养基枯草芽孢杆菌(南京师范大学生化与生物制品研究所提供);种子培养基:葡萄糖20 g/L;谷氨酸钠 10 g/L;酵母粉5 g/L;七水合硫酸镁2.5 g/L;磷酸氢二钾2 g/L;一水合硫酸锰0.02 g/L;发酵培养基:谷氨酸钠50 g/L;磷酸氢二钾15 g/L;磷酸二氢钾2 g/L;七水合硫酸镁2.5 g/L;酵母粉5 g/L;氯化铵4 g/L;一水合硫酸锰0.2 g/L;葡萄糖40 g/L;pH 7.0.1.2 仪器UV-1800PC分光光度计上海美谱达仪器有限公司;Heraeus Multifuge×3R冷冻离心机美国赛默飞;ZQZY-C振荡培养箱上海知楚仪器有限公司;SHZ-IV循环多用真空泵南京科博尔仪器设备有限公司.1.3 材料亚甲基蓝上海瑞永生物科技有限公司;γ-PGA标准品南京轩凯生物科技有限公司;其他试剂均为分析纯试剂.2 方法2.1 γ-PGA标准液的配制分别精确称取γ-聚谷氨酸标准品(4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.5)g,置于干净的烧杯中,加入适量的蒸馏水溶解,然后定容至100 mL的容量瓶中,摇匀,分别得到40 g/L、35 g/L、30 g/L、25 g/L、20 g/L、15 g/L、10 g/L、5 g/L的γ-PGA标准品.2.2 γ-PGA的初步纯化发酵液稀释数倍后经10 000 r/min离心20 min,除去菌体,取上清液进行抽滤脱色,制得样液.2.3 亚甲基蓝配制根据文献[9]可知亚甲基蓝的干燥减量E=11.46%,因此根据干燥减量精确称取与所需亚甲基蓝干燥品质量0.050 0 g相当的未干燥品,将称取的亚甲基蓝(精确至0.000 1 g)溶解于蒸馏水中,待全部溶解后,移入100 mL容量瓶中,摇匀,配置成0.5 g/L的亚甲基蓝溶液,取该溶液1 mL至另一个50 mL的容量瓶中,用蒸馏水定容至50 mL,摇匀,得到10 mg/L的亚甲基蓝试液.2.4 亚甲基蓝比色法取3 mL标准液或样液于试管中,准确加入3 mL亚甲基蓝试液,然后置于恒温振荡箱中,在25 ℃振荡反应5 min后,将反应液倒入比色皿中,测定波长在664 nm下的吸光度(A664),以蒸馏水做相应处理作为空白.3 结果与分析3.1 亚甲基蓝试液浓度对测定的影响将浓度为(6、8、10、12、14、16)mg/L的亚甲基蓝试液分别与浓度为(5、10、15、20、25、30、35、40)g/L的γ-PGA标准品溶液在一定温度反应一定时间后,在664 nm下测定其吸光度A664,并绘制标准曲线,见图1.由图1可见,在不同浓度亚甲基蓝试液条件下,标准曲线都呈现较好的线性关系,但不同浓度的亚甲基蓝试液与γ-PGA标准液反应得到的标准曲线的R2值还是存在着不同,当亚甲基蓝试液浓度为10 mg/L时,标准曲线的准确度更好,因此在后续研究中,将亚甲基蓝试液浓度确定为10 mg/L.3.2 反应温度对测定的影响将浓度为(5、10、15、20、25、30、35、40)g/L的γ-PGA标准液与浓度为10 mg/L的亚甲基蓝试液分别在(25、30、35、40、45、50)℃下反应一定时间后,在664 nm处测定吸光度A664,绘制标准曲线.由图2可见,在不同温度条件下,标准曲线几乎重合,表明温度对测定结果的影响不大,可以忽略,因此选择温度为25 ℃,即室温.图1 不同亚甲基蓝浓度下的标准曲线Fig.1 Standard curves at different concentrations of methylene blue注:R2=0.994 8(25 ℃);R2=0.996 9(30 ℃);R2=0.994 0(35 ℃);R2=0.9946(40 ℃);R2=0.996 0(45 ℃);R2=0.995 5(50 ℃).图2 不同温度下的标准曲线Fig.2 Standard curves at different reaction temperature3.3 反应时间对测定的影响将浓度为(5、10、15、20、25、30、35、40)g/L的γ-PGA标准品溶液与浓度为10 mg/L的亚甲基蓝试液于25 ℃反应不同时间,在664 nm处测定其吸光度A664,并绘制标准曲线.由图3可见,反应不同时间的标准曲线都呈较好的线性关系,而且标准曲线没有太大的差异,表明反应时间对于测定结果影响不显著,因此,为了更加快速并且准确地检测γ-PGA含量,在后续的研究中,控制反应时间为5 min.3.4 亚甲基蓝比色法标准曲线按照上述实验得到的测定条件,将浓度为(5、10、15、20、25、30、35、40)g/L 的γ-PGA标准液与浓度为10 mg/L的亚甲基蓝试液于25 ℃反应5 min,在664 nm处测定吸光度A664,绘制标准曲线,如图4所示.图4 亚甲基蓝比色法标准曲线Fig.4 The standard curve of methylene blue colorimetry注:R2=0.994 8(5 min);R2=0.988 1(10 min);R2=0.985 0(30 min);R2=0.978 6(1 h);R2=0.960 7(2 h);R2=0.954 4(3 h);R2=0.961 3(4 h);R2=0.948 9(5 h).图3 反应时间对标准曲线的影响Fig.3 Effect of reaction time on the standard curve 3.5 方法的回收率和重现性3.5.1 空白加标回收法按照方法1.2.1配制得到浓度为8 g/L(相对低浓度)、16 g/L(相对中浓度)、32g/L(相对高浓度)3个不同浓度的γ-PGA标准液,分别取γ-PGA标准液3 mL,亚甲基蓝3 mL,充分振荡摇匀,5 min后测定A664,以蒸馏水做相应处理后作为空白,每个处理重复3次,实验结果见表1,结果显示,应用亚甲基蓝比色法测定γ-PGA含量,其回收率和重现性都较好.3.5.2 样品加标回收法配制浓度为8 g/L、16 g/L、32 g/L的γ-PGA标准液,每个浓度的标准液各取2 mL,然后分别加入等体积的经过稀释的样品溶液,充分混匀之后,加入4 mL的亚甲基蓝试液,充分振荡反应5 min之后,测定A664,以2 mL样液加2 mL蒸馏水做相应处理后作为空白,每个浓度重复3次. 测定结果见表2,结果显示γ-PGA在发酵液中的回收率也较好.表2 γ-PGA在发酵液中的回收率Table 2 The recovery of γ-PGA in the fermentation broths样品加标样量/(g/L)回收标样量的平均值/(g/L)回收率/%RSD/%188.53106.72.2121616.57103.61.1433232.67102.41.33表1 回收率与重现性实验Table 1 The recovery and reproducibility of test配制浓度/(g/L)测得浓度的平均值/(g/L)回收率/%RSD/%88.13101.62.411616.04100.31.253231.9499.80.613.6 样品提取过程中发酵液脱色对测定的影响R2=0.994 8(control);R2=0.962 7(七水合硫酸镁);R2=0.969 2(氯化铵);R2=0.965 1(磷酸氢二钾);R2=0.972 3(谷氨酸钠).图5 不同无机盐对标准曲线的影响Fig.5 Effect of different inorganic salts on the standard curve本实验主要采用粉末状活性炭进行抽滤脱色,脱色率在90%左右,在未脱色之前发酵液的颜色会干扰比色测定的结果,因此,在进行比色测定时要先对发酵液进行脱色处理,由3.5.2样品加标回收法中可以看出,经过脱色之后的发酵液对比色测定的结果干扰很小.3.7 发酵液中无机盐成分对测定的影响分别准确称取一定量的七水合硫酸镁、氯化铵、磷酸氢二钾、谷氨酸钠,然后分别溶于一定量的浓度为10 mg/L的亚基蓝试液中,使之浓度分别为2.5 g/L、4 g/L、15 g/L、50 g/L,对照组为不加任何上述无机盐的浓度为10 mg/L的亚甲基蓝溶液,然后再分别与浓度为(5、10、15、20、25、30、35、40)g/L的γ-PGA标准液于25 ℃反应5 min,在664 nm处测定吸光度A664,绘制标准曲线,如图5所示.由图5可知,加入不同无机盐的标准曲线都呈较好的线性关系,标准曲线虽然有所差异,但是差异并不明显,表明无机盐离子对于测定结果的影响并不显著.4 结论亚甲基蓝是一种带正电荷的芳香杂环化合物,而γ-PGA在发酵液中是以聚阴离子形式存在的. 在溶液中,亚甲基蓝的氮原子可以和γ-PGA中羧基的氧原子配对,使亚甲基蓝试液的颜色发生变化. 本研究表明,带有正电荷的亚甲基蓝与具有聚阴离子性质的γ-PGA发生反应之后在664 nm处的吸光度大小与γ-PGA浓度成正比,并且具有良好的线性关系. 该方法的反应温度为25 ℃,反应时间为5 min,采用该方法测定γ-PGA的含量,其重现性和回收率都较好,而且在发酵液中的回收率也较高,并且发酵液需要经过脱色之后再进行比色测定,且发酵液中的无机盐对于测定结果干扰性很小. 该方法快捷简便、准确度高、结果可靠、无需特殊的设备和试剂,可以应用于γ-PGA的生物发酵生产中的检测.[参考文献]【相关文献】[1] 刘婷. 发酵液中γ-聚谷氨酸的分离纯化及初步鉴定研究[D]. 西安:陕西科技大学,2016.[2] 桑秀梅. 利用聚谷氨酸高产菌NS-18制备γ-聚谷氨酸[D]. 南京:南京师范大学,2017.[3] 董健,吕颖,方丽,等. γ-聚谷氨酸的发酵制备及快速鉴定分析方法研究[J]. 中国酿造,2012,32(5):148-150.[4] MAKOTO A,KAZUYA S,HISAAKI N,et al. Enzymatic Synthesis of High-Molecular-MassPoly-γ-glutamate and regulation of its stereochemistry[J]. Applied and environmental microbiology,2004,7:4249-4255.[5] 张庆庆,金鑫强,陈剑翔,等. 发酵液中γ-聚谷氨酸含量快速测定方法研究[J]. 食品工业科技,2012,19:294-296.[6] ING-LUNG S,YI-TSONG V. The production of poly-(γ-glutamic acid)from microorganisms and its various applications[J]. Broresource technology,2001,79(3):207-225.[7] 朱凡,吕忠良,杨叶东,等. 高黏发酵液中γ-聚谷氨酸的分离纯化工艺[J]. 化学工程,2013,41(12):9-11.[8] EZZELL J W,WELKOS S L. The capsule of bacillus anthracis,a review[J]. J Appl Microbiol,1999,87(2):250.[9] 李德衡,赵兰坤,李树标. γ-聚谷氨酸的生物合成及应用研究进展[J]. 发酵科技通讯,2012,41(3):12-16.[10] 李江涛,郑涛. 介孔碳材料对亚甲基兰的吸附特性研究[J]. 西安文理学院学报(自然科学版),2010,13(1):48-53.[11] 肖敏,李丽,钟龙飞,等. 活性炭吸附法处理印染废水的研究[J]. 辽宁化工,2009,38(8):537-539.[12] 王静心,李政,张秋亚,等. 亚甲基蓝染液的γ-PGA水凝胶脱色处理[J]. 印染,2013,24:1-5.[13] MEHMET D,MAHIR A,AYDM T,et al. Kinetics and mechanism of removal of methylene blue by adsorption onto perlite[J]. Journal of hazardous materials,2004,109:141-148.。
一种检测新型生物高分子材料聚_谷氨酸的新方法
解 ,配成 200μg /m l的溶液 B。精密量取 A 溶液 2m l,加 PGA 粗品 。
入 B 溶液 2m l,充分震荡 ,室温放置 ,与波长 680nm 处 , 1. 3. 6 粗品的测定 精密称取 γ2PGA 粗品 5mg,用蒸
每隔 10m in测定吸收度 A680。 1. 3. 2 线 性 关 系 研 究 精 密 称 取 γ2PGA 标 准 品
馏水溶解并在 50m l的容量瓶中定容 ,摇匀 ,精密量取 2. 0m l,加入 200μg /m l的 CPC溶液 2. 0m l,在 680nm 处
25mg,置 100m l容量瓶中 ,用蒸馏水溶解并定容摇匀 , 精密量取该溶液 0, 0. 05, 0. 1, 0. 15, 0. 2, 0. 25, 0. 3 和
2. 2 方法的线性关系 CPC浓度在 12. 5 ～50μg /m l范围内 ,线性关系良 好 ,回归方程为 : y = 4. 416x20. 0059 (图 1) 。
图 1 比浊法测定 γ2PGA含量的标准曲线 F ig. 1 Cr iter ion curve of the concen tra tion ofγ2PGA
表 4 粗品的测定 Table 4 The determ ina tion ofγ2PGA in crudeγ2PGA
序号
粗品的质量 (mg) A 68 0. 465 2. 66
2 3. 87 0. 490 2. 87
3 3. 87 0. 479 2. 74
多聚 γ2谷氨酸 (γ2Poly ( glutam ic acid ) , γ2PGA ) 是一种特殊的带负电荷的多肽 (聚氨基酸 ) ,是由某些 杆菌 ( B acillus) 合成的一种细胞外水溶性高分子氨基 酸聚合物 ,是由 L 2谷氨酸 、D 2谷氨酸两种构型的单体通 过 γ2酰胺键聚合形成的 [1 ] 。γ2PGA 具有极佳的成膜 性 、成纤维性 ,阻氧性 、可塑性 、粘结性 、保湿性和可生 物降解等许多独特的理化和生物学特性 [2 , 3 ] 。因此 ,γ2 PGA 可以被广泛用于医药制造 ,食品加工 ,蔬菜 、水果 、 海产品防冻 、保鲜 ,化妆品工业 ,烟草 、皮革制造工业和 植物种子保护等许多领域 ,是一种有极大开发价值和 前景的多功能新型生物制品 [4～6 ]. 作为一种生物高分 子 ,其定量通常采用冻干后称重的方法 , 特别长的 γ2 PGA 可测定 SDS2PAGE电泳条带后的光密度确定浓度 后者使用凝胶渗透色谱和折射监测器 [7, 8 ] ,以上几种方 法对于 γ2PGA 的发酵生产来讲 ,冷冻干燥的方法 ,由于 杂质的存在 ,使得 γ2PGA 含量的测定无法精确 ;后两种 方法仪器设备要求较高 ,过程繁琐 ,目前尚无一种理想 的简单易行的 γ2PGA 含量的测定方法 。 由于 γ2PGA 在发酵液中以聚阴离子形式存在 ,带
《聚谷氨酸企标》
A.3.4.2 试样液的制备 称取约0.1g 试样（精确至0.0001g），加水20ml，搅拌1h后，转至100ml量瓶中，加水稀
释至刻度，摇匀。溶液离心10min（转速12000r/min），取上清液用0.45μm 的膜过滤器过滤。 A.3.4.3 测定
在A.3.3 参考色谱条件下，分别对标准溶液和试样液进行测定，记录主峰面积，根据公 式计算出试样中聚谷氨酸的含量。 A.3.5 结果计算
A.3.3 参考色谱条件
a) 色谱柱：Waters Ulttrahydrogel 1000或Waters Ultrahydrogel Linear（300mm×7.8mm）色
谱柱；或其他等效色谱柱。
b) 流动相：10mmol/L磷酸氢二钠和15nmol/L磷酸二氢钾混合缓冲液，用0.45μm 的膜过
冷却后，加入氢氧化钠溶液（6→25）调至弱酸性。取5ml加入茚三酮试液1ml，水浴加热5分
钟，溶液呈紫色。
A.3 聚谷氨酸含量的测定
A.3.1 试剂和材料
a) 聚谷氨酸对照品（自制，由聚谷氨酸进一步精制而成）。
b) 磷酸氢二钠。
c) 磷酸二氢钾。
A.3.2 仪器和设备
高效液相色谱仪：配紫外或阵列二极管检测器（检测波长为220nm）。
产品的标识应符合 GB/T 191-2008 包装储运图示标志的要求。 6.2 包装
产品的包装应采用国家批准的、并符合化妆品包装用卫生标准的材料，包装净含量偏差 应符合国家质量监督检验检疫总局第75号令。 6.3 运输
产品在运输过程中不得与有毒、有害及污染物质混合载运，避免雨淋日晒等。 6.4 贮存
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──国家质量监督检验机构或用户提出要求时。 5.5 判定规则
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聚谷氨酸测试方法
1.0 适用范围：本方法适用于聚谷氨酸半成品及成品的 HPLC 纯度分析(第4 段、第 5 段中，蓝字为食品级及化妆品级 PGA纯品粉末的样品制备方法;红字为 PGA发酵液的样品制备方法)
2.0 仪器与设备：
2.1 Pump：SHIMADZU LC-10AT
2.2 Autosampler：PERKIN ELMER series 200 autosampler
2.3 Col umn ：TOSOH TSK Guard column
TOSOH TSK-GEL G6000PWXL
TOSOH TSK-GEL G3000SW
2.4 Detector：PERKIN ELMER 785A UV/VIS Detector
3.0 试剂的制备
3.1 0.05M Na2HPO4(disodium hydrogenophosphate , MW. 141.96g/mol)
称取Na2HPO47.1g ，加入去离水800mL溶解，最后以去离水定容至1L 。
3.2 0.05M NaH2PO4•H2O (Sodium dihydrogenophosphate monohydrate, MW.137.99g/mol)
称取NaH2PO4•H2O 6.9g，加入去离水800mL 溶解，最后以去离水定容至1L。
3.3 磷酸缓冲溶液，pH7.0
将0.05M Na2HPO4与0.05M NaH2PO4•H2O 以约10：7 的比例混合，微调至pH7.0，以0.45μm滤膜过滤。
4.0 PGA样品前处理
4.1 称取PGA样品0.04-0.05g置入50mL烧杯中。
4.2 加入40mL的0.05M Na2HPO4溶液。
4.3 利用磁石搅拌使样品完全溶解。
4.4 移入50mL定量瓶，以0.05M Na2HPO4溶液定容至50mL。
4.5 以0.45μm滤膜过滤，装入样品瓶中。
4.6 将样品放入HPLC 分析。
5.0 发酵液样品前处理
5.1 称取发酵液2 g置入100mL 烧杯中，加入去离子水80mL，利用磁石搅拌均匀。
5.2 以1N H2SO4调整pH4.0。
5.3 移入100mL定量瓶，以去离子水定容至100mL。
5.4 取离心管秤取样品约80g（重量包含离心管、盖、标签、样品）。
5.5 利用高速离心机将菌体及杂质分离。
离心条件为：转速12,000rpm，时间10min，温度控制在4℃下。
5.6 离心后取上层液，以0.45μm滤膜过滤后，装入样品瓶中。
5.7 将样品放入HPLC 分析。
6.0 标准品配制
6.1 称取PGA标准品1g，加入0.05M Na2HPO4溶解，最后定
容至100mL，作为PGA标准稀释溶液，浓度为10000μg/mL。
6.2 取 5 只50mL 定量瓶，分别加入PGA标准稀释溶液(10000μg/mL) 1、2、3、4、5mL，以0.05M Na2HPO4定容至50mL，其各点浓度分别为200、400、600、800、1000μg/mL。
(分装储存于-20℃，使用时取出解冻，分析完后丢弃)
6.3 分别以0.45μm滤膜过滤，装入样品瓶中，待上机分析。
7.0 HPLC 分析条件
Column ：TOSOH TSK Guard column
TOSOH TSK-GEL G6000PWXL
TOSOH TSK-GEL G3000SW
Mobile phase ：磷酸缓衝溶液，pH7.0
Flow ：0.5mL/min
Detector ：UV220 nm
7.1标准品与样品分别以Autosampler取20μl注入HPLC作定性定量分析。
7.2 另作空白组，操作步骤同检液。
7.3 以波峰面积为纵座标，γ-PGA-H标准品的含量为横座标，绘制标准曲线，并建立线性回归方程式。
7.4 将样品的波峰面积数值，代入标准品线性回归方程式中，求得γ-PGA样品溶液的浓度，再带入计算公式，换算γ-PGA纯度。
8.0 计算
γ-PGA 样品溶液的浓度以回归方程计算y = ax + b
x ＝(y－b) / a
a：斜率
b：截距
y：样品的波峰面积
x：样品的浓度,μg/mL
γ-PGA的纯度(%) = ×100 =（C樣× D.F）/W ×100
C 样：样品的浓度(μg/mL)
D.F：样品的稀释倍数
W ：称取样品重量, μg
作为拌种剂使用一般稀释5-10倍拌种。