PCR技术及其应用
PCR技术原理及其应用
pcr技术原理及其应用
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目录
pcr技术原理 pcr技术的应用 pcr技术的优缺点 pcr技术的发展趋势 pcr技术的实际应用案例
01
pcr技术ห้องสมุดไป่ตู้理
pcr定义
Pcr（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是一种在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
03
除了用于目的基因的扩增，PCR技术还可以用于基因突变检测和基因分型等应用。通过比较正常人和患者基因序列的差异，PCR技术可以帮助科学家们发现与疾病相关的基因突变，为疾病的诊断和治疗提供依据。
案例一：pcr技术在基因克隆中的应用
案例二：pcr技术在疾病诊断中的应用
01
02
03
pcr技术在疾病诊断中发挥了重要作用，尤其是在感染性疾病和遗传性疾病的诊断中。通过检测病原体或特定基因序列的存在，PCR技术能够快速、准确地诊断疾病。
pcr技术的实际应用案例
01
基因克隆是生物技术领域的一项重要技术，它能够将特定的基因片段从复杂的基因组中分离出来。PCR技术在此过程中发挥了关键作用，通过高精度和高灵敏度的扩增，可以快速、准确地获取目标基因片段。
02
在基因克隆中，PCR技术主要用于目的基因的扩增和检测。通过设计特定的引物，PCR技术能够特异性地扩增目标基因片段，从而实现基因克隆的目的。
高温
90-95℃，变性，使双链DNA解旋。
pcr反应条件
02
pcr技术的应用
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准确地获取特定基因片段，为基因克隆提供关键的DNA片段，从而实现基因的体外复制和遗传操作。
克隆步骤
首先，设计特定的引物，以便从模板DNA中扩增出所需的基因片段；然后，将模板DNA、引物和PCR反应所需的其他成分混合，进行PCR扩增；最后，将扩增得到的基因片段进行克隆，以便进一步的研究和应用。
简述PCR技术的主要原理及应用
简述PCR技术的主要原理及应用1. PCR技术的主要原理聚合酶链式反应（PCR）是一种重要的分子生物学技术，其主要通过在一系列循环中扩增特定DNA片段，最终获得大量目标DNA的倍增产物。
PCR技术广泛应用于基因测序、基因克隆、突变分析、分子诊断等领域。
PCR技术的主要原理包括以下三个步骤：1.1 反应体系的准备PCR反应体系主要由以下组分组成： - DNA模板：即待扩增的目标DNA段，可以是从任何来源提取的DNA片段。
- 引物：由两个单链DNA片段构成，分别与目标DNA序列的两个相邻区域互补，作为DNA复制的起始点。
- DNA聚合酶：用于引导DNA的复制，具有高温稳定性。
- 反应缓冲液：提供适宜的酶活性和其他反应条件。
1.2 热循环反应PCR反应通过一系列的循环反应，完成DNA的扩增。
每个循环包括以下三个步骤：1.热变性（Denaturation）：将PCR反应管中的DNA双链变性为单链，提供引物结合的机会。
2.引物结合（Annealing）：反应体系通过降温，使引物与目标DNA互补的区域结合。
3.DNA扩增（Extension）：通过DNA聚合酶在适宜温度下复制DNA模板。
1.3 扩增产物的倍增反复进行热循环反应会连续复制目标DNA段，导致DNA的指数级扩增。
经过多个循环之后，扩增产物的数量将呈指数式增长。
2. PCR技术的应用PCR技术在生物学研究和医学诊断中得到广泛应用，主要包括以下几个方面：2.1 基因测序PCR技术在基因测序中起到关键作用。
通过扩增需要测序的DNA片段，可以获得足够的模板量，用于测序仪的读取。
2.2 基因克隆PCR技术可用于基因克隆，通过引物的设计，扩增目标DNA片段后，将其插入到表达载体中，实现目标基因的表达。
2.3 突变分析PCR技术可以用于突变分析，通过引物的设计，扩增包含突变位点的DNA片段，然后通过测序或其他分析方法确定突变的存在与否。
2.4 分子诊断PCR技术在分子诊断中广泛应用。
pcr技术在分子生物学中的应用
pcr技术在分子生物学中的应用PCR技术在分子生物学中的应用引言：PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，它可以快速、准确地扩增DNA片段。
PCR技术因其高效、灵敏和可靠的特点，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、基因工程、法医学等领域。
本文将深入探讨PCR技术在分子生物学中的应用。
一、基因检测PCR技术在基因检测中有着重要的应用。
通过PCR扩增特定基因片段，可以检测个体是否携带某种基因突变或遗传病。
例如，PCR技术可以用于检测乳腺癌相关基因BRCA1和BRCA2的突变，帮助判断个体是否具有遗传乳腺癌的风险。
此外，PCR技术还可以用于检测病原体的基因，例如新冠病毒的核酸检测就是基于PCR原理。
二、疾病诊断PCR技术在疾病诊断中具有重要的应用价值。
通过PCR扩增患者体液中特定病原体的DNA或RNA片段，可以快速准确地检测出病原体的存在，从而帮助医生进行疾病的诊断。
例如，PCR技术可以用于检测艾滋病病毒的存在，帮助医生判断患者是否感染了艾滋病。
此外，PCR技术还可以用于检测细菌感染，例如通过检测脑脊液中的细菌DNA片段来诊断脑膜炎。
三、基因工程PCR技术在基因工程领域有着广泛的应用。
通过PCR扩增目标基因片段，可以快速获得大量的目标DNA。
这样就可以进行基因克隆、基因插入等操作。
例如，PCR技术可以用于构建重组质粒，将目标基因插入到质粒中，从而实现基因的表达和研究。
此外，PCR技术还可以用于基因突变的引入，通过引入特定突变的PCR产物，可以实现特定基因的突变。
四、法医学PCR技术在法医学中有着重要的应用。
通过PCR扩增样本中特定基因片段的DNA，可以对犯罪现场的DNA进行检测和鉴定。
例如，在刑事案件中，通过PCR技术可以检测凶手遗留在现场的DNA，从而确定凶手的身份。
此外，PCR技术还可以用于亲子鉴定，通过比对父母和子女的DNA片段，确定亲子关系。
总结：PCR技术作为一种高效、灵敏和可靠的分子生物学技术，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、基因工程、法医学等领域。
pcr原理及应用
pcr原理及应用PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，通过这种技术可以在体外合成大量特定DNA序列。
PCR的原理基于DNA的复制过程，在PCR过程中，需要一对引物（primers），引物的序列与目标DNA序列的两个端点相匹配。
PCR反应可以分为三个步骤：变性、退火和延伸。
首先，将DNA样本与引物、DNA聚合酶和dNTPs（脱氧核苷三磷酸）一起放入反应管中。
接下来，反应管中的温度升高至94-98℃，使DNA变性，即使其双链解开。
然后，温度降低至50-60℃，使引物与DNA序列互补配对，称为引物的退火温度。
最后，温度升高至72℃，此时DNA聚合酶开始在退火的引物上进行延伸合成新的DNA链，形成双链DNA。
PCR技术在许多领域都有广泛的应用。
第一，PCR可以用于基因分型及基因突变的检测。
通过设计特定的引物，可以选择性地扩增目标基因，并通过检测PCR产物的大小和序列来确定基因型或突变情况。
其次，PCR可用于基因工程和克隆。
通过PCR技术，可以从DNA样本中扩增出特定的DNA片段，然后将其插入到质粒或其他表达载体中，实现特定基因的克隆和表达。
另外，PCR也可用于DNA测序。
在测序反应中，需要将目标DNA进行PCR扩增，然后将PCR产物纯化，再进行测序反应。
通过PCR扩增，可以在测序反应中获得足够的DNA量，以确保测序的准确性和可靠性。
此外，PCR技术还可以应用于病原体的检测。
通过PCR扩增特定的病原体标记基因，可以在短时间内检测到病原体的存在，从而为疾病的诊断和治疗提供帮助。
总结来说，PCR技术具有高度灵敏性、高效性和广泛的应用范围。
它在基础研究、医学诊断、基因工程等领域发挥了重要作用，并为科学研究和临床应用提供了强有力的工具。
pcr的原理和应用领域
PCR的原理和应用领域1. PCR的原理PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种在体外扩增DNA片段的技术。
它是由美国生物学家凯瑟琳·梅利斯（Kary B. Mullis）在1983年发明的，因其在分子生物学领域的重要应用而获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR的原理主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
1.1 变性（Denaturation）将待扩增的DNA样品加热至94-98℃，使双链DNA解开成两条单链DNA。
这一步是为了使DNA分子的双链结构完全解链，以便后续的退火步骤。
1.2 退火（Annealing）将待扩增的DNA样品降温至50-65℃，加入引物（寻找特定靶序列的DNA寡核苷酸链），使引物与单链DNA序列互补配对结合。
这一步是为了使引物与待扩增的DNA序列特异性地结合，以启动PCR反应。
1.3 延伸（Extension）将待扩增的DNA样品在72℃下加入DNA聚合酶（如Taq聚合酶），使DNA引物双链结构被DNA聚合酶复制成两条新的DNA双链。
这一步是为了合成新的DNA链，使扩增物数量呈指数倍增。
经过多个循环的变性、退火和延伸步骤，可以在短时间内扩增出大量特定目标序列的DNA片段。
2. PCR的应用领域PCR技术具有高效、灵敏、特异性强等优点，因此在许多领域得到了广泛应用。
2.1 分子生物学研究PCR技术在分子生物学研究中扮演着重要角色，广泛应用于：•基因克隆和表达研究：PCR可以扩增特定基因片段，用于克隆和构建重组DNA。
可以通过PCR检测基因在不同组织和细胞类型中的表达水平，研究基因的功能和调控机制。
•突变检测和基因诊断：PCR可以检测基因突变，用于遗传病的诊断和预测。
例如，PCR可以用于检测致病基因的特定突变，如BRCA1和BRCA2基因突变与乳腺癌的关联。
•DNA指纹和个体识别：PCR可以扩增DNA中的特定序列，用于DNA指纹分析和个体识别。
pcr的原理应用领域
PCR的原理应用领域1. 引言聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于生物医学研究、医学诊断、农业和环境科学等领域。
PCR能够在体外迅速扩增DNA序列，从而获得足够多的试样以进行进一步的分析和研究。
本文将重点介绍PCR的原理和其在不同应用领域的具体应用。
2. PCR的原理PCR是一种通过体外复制DNA的技术，其基本原理包括三个步骤：变性（denaturation）、退火（annealing）和延伸（extension）。
2.1 变性首先，将待扩增的DNA样品加热至高温，使其双链DNA分离为单链，即变性。
这一步骤通常在94-98摄氏度进行，以保证DNA的完全变性。
这样做是为了使得DNA的两个链分开，以便于后续的扩增。
2.2 退火在退火阶段，将体系中加入引物（primers），引物是长度为15-30个碱基的寡聚核苷酸。
引物在退火时与目标DNA序列上的互补序列结合，将DNA分子的两个链连接在一起。
引物的结合是朝向目标序列两侧延伸的。
2.3 延伸经过退火后，一个热稳定的DNA聚合酶（如Taq聚合酶）加入到体系中。
DNA聚合酶能够在适宜的温度下，沿着引物向3’端延伸，合成与模板DNA互补的新链。
该延伸过程称为扩增，它是通过循环多轮变性、退火和延伸步骤的方式进行的。
3. PCR的应用领域PCR的高效、快速、精确的扩增特性使其成为许多领域的重要工具。
以下是PCR在不同应用领域的具体应用：3.1 生物医学研究PCR广泛应用于生物医学研究中的多个方面，例如：•基因表达研究：通过扩增目标基因的cDNA，可以进一步研究目标基因的表达水平和调控机制；•突变检测：PCR可以快速检测基因中的突变，帮助研究人员了解突变基因与疾病之间的关系；•基因克隆：PCR可以扩增目标DNA序列，方便进行基因克隆和构建重组DNA；•DNA测序：PCR可以扩增DNA片段，为后续的DNA测序提供足够的模板。
几种pcr的原理及应用
几种PCR的原理及应用1. PCR简介PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种基于DNA聚合酶的体外扩增技术。
该技术可以在短时间内大量复制特定DNA序列，从而方便进行基因分析、疾病诊断、基因工程等研究和应用。
2. PCR基本原理PCR的基本原理是通过反复进行DNA的三步循环复制，每一步循环被称为一轮PCR循环。
每一轮PCR循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
2.1 变性变性步骤使得DNA双链解开，得到两条单链DNA。
这一步骤通常在高温下进行，通过断裂氢键使DNA双链解开。
2.2 退火退火步骤是将两个引物结合到目标DNA序列的两侧，使引物可以作为DNA复制的起始点。
引物的设计需要与目标DNA序列的两端互补，以确保特异性扩增。
2.3 延伸延伸步骤是通过DNA聚合酶酶活性，引物向目标DNA序列方向延伸合成新的DNA链。
这个过程是通过向反应体系中加入四种碱基（dNTPs）来完成的。
3. PCR的应用PCR技术被广泛运用于许多领域，特别是在分子生物学和医学研究中。
以下是几种PCR的应用：3.1 基因分型PCR可以用于基因的分型，例如确定某个基因是否存在突变。
通过引物的设计，PCR可以扩增出目标基因片段，进而通过测序等方法进行基因分型和分析。
3.2 疾病诊断PCR可以用于疾病的诊断，特别是对于遗传病的检测。
通过扩增疾病相关基因的片段，可以判断患者是否携带该疾病基因。
3.3 基因工程PCR在基因工程中也有广泛应用。
例如，通过PCR扩增目标基因，将其插入到表达载体中，构建重组蛋白表达系统。
3.4 环境微生物学PCR可以用于环境中微生物的检测和鉴定。
通过扩增微生物的特定DNA片段，可以确认环境样本中是否存在特定的微生物群体。
3.5 法医学和犯罪学PCR可以应用于法医学和犯罪学领域，例如通过对DNA样本进行PCR扩增，可以确定嫌疑人的DNA指纹，用于刑事案件的鉴定。
以上仅是PCR技术在多个领域中的一些典型应用，随着DNA技术的不断发展，PCR在更多领域中的应用也将不断扩大。
pcr技术原理及应用
pcr技术原理及应用PCR技术原理及应用。
PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种用于扩增DNA片段的重要方法，它在分子生物学领域具有广泛的应用。
PCR技术的原理非常简单，但其在科学研究、医学诊断、法医学和生物工程等领域的应用却十分广泛。
本文将介绍PCR技术的原理及其在不同领域的应用。
PCR技术的原理。
PCR技术主要涉及三个步骤，变性、退火和延伸。
首先，DNA双链在高温下变性，使其分离成两条单链。
然后，引物（primers）与目标DNA序列特异性结合，通过退火使引物与DNA序列结合。
最后，DNA聚合酶在适当的温度下延伸引物，合成新的DNA链。
这样，一轮PCR反应就完成了，产生了两个与原始DNA片段相同的DNA分子。
连续进行多轮PCR反应，可以迅速扩增目标DNA片段。
PCR技术的应用。
在科学研究领域，PCR技术被广泛用于克隆基因、检测基因突变、建立DNA指纹图谱等。
通过PCR技术，科学家们可以快速、准确地获取感兴趣的DNA片段，为基因功能研究和分子生物学研究提供了重要工具。
在医学诊断领域，PCR技术被用于检测病原体、诊断遗传疾病和肿瘤等。
例如，PCR技术可以快速检测出病毒、细菌和真菌等病原体，对传染病的快速诊断起到了重要作用。
此外，PCR技术还可以用于分子诊断，通过检测特定基因的突变来诊断遗传性疾病和肿瘤。
在法医学领域，PCR技术被广泛用于DNA鉴定。
通过PCR技术，可以从犯罪现场的血迹、唾液等样本中提取DNA，并进行扩增和分析。
这种DNA鉴定技术已成为破案的重要手段，对司法实践产生了深远的影响。
在生物工程领域，PCR技术被用于基因工程、转基因作物的检测等。
通过PCR技术，可以快速、准确地扩增目标基因，为基因克隆、基因工程等提供了重要的技术支持。
总结。
PCR技术作为一种快速、准确、高效的DNA扩增方法，已经成为分子生物学领域不可或缺的工具。
其在科学研究、医学诊断、法医学和生物工程等领域的应用，极大地推动了相关领域的发展。
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三,操作步骤 2.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 2.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 按照如下体积向PCR 并混匀: 并混匀:
10 X Buffer 10 X P1 10 X P2 25 L 10X T 10 X E 水 2.5 L 2.5 L 12.5 L 2.5 L 2.5 L 2.5 L
3.PCR扩增程序: 3.PCR扩增程序: 扩增程序 94℃
94 ℃ 55 ℃ 72℃ ℃ 72℃ ℃ 4℃ 5-10min(预变性) (预变性) 30S 30S 30S 5-10min(后延伸) (后延伸) 保温 30Cycles
屏幕显示方式
Main
运行已 有程序 已有程 序菜单 删除已 有程序
Enter
Control BLOCK
PCR1 Method Sim-Tube
BLOCK:屏幕显示样品 屏幕显示样品 台温度(样品台温控方式 样品台温控方式) 台温度 样品台温控方式 Sim-Tube:屏幕显示反应 屏幕显示反应 液温度(模拟管温控方式 模拟管温控方式) 液温度 模拟管温控方式
Enter
耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus) DNA聚合酶(thermus 酶 活 性 (%) (%)
100 80 60 40 20 温度(℃ 温度 ℃)
40 50 60 70 80 90 100 Saiki(1988)将耐热 ( 聚合酶引入PCR,使利用热变性解链 模板可行. )将耐热DNA聚合酶引入 聚合酶引入 ,使利用热变性解链DNA模板可行. 模板可行
Kary B. Mullis
体内DNA的复制体系
5' 3'
拓扑异构酶 解旋酶类 SSB
DNA聚合酶 DNA聚合酶(I 引物 dNTP Mg2+
II III) III)
Mullis的PCR构思 Mullis的PCR构思
引物
DNA聚合酶 DNA聚合酶
DNA聚合酶 DNA聚合酶
引物
特定DNA片段 特定DNA片段
(5) Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂.浓度为0.5-2.5mmol/L. Mg2+是DNA聚合酶的激活剂.浓度为0.5-2.5mmol/L. 聚合酶的激活剂 0.5 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失,PCR产量下降; Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失,PCR产量下降; 浓度过低会使Taq酶活性丧失 产量下降 Mg2+过高影响反应特异性. Mg2+过高影响反应特异性. 过高影响反应特异性 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP,EDTA等 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP,EDTA等 可与负离子结合 dNTP 的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度. 的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度. Mg2+浓度
循环内第一步温度和时间
Step #1 Option? No yes ? Step #2 55.0C Hold 0m40s Step #2 Option? No yes ? Step #3 72.0C Hold 0m30s
不需要拓展功能
循环内第二步温度和时间
不需要拓展功能
循环内第三步温度和时间
Step #3 Option? No yes ?
内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen)
SYBRSYBR-Green I
Excitation
SG
5' 3'
SG
Emission
Run List File
Enter Edit Lid
新建反 应程序 编辑已 有程序 热盖关 闭调节
Enter
Enter abcdefghi#
jklmnopqr# Name #stuvwxyz# In Use! .,-+/():=#
输入文件名,满 个字 输入文件名 满8个字 符自动生成程序名,不 符自动生成程序名 不 个字符时用#终止 满8个字符时用 终止 个字符时用
PCR1 Segment #1 Hold Cycle END
选择预变性保温
Enter
Hold Hold
PCR1 at 94C for 5m0s
预变性温度和时间
Enter
PCR1 Segment #2 Hold Cycle END
循环参数设置
3
step
PCR
循环内步骤数
Step #1 94.0C Hold 0m30s
生物化学实验技术
目
PCR的反应原理 PCR的反应原理
录
PCR的类型和应用 PCR的类型和应用 PCR示例 PCR示例
多聚酶链式反应
(PCR:Polymerase Chain Reaction) PCR:
PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种 是由美国科学家穆利斯提出的一种 是由美国科学家 体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA 体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA 快速扩增的方法,此技术获得1993年诺贝 快速扩增的方法,此技术获得1993年诺贝 尔化学奖.
A.阳性对照
B.阴性对照
C.原位检测mRNA表达
荧光定量 PCR(real-time PCR)分析基因表 PCR(realPCR)分析基因表 达水平
通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针, 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对 PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合 PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程, 产物进行标记跟踪 相应的软件可以对结果进行分析, 相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初 始模板量. 始模板量.
未知序列
已知序列
未知序列
限制酶 未知序列 已知序列 连接酶 未知序列
限制酶
梯度PCR仪 仪 梯度
实时荧光定量PCR仪 仪 实时荧光定量
普通PCR仪 仪 普通
二,实验材料,仪器和试剂 实验材料, 材料: 0.3Kb插入片段的克隆载体 1,材料:含0.3Kb插入片段的克隆载体 2,仪器:微量移液器及吸头,PCR仪及PCR管 仪器:微量移液器及吸头,PCR仪及PCR管 仪及PCR 琼脂糖凝胶电泳设备 3,试剂:10XPCR 反应缓冲液 试剂: 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1和引物2 10μ 引物1和引物2
PCR反应循环 反应循环
94℃
变性
55℃
退火
72℃
延伸
PCR循环 PCR循环
5' 3'
变性, 变性,退火
引物
延伸
3' 5'
变性,退火 变性,
延伸
变性,退火 变性,
延伸
PCR的指数扩增( PCR的指数扩增(2n) 的指数扩增
PCR反应体系 PCR反应体系
模板:DNA 模板: 引物: 引物:P1 +P2 DNA聚合酶:TaqE 聚合酶: 聚合酶 原料: 原料:dNTP 反应缓冲液10xBuffer 反应缓冲液 辅助因子:Mg2+ 辅助因子:
设置反应完后的保温温度 和时间
Segment #5 Hold Cycle END Enter PCR1 Estimated Run Time: : 1h53m05s Save? YES no ?
终止参数设置
预计反应时间,程序是否 预计反应时间, 保存
Lid
LID Turn off heated Lid below 9C
mRNA 逆转录酶 杂交双链
DNA聚合酶 DNA聚合酶 cDNA
PCR扩增 PCR扩增
原位PCR分析基因表达的组织特异性 原位PCR分析基因表达的组织特异性 PCR
细胞或组织固定: 1. 细胞或组织固定 : 细胞经固定和乙醇通透化处理 后便适于一般PCR试剂(包括引物和Taq PCR试剂 Taq酶 后便适于一般PCR试剂(包括引物和Taq酶)进入 PCR扩增细胞内目的片段 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检 4 + (A+T)x 2 ( ) )
(1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源 1)序列应位于高度保守区, 序列. (2)引物长度以15-40 bp为宜. )引物长度以15- bp为宜. (3)碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%. 碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%. (4)引物内部避免形成二级结构. (5)两引物间避免有互补序列. (6)引物3'端为关键碱基;5'端无严格限制. )引物3 端为关键碱基;5
2)循环参数 (1)变性 (1)变性 使双链DNA解链为单链 使双链DNA解链为单链 DNA 94℃ 30-60秒 94℃, 30-60秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定. 温度由引物长度和GC含量决定. GC含量决定 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合; 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降 低温度可增加反应的灵敏性. 低温度可增加反应的灵敏性.
Taq
P2
P1 Mg2+ dCTP dTTP dATP dGTP
PCR反应条件 1)PCR反应成分 PCR反应成分
(1)模板 双链DNA均可. DNA均可 单,双链DNA均可. 不能混有蛋白酶,核酸酶,DNA聚合酶抑制剂,DNA 不能混有蛋白酶,核酸酶,DNA聚合酶抑制剂, 聚合酶抑制剂 结合蛋白类. 结合蛋白类. DNA模板一般100ng /100 DNA模板一般100ng /100L. 模板一般 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加. 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加.